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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Bestimmung des Einflusses von Substanzen auf Inhaltsstoffe des Blutes zur Feststellung von infektiösen und immunologischen Vorgängen, durch Vermischen von Blutproben mit einer Natriumcitratlösung und einer eine Na triumchloridlösung enthaltenden Mischung, dadurch gekennzeichnet, dass man die mit der Natriumcitratlösung vermischten Blutproben mit a) einem Borsäure- und Natriumcitratlösung-Gemisch, b) einer Natriumchloridlösung sowie c) einer Lösung von irn Verhältnis von mindestens 1 : 102 verdünnten oder homöopatisch zubereiteten zu testenden Substanzen vermischt, aus der Mischung nach dem Ende der Reaktionen das Serum abtrennt und dann eine aus den Erythrozyten freigesetzte Substanz bestimmt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Bilirubingehalt des Serums bestimmt.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Natriumcitratlösung eine etwa 3,8 %-ige Natriumcitratlösung verwendet.
4. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Borsäurelösung eine etwa 3 %-ige Borsäurelösung verwendet.
5. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als verdünnte Natriumchloridlösung eine etwa 0,9%-ige Natriumchloridlösung verwendet.
6. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Borsäure- und Natriumcitratlö- sung-Gemisch ein solches, in welchem das Verhältnis der Borsäurelösung zur Natriumcitratlösung etwa 3 : 1 ist, verwendet.
7. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Mengenverhältnis der mit der Natriumcitratlösung vermischten Blutproben : Lösung a) : Lösung b) : Lösung c) zu etwa 1,0 : 2,5: 0,5: 0,5 wählt.
8. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Analyse des Serums durch Photometrieren durchführt.
9. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lösung von zu testenden Substanzen eine solche, in welcher diese im Verhältnis von etwa 1 : 1012 verdünnt sind, verwendet.
10. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu testende Substanzen solche, welche auf dem Wege chemisch-synthetischer Herstellung gewonnen worden sind, verwendet.
11. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu testende Substanzen solche tierischer, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft verwendet.
12. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als zu testende Substanzen Antigene passender bekannter Spezifität in einer isotonischen Salzlösung verwendet.
13. Mittel zur Ausführung des Verfahrens nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Mischung aus a) einem Borsäure- und Natriumcitratlösung-Gemisch, b) einer Natriumchloridlösung sowie c) einer Lösung von im Verhältnis von mindestens 1 : 102 verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanzen, ist.
14. Mittel nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Natriumcitratlösung eine etwa 3,8%-ige Natrium citratlösung ist.
15. Mittel nach Patentanspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Borsäurelösung eine etwa 3 %-ige Borsäurelösung eine etwa 3 %-ige Borsäurelösung ist.
16. Mittel nach den Patentansprüchen 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die verdünnte Natriumchloridlösung eine etwa 0,9 %-ige Natriumchloridlösung ist.
17. Mittel nach den Patentansprüchen 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Borsäure- und Natriumcitratlösung Gemisch ein solches, in welchem das Verhältnis der Borsäurelösung zur Natriumcitratlösung etwa 3 : 1 ist, ist.
18. Mittel nach den Patentansprüchen 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Mengenverhältnis der Lösung a) : Lösung b) : Lösung c) etwa 2,5: 0,5: 0,5 beträgt.
19. Mittel nach den Patentansprüchen 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung von zu testenden Substanzen eine solche, in welcher diese im Verhältnis von etwa 1:1012 verdünnt sind, ist.
20. Mittel nach den Patentansprüchen 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testenden Substanzen solche, welche auf dem Wege chemisch-synthetischer Herstellung gewonnen worden sind, sind.
21. Mittel nach den Patentansprüchen 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testenden Substanzen solche tierischer, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft sind.
22. Mittel nach den Patentansprüchen 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testenden Substanzen Antigene passender bekannter Spezifität in einer isotonischen Salzlösung sind.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäss dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, auf ein Mittel gemäss dem Oberbegriff des Patentanspruches 13. Als Test zur Bestimmung von immunologischen Vorgängen ist der Leukozytenresistenztest nach Schröder (vergleiche Folia Haematologica 94, 4, 1970, Akademische Verlagsgesellschaft Geest und Portig KG, Leipzig, 1970, Seiten 314 bis 325 [ Der Leukozyten-Resistenztest als In-vitro-Verfahren der Wirkungsbestimmung antilymphozytärer und antigranulozytärer Antikörper ] bekannt. Dieser hat aber den erheblichen Nachteil, dass die Leukozyten im Blutbild ausgezählt werden müssen und bestimmte morphologische Ver änderungen der Leukozyten zu beachten sind.
Dies ergibt selbst bei geübtem und gut geschultem Laboratoriumspersonal, wie es auf Grund einiger hundert Tests festgestellt wurde, instabile Ergebnisse.
Andere immunologische Tests beruhen auf dem Prinzip der Agglutination. Solche sind hauptsächlich der Coombs-Test und seine Varianten, bei welchen stets ein antigenhaltiges Serum mit dem Blut der zu testenden Person in Berührung gebracht wird.
Sämtliche Agglutinationstests sind nicht nur qualitativ. Es gibt auch Serumflockungstests, die einen Titer ergeben, das heisst auch quantitativ auswertbar sind. Der Prototyp ist die Gruber Widal'sche Reaktion. Dieser Test ist aber streng spezifisch auf bestimmte Antigen/Antikörper-Reaktionen eingestellt und kann nicht als Ausgangsbasis für andere Antigen/Antikörper Re aktionen verwendet werden.
Ein gemeinsamer erheblicher Nachteil aller bekannten Tests besteht darm, dass sie nur durch einen sogenannten Verdünnungstiter eine quantitative Aussage zulassen.
Ferner haben die bekannten Tests den Nachteil, dass ihre Anwendung auf bestimmte Fälle beschränkt ist. Beim Einsatz verschiedener bekannter serologischer Verfahren und bei der Bewertung der Ergebnisse ist nämlich zu beachten, dass die Antikörper zwar eine spezifische (das heisst durch bestimmte Strukturen des Antigens bedingte) Reaktionsfähigkeit mit dem Antigen besitzen, dass diese Reaktionsfähigkeit jedoch nicht durch jedes serologische Verfahren erfasst werden muss. So gibt es präzipitierende und nicht-präzipitierende Antikörper, komplementbindende und nicht-komplementbindende Antikörper sowie Antikörper, die nicht im Hochsalzmedium oder nur im Serummedium reagieren und letzten Endes sogar Antikörper (Reagine), die zwar eine positive Hautreaktion im Prausnitz
Küstner-Test herbeiführen, aber durch kein derzeit bekanntes serologisches Verfahren in vitro erfasst werden können. Es ist also klar, dass ein nicht-präzipitierender Antikörper durch die
Präzipitationsreaktion nicht erfasst werden kann, hingegen aber zum Beispiel durch die Komplementbindungsreaktion, wenn er eine komplementbindende Eigenschaft besitzt. Ein negativer
Befund bei Verwendung eines einzelnen serologischen Verfah rens muss daher noch nicht zwangsläufig bedeuten, dass kein
Antikörper vorhanden ist (Deutsch-Geyer: Laboratoriumsdia gnostik , Seite 622).
Bekannt ist ferner ein Hämolysetest, bei dem die osmotische
Resistenz der Erythrozyten (roten Blutkörperchen) bestimmt wird, vergleiche N. Henning, Klinische Laboratoriumsdiagno stik, 3. Auflage, 1966, Seite 193. Dieser Test erlaubt jedoch keine spezifischen Aussagen über immunologische Vorgänge.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses von Substanzen auf Inhaltsstoffe des Blutes zur Feststellung von infektiösen und immunologischen Vorgängen mittels eines immunologischen Hämolysetests zu schaffen, welcher hochspezifisch, genau, allgemein anwend bar und schon in sich quantitativ angelegt ist und einfach und mit geringem Aufwand durchgeführt werden kann und mit welchem eine sehr hohe Sicherheitsquote erreicht wird, sowie ein Mittel zu dessen Ausführung vorzusehen.
Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren gelöst.
Bei den Erythrozyten befinden sich Antigen/Antikörper Komplexe vorwiegend an der Oberfläche der älteren roten Blutzellen. Antigen/Antikörper-Komplexe verursachen intrazellulär eine Umbildung des Hämoglobins zur Bilirubin. Hierdurch werden die Zellmembranen vorgeschädigt.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass durch Borhämolyse nur die Fraktion der Erythrozyten, welche eine vorgeschädigte Zellmembran aufweisen, erfasst wird.
Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine durch immunologische Vorgänge hervorgerufene Vermehrung des intrazellulären Bilirubingehaltes der Erythrozyten eine Vermehrung des Bilirubingehaltes im Serum bei erfolgter Borhämolyse proportional der Menge der Antigen/Antikörper-Komplexe bewirkt.
Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens sind in den Patentansprüchen 2 bis 12 beschrieben.
Besonders bevorzugt ist die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens mittels Bestimmung des Bilirubingehaltes des Serums und unter Zugrundelegung desselben als Mass, weil dadurch in besonders einfacher Weise besonders hervorragend genaue und hochspezifische Ergebnisse erzielt werden, wobei dies die sicherste Verfahrensweise ist, indem nur das aus den alten Erythrozyten freigesetzte Bilirubin bestimmt wird. Ein weiterer besonderer Vorteil dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass die Bestimmung des Bilirubingehaltes den Anforderungen der Qualitätskontrolle einzigartig gut entspricht. Auch handelt es sich um eine routinemässig und allgemein gebräuchlich einsetzbare Bestimmung.
Die Tatsache, dass mittels der Bilirubinbestimmung erfindungsgemäss die besten Ergebnisse zu erzielen sind, ist besonders überraschend, da die physiologische Aufgabe der Erythrozyten, soweit sie bisher bekannt ist, durch ihren Hämoglobingehalt erfüllt wird.
Es ist aber auch möglich, alle anderen in den Erythrozyten enthaltenden Substanzen, wie das freigesetzte Hämoglobin, Eiweiss und Kalium, welche beim Borhämolysetest in das Prüfserum übertreten, zu bestimmen.
Für die Lösung c) können Verdünnungsstufen von sogar 1: 1030 und noch mehr der verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanzen und/oder Antigene passender bekannter Spezifität verwendet werden. Es können auch Mischungen verschiedener Verdünnungsstufen der verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanzen und/ oder Antigene passender bekannter Spezifität genommen wer den.
Beispiele für Substanzen, die auf dem Wege chemisch-syn thetischer Herstellung gewonnen worden sein oder tierischer, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft sein können, sind Arz neimittelzubereitungen aus Schwefelsäure, Flusssäure und Ka liumcarbonat, Arzneimittelzubereitungen aus Pflanzenextrak ten, wie Extrakten von Digitalis beziehungsweise Aloe sowie
Thuja, Gelsemium beziehungsweise Ignatia, Arzneimittelzube reitungen aus Extrakten aus Organismen von Tieren, wie Bie nen beziehungsweise Sepia (Tintenfisch), und Arzneimittelprä parate der sogenannten Suis-Reihe, bei welchen es sich um Zubereitungen von Organextrakten aus allen möglichen Schweine organen handelt ( homöopathische Frischzellentherapie ) sowie sogenannte homöopathisierte Allopathica, wie Aminophenazon oder Salicylsäure.
Durch Zugabe der Lösung c) werden biologisch ruhende Aktionspotentiale eines Wirkstoffes mittels Zugabe desselben
Wirkstoffes in der angegebenen Verdünnung aktiviert, was als Schärfungseffekt zu bezeichnen ist. Damit kann also das rich tige homöopathische Medikament (Similimum) objektiv festge stellt werden. Es ist ein bedeutender Vorteil der Erfindung, dass für die obigen Zwecke praktisch alle gelösten Substanzen, die nur hochzuverdünnen beziehungsweise zu homöopathisieren sind, herangezogen werden können. Durch Zugabe von hochverdünnten oder homöopathisierten Antigenen bekannter Spezifität entsteht bei passender Spezifität einer Blutprobe eine an dere (meistens höhere, manchmal niedrigere) Borhämolysequote als bei Proben mit nicht passender Spezifität.
Die Höhe der Borhämolysequote ist zudem direkt abhängig von der Menge der spezifisch geschärften Antigen/Antikörper-Komplexe auf der Zelloberfläche. Bei einem Reihentest mit verschiedenen in Frage kommenden Allergenen können sowohl qualitative als auch quantitative Aussagen über die Antigenität verschiedenster Substanzen bei einem Individium gemacht werden. Hiermit können hauptsächlich unterschwellige Antigene, die klinisch nicht durch allergische Symptome in Erscheinung treten, aber dennoch bereits im betreffenden Organismus pathogenetisch wirksam sind, erfasst werden.
In den meisten Fällen wird durch die Lösung c) [im Vergleich zur Vergleichslösung, wie physiologischen Kochsalzlösung, an deren Stelle] eine Erhöhung der Borhämolyse bewirkt.
In manchen Fällen tritt dagegen durch die Lösung c) eine Hemmung der Borhämolyse ein. In jedem Falle ist aber die Ände- rung (Erhöhung oder Hemmung) der Borhämolyse ein den zu testenden Substanzen beziehungsweise Antigen/Antikörper Komplexen zukommender spezifischer definitiver und reproduzierbarer Wert.
Das Hauptanwendungsgebiet der Erfindung ist also die spezifisch qualitative und quantitative Bestimmung von Antigen/ Antikörper-Komplexen. Auch die objektive Ermittlung des richtigen homöopathischen Medikamentes ist ein wichtiges Anwendungsgebiet derselben.
Erfindungsgemäss können sowohl Einzelsubstanzen beziehungsweise einzelne Antikörper, beispielsweise Vitamin Bl2, als auch eine Gruppe von Antikörpern bestimmt werden. Bei der Mischung verschiedener antigenwirksamer Substanzen muss man sich vorstellen, dass jede einzelne Substanz ihre Antigenität entfaltet und dass das biologische Ergebnis (nach der Erfindung Borhämolyseänderung) die Folge der Summe der verschiedenen Antigene und ihrer Relationen zueinander ist. Dies bedingt wiederum eine Summe von verschiedenen Antikörpern, die ebenfalls wieder eine bestimmte Relation zueinander besitzen. Summe und Relation der in das Immunsystem eingeführten Antigen/Antikörper-Komplexe von Antigenmischungen mit den dazugehörigen Komplementreaktionen erzeugen im Borhämolysetest einen bestimmten definitiven und reproduzierbaren Wert.
Es ist also festzustellen, dass mit dem Borhämolysetest sowohl Einzelantigene beziehungsweise -antikörper als auch eine in bestimmter Zusammensetzung (zum Beispiel im Pflanzenblatt) natürlich vorkommende Gruppe von Antigenen beziehungsweise Antikörpern nachgewiesen werden kann.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können also Substanzen, die in hoher Verdünnung vorliegen und sich einer sonstigen chemischen quantitativen Analyse entziehen, nachgewiesen werden, in welchem Zusammenhang als Beispiel Calciumgluconat genannt sei. Es können alle beliebigen dem Bereich der klinischen Immunologie angehörenden Krankheiten diagnostiziert werden, wie sie beispielsweise im Buch von K.O.
Vorlaender, Praxis der Immunologie, Thieme Verlag, Stuttgart, 1976 katalogisiert sind. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann auch das sogenannte homöopathische Similimum objektiv ermittelt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist also hochspezifisch zur Bestimmung eines bestimmten Antigens oder Antikörpers oder einer in bestimmter Zusammensetzung natürlich vorkommenden Gruppe von solchen und die praktische Bedeutung desselben ist, alle dem Bereich der klinischen Immunologie angehörenden Krankheiten diagnostizieren zu können, wobei es so empfindlich ist, dass durch dieses Verfahren auch schwache Antigene, auf welche andere Verfahren nicht ansprechen, erfasst werden können.
Zweckmässigerweise wird die Abtrennung des Serums durch Zentrifugieren durchgeführt, wobei es als Überstand erhalten wird.
Es ist bevorzugt, die Analyse des Serums durch Photometrieren durchzuführen. So kann insbesondere sein Bilirubingehalt, aber auch sein Hämoglobingehalt bestimmt werden. Es sei auch bemerkt, dass nicht nur positive, sondern auch negative Photometerausschläge (im Falle einer Hemmung der Borhämolyse) auftreten können. Im letzteren Fall kann so verfahren werden, dass für die Probe, welche die Lösung c) enthält, der Wert gleich Null gesetzt und die Probe, welche statt der Lösung c) eine physiologische Kochsalzlösung enthält, gegen die erstere Probe gemessen und so der negativen Photometerausschlag als positiver Wert festgehalten wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mittel für Blutuntersuchungen, das sich zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens besonders eignet. Dieses Mittel ist im Patentanspruch 13 und bevorzugte Ausführungsformen desselben sind in den Patentansprüchen 14 bis 22 beschrieben.
In den vorliegenden Unterlagen handelt es sich bei den Prozentangaben stets um Gewichtsprozente in Volumkonzentration ausgedrückt.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel I
Es erfolgte eine Blutentnahme wie üblich durch Aufsaugen von Venenblut in 2 10 cm3 Einmalspritzen, die je 3,0 cm3 einer 3,8 %-igen Natriumcitratlösung enthielten. Die so gewonnene im folgenden mit Citratblut bezeichnete Mischung wurde in einem grossen Reagenzglas durchgemischt.
Dann wurden in einem Röhrchen-Reihentest, in welchem die Röhrchen fortlaufend numeriert waren, je Röhrchen a) 2,5 cm3 einer Lösung, bestehend aus 3 Gew.-Teilen 3 %-iger Borsäure und 1 Gew.Teil einer 3,8%-igen Natriumcitratlösung, b) 0,5 cm3 einer 0,9 %-igen Natriumchloridlösung, c) 0,5 cm3 einer Lösung einer im Verhältnis von 1 : 1012 verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanz, die auf dem Wege chemisch-synthetischer Herstellung gewonnen worden sein oder tierischer, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft sein konnte, beziehungsweise eines Antigenes passender bekannter Spezifität in einer isotonischen Salzlösung und d) 1,0 cm3 Citratblut pipettiert. Alle Röhrchen wurden gut durchgeschüttelt und 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Dann wurden alle Röhrchen genau 10 Minuten mit 3 000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert und der Überstand wurde sorgfältig in je 1 mit der gleichen Nummer versehenes frisches Röhrchen umgegossen.
Anschliessend wurde im so gewonnenen Überstand der Bilirubingehalt nach einer der gebräuchlichen Verfahrensweisen, beispielsweise mit Hilfe des Lange-Photometers oder Eppendorf-Photometers [L. Jendrassik und P. Grof, Biochem. Z. 297 (1938), Seite 81; L. Jendrassik und R. Cleghorn, Biochem. Z.
289 (1937), Seite 1; G. Schellong und U. Wende, Arch. Kinderheilk. 162(1960), Seite 126; G. Schellong und U. Wende, Klin.
Wschr. 38 (1960), Seite 703; R. Richterich, Klinische Chemie, Akademische Verlagsgesellschaft Frankfurt a.M. (1968), Seite 412] bestimmt. Die so erhaltenen Werte wurden in eine vorgedruckte Skala eingetragen.
Beispiel2
Beispiel 1 wurde mit dem Unterschied wiederholt, dass im gewonnenen Zentrifugierüberstand der freigesetzte Hämoglobingehalt statt des Bilirubingehaltes photometrisch bestimmt wurde.
Beispiel 3
Es wurde eine Lösung von 0,5 g Calciumgluconat und 0,875 g Calciumlactobionat in 10 cm3 Lösungsmittel, im folgenden kurz als Calciumgluconatlösung bezeichnet, verwendet.
5 Tropfen der obigen konzentrierten Calciumgluconatlösung wurden zu 5 cm3 eines von einem beliebigen Probanden stammenden Citratblutes, welches wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden ist, zugegeben, welches dann 45 Minuten bei 37 "C bebrütet wurde.
Von der obigen Calciumgluconatlösung wurde eine hohe Verdünnung wie folgt hergestellt: 0,1 cm3 der Calciumgluconatlösung wurde in 9,9 cm3 physiologischer Kochsalzlösung gelöst und diese Lösung wurde in einem Reagenzglas 80-mal in vertikaler Richtung geschüttelt. Der so erhaltenen Lösung, die als Lösung C1 bezeichnet wird, wurden 0,1 cm3 entnommen und diese wieder mit 9,9 cm3 physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und 80-mal geschüttelt. Die so erhaltene Lösung wird als Lösung C2 bezeichnet. In dieser Weise wurde fraktioniert verdünnend weiter vorgegangen, bis eine Verdünnung von 1: 1012 der Calciumgluconatlösung, die als Lösung C6 bezeichnet wird, erhalten wurde.
Dann wurde der im Beispiel 1 beschriebene Borhämolysetest mit dem Unterschied durchgeführt, dass er doppelt angesetzt wurde. Eine erste Probe wurde in der Weise bereitet, dass das wie vorstehend beschrieben hergestellte mit der konzentrierten Calciumgluconatlösung versetzte Citratblut wie im Beispiel 1 beschrieben verarbeitet wurde, wobei als Lösung c) 0,5 cm3 der wie vorstehend beschrieben bereiteten hochverdünnten Calciumgluconatlösung (Lösung C6) verwendet wurde. Eine zweite Probe wurde mit dem Unterschied bereitet, dass die Zugabe der hochverdünnten Calciumgluconatlösung fortfiel, also ausser der Lösung, bestehend aus Borsäure und Natriumcitratlösung, nur eine 0,9 %-ige Natriumchloridlösung (physiologische Kochsalzlösung) verwendet wurde.
Die Feststellung des Bilirubingehaltes beider Lösungen erfolgte relativ, das heisst der Bilirubingehalt der Probe, die nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, wurde mit dem der Probe, welche auch die hochverdünnte Calciumgluconatlösung (Lösung C6) enthielt, in Beziehung gesetzt:
Von jeder Probe wurde 1 cm3 des gewonnenen Überstandes mit 0,25 cm3 einer Sulfanilsäurelösung in einer Konzentration von 29 Millimol/l und 0,5 cm3 einer Diazolösung, die vorher so zubereitet worden ist, dass zu 3 cm3 physiologischer Kochsalzlösung 3 Tropfen Diazoreagens (Natriumnitritlösung mit einer Konzentration von 25 Millimol Natriumnitrit/l) zugegeben worden sind, versetzt. Zu beiden so erhaltenen Lösungen wurden noch jeweils 0,5 cm3 physiologische Kochsalzlösung zugegeben.
Am Messwert wurde eine signifikante Steigerung der Borhämolyse bei der Probe, welche die hochverdünnte Calciumgluconatlösung enthielt, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, festgestellt.
Beispiel 4
Es wurde eine handelsübliche Urtinktur, das heisst ein konzentrierter alkoholischer Auszug, einer Substanz tierischer Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Apis mel. (Honigbiene), verwendet.
2 Tropfen der obigen Urtinktur wurden zu 5 cm3 physiologischer Kochsalzlösung zugegeben. Um den Alkohol, der später in Verbindung mit dem Blut das Ergebnis gestört hätte, auszutreiben, wurde die so zubereitete physiologische Kochsalzlösung 1-mal kurz aufgekocht und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur offen stehengelassen.
Ein etwa entstandener Bodenbelag wurde von der Lösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren getrennt. Die nunmehr klare, wenn auch, je nach Substanz, etwaig gefärbte Lösung stellte das Analog zu der im Beispiel 3 verwendeten konzentrierten Lösung (von Calciumgluconat) dar und es wurden von ihr in diesem Beispiel 5 Tropfen an Stelle der 5 Tropfen der letzteren verwendet. Im übrigen wurde analog wie im Beispiel 3 beschrieben vorgegangen. Bei diesem Vorgehen wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz tierischer Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Messwertänderungen festgestellt.
Beispiel 5
Beispiel 4 wurde mit dem Unterschied wiederholt, dass eine handelsübliche Urtinktur, das heisst ein konzentrierter alkoholischer Auszug, einer Substanz pflanzlicher Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Thuja (Lebensbaum), verwendet wurde.
Es wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz pflanzlicher Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Messwertänderungen festgestellt.
Beispiel 6
Beispiel 4 wurde mit dem Unterschied wiederholt, dass eine handelsübliche Urtinktur, das heisst eine alkoholisch-wässrige Lösung, einer Substanz mineralischer Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Silicea (Kieselsäure) verwendet wurde.
Es wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz mineralischer Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Messwertänderungen festgestellt.
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PATENT CLAIMS
1. A method for determining the influence of substances on blood components to determine infectious and immunological processes, by mixing blood samples with a sodium citrate solution and a mixture containing a sodium chloride solution, characterized in that the blood samples mixed with the sodium citrate solution are mixed with a) a mixture of boric acid and sodium citrate solution, b) a sodium chloride solution and c) a solution of at least 1: 102 diluted or homeopathically prepared substances to be tested, the serum is separated from the mixture after the end of the reactions and then one of the Erythrocyte released substance determined.
2. The method according to claim 1, characterized in that one determines the bilirubin content of the serum.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that an approximately 3.8% sodium citrate solution is used as the sodium citrate solution.
4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that an approximately 3% boric acid solution is used as the boric acid solution.
5. The method according to claims 1 to 4, characterized in that an approximately 0.9% sodium chloride solution is used as the dilute sodium chloride solution.
6. The method according to claims 1 to 5, characterized in that one uses as the boric acid and sodium citrate solution mixture in which the ratio of the boric acid solution to the sodium citrate solution is about 3: 1.
7. The method according to claims 1 to 6, characterized in that the quantitative ratio of the blood samples mixed with the sodium citrate solution: solution a): solution b): solution c) to about 1.0: 2.5: 0.5: 0 , 5 chooses.
8. The method according to claims 1 to 7, characterized in that one carries out the analysis of the serum by photometry.
9. The method according to claims 1 to 8, characterized in that one uses as the solution of substances to be tested, in which these are diluted in a ratio of about 1: 1012.
10. The method according to claims 1 to 9, characterized in that the substances to be tested are those which have been obtained by chemical-synthetic production.
11. The method according to claims 1 to 10, characterized in that such substances of animal, vegetable or mineral origin are used as the substances to be tested.
12. The method according to claims 1 to 11, characterized in that antigens of suitable known specificity in an isotonic saline solution are used as the substances to be tested.
13. Means for performing the method according to claim 1, characterized in that it is a mixture of a) a boric acid and sodium citrate solution mixture, b) a sodium chloride solution and c) a solution of at least 1: 102 diluted or homeopathically prepared substances to be tested is.
14. Composition according to claim 13, characterized in that the sodium citrate solution is an approximately 3.8% sodium citrate solution.
15. Composition according to claim 13 or 14, characterized in that the boric acid solution is an approximately 3% boric acid solution is an approximately 3% boric acid solution.
16. Composition according to claims 13 to 15, characterized in that the dilute sodium chloride solution is an approximately 0.9% sodium chloride solution.
17. Composition according to claims 13 to 16, characterized in that the boric acid and sodium citrate solution mixture is one in which the ratio of the boric acid solution to the sodium citrate solution is approximately 3: 1.
18. Composition according to claims 13 to 17, characterized in that the quantitative ratio of solution a): solution b): solution c) is about 2.5: 0.5: 0.5.
19. Composition according to claims 13 to 18, characterized in that the solution of substances to be tested is one in which they are diluted in a ratio of about 1: 1012.
20. Agent according to claims 13 to 19, characterized in that the substances to be tested are those which have been obtained by chemical-synthetic production.
21. Agent according to claims 13 to 19, characterized in that the substances to be tested are those of animal, vegetable or mineral origin.
22. Agent according to claims 13 to 21, characterized in that the substances to be tested are antigens of suitable known specificity in an isotonic saline solution.
The invention relates to a method according to the preamble of claim 1, to an agent according to the preamble of claim 13. The leukocyte resistance test according to Schröder (compare Folia Haematologica 94, 4, 1970, Akademische Verlagsgesellschaft Geest and.) Is a test for determining immunological processes Portig KG, Leipzig, 1970, pages 314 to 325 [The leukocyte resistance test is known as an in vitro method of determining the effectiveness of antilymphocytic and antigranulocytic antibodies], but this has the considerable disadvantage that the leukocytes must be counted in the blood picture and certain morphological ver Changes in the leukocytes must be observed.
This gives unstable results even with skilled and well-trained laboratory personnel, as has been determined from a few hundred tests.
Other immunological tests are based on the principle of agglutination. These are mainly the Coombs test and its variants, in which an antigen-containing serum is always brought into contact with the blood of the person to be tested.
All agglutination tests are not just qualitative. There are also serum flocculation tests that give a titer, which means that they can also be evaluated quantitatively. The prototype is the Gruber Widal's reaction. However, this test is strictly specific to certain antigen / antibody reactions and cannot be used as a basis for other antigen / antibody reactions.
A common significant disadvantage of all known tests is that they only allow a quantitative statement by means of a so-called dilution titer.
Furthermore, the known tests have the disadvantage that their use is limited to certain cases. When using various known serological methods and when evaluating the results, it should be noted that the antibodies have a specific reactivity with the antigen (that is to say due to certain structures of the antigen), but that this reactivity is not determined by every serological method got to. There are precipitating and non-precipitating antibodies, complement-binding and non-complement-binding antibodies, as well as antibodies that do not react in the high salt medium or only in the serum medium, and in the end even antibodies (reagents), which indeed have a positive skin reaction in the Prausnitz
Cause Küstner test, but cannot be recorded in vitro by any currently known serological method. So it is clear that a non-precipitating antibody by the
Precipitation reaction can not be detected, however, however, for example by the complement fixation reaction if it has a complement-binding property. A negative one
Findings when using a single serological procedure therefore need not necessarily mean that none
Antibody is present (Deutsch-Geyer: Laboratory Diagnostics, page 622).
Also known is a hemolysis test in which the osmotic
Resistance of the erythrocytes (red blood cells) is determined, see N. Henning, Klinische Laboratoriumsdiagno stik, 3rd edition, 1966, page 193. However, this test does not allow any specific statements about immunological processes.
The invention has for its object to provide a method for determining the influence of substances on blood components to determine infectious and immunological processes by means of an immunological hemolysis test, which is highly specific, accurate, generally applicable and already quantitative and simple in itself and can be carried out with little effort and with which a very high security rate is achieved, as well as providing a means of carrying it out.
This object is achieved by the method described in claim 1.
With erythrocytes, antigen / antibody complexes are predominantly on the surface of the older red blood cells. Antigen / antibody complexes intracellularly transform the hemoglobin into bilirubin. This pre-damages the cell membranes.
It has now surprisingly been found that only the fraction of the erythrocytes which have a previously damaged cell membrane is detected by boron hemolysis.
It was also surprisingly found that an increase in the intracellular bilirubin content of the erythrocytes caused by immunological processes causes an increase in the bilirubin content in the serum when boron hemolysis is carried out, proportional to the amount of the antigen / antibody complexes.
Preferred embodiments of the method according to the invention are described in claims 2 to 12.
It is particularly preferred to carry out the method according to the invention by determining the bilirubin content of the serum and on the basis of the same as a measure, because this enables particularly precise and highly specific results to be achieved in a particularly simple manner, this being the safest procedure by only using the old erythrocytes released bilirubin is determined. Another particular advantage of this embodiment of the method according to the invention is that the determination of the bilirubin content uniquely meets the requirements of quality control. It is also a routine and commonly used determination.
The fact that the best results can be achieved according to the invention by means of the bilirubin determination is particularly surprising since the physiological task of the erythrocytes, as far as is known to date, is fulfilled by their hemoglobin content.
However, it is also possible to determine all other substances contained in the erythrocytes, such as the released hemoglobin, protein and potassium, which pass into the test serum in the boron hemolysis test.
Dilution levels of even 1: 1030 and even more of the diluted or homeopathically prepared substances to be tested and / or antigens of suitable known specificity can be used for solution c). Mixtures of different dilution levels of the diluted or homeopathically prepared substances to be tested and / or antigens of suitable known specificity can also be taken.
Examples of substances which have been obtained by chemical-synthetic production or which can be of animal, vegetable or mineral origin are pharmaceutical preparations from sulfuric acid, hydrofluoric acid and potassium carbonate, pharmaceutical preparations from plant extracts, such as extracts from digitalis or aloe, and
Thuja, Gelsemium or Ignatia, medicinal preparations from extracts from animal organisms, such as bees or sepia (squid), and medicinal products from the so-called Suis series, which are preparations of organ extracts from all possible pig organs (homeopathic fresh cell therapy ) and so-called homeopathic allopathics, such as aminophenazone or salicylic acid.
By adding the solution c), biologically dormant action potentials of an active ingredient are added by adding the same
Active ingredient activated in the specified dilution, which can be described as a sharpening effect. This means that the correct homeopathic medication (Similimum) can be determined objectively. It is a significant advantage of the invention that practically all dissolved substances which can only be highly diluted or are homeopathized can be used for the above purposes. The addition of highly diluted or homeopathized antigens of known specificity results in a different (mostly higher, sometimes lower) boron haemoly sequence if the specificity of a blood sample is the same as that of samples with an unsuitable specificity.
The level of the boron hemolyzote is also directly dependent on the amount of specifically sharpened antigen / antibody complexes on the cell surface. In a series test with various allergens in question, both qualitative and quantitative statements about the antigenicity of various substances in an individual can be made. This can mainly be used to detect subliminal antigens that do not appear clinically due to allergic symptoms, but are nevertheless pathogenetically active in the organism in question.
In most cases, solution c) [compared to the comparison solution, such as physiological saline, in its place] causes an increase in boron hemolysis.
In some cases, however, solution c) inhibits boron hemolysis. In any case, however, the change (increase or inhibition) in boron hemolysis is a specific definite and reproducible value attributable to the substances to be tested or antigen / antibody complexes.
The main area of application of the invention is therefore the specific qualitative and quantitative determination of antigen / antibody complexes. The objective determination of the right homeopathic medication is also an important area of application of the same.
According to the invention, both individual substances or individual antibodies, for example vitamin B1, and a group of antibodies can be determined. When mixing different antigen-active substances, one has to imagine that each individual substance develops its antigenicity and that the biological result (according to the invention boron hemolysis change) is the result of the sum of the different antigens and their relationships to one another. This in turn requires a sum of different antibodies, which again have a certain relationship to one another. The sum and relation of the antigen / antibody complexes of antigen mixtures introduced into the immune system with the associated complement reactions produce a definite and reproducible value in the boron hemolysis test.
It should therefore be noted that the boron hemolysis test can be used to detect both individual antigens or antibodies and a group of antigens or antibodies naturally occurring in a specific composition (for example in the plant leaf).
According to the method according to the invention, substances which are present in a high dilution and which are beyond other chemical quantitative analysis can be detected, in which context calcium gluconate is mentioned as an example. Any diseases belonging to the field of clinical immunology can be diagnosed, as described, for example, in the book by K.O.
Vorlaender, Praxis der Immunologie, Thieme Verlag, Stuttgart, 1976 are cataloged. With the method according to the invention, the so-called homeopathic similimum can also be determined objectively.
The method according to the invention is therefore highly specific for the determination of a specific antigen or antibody or a group of such naturally occurring in a specific composition and the practical importance of the same is to be able to diagnose all diseases belonging to the field of clinical immunology, it being so sensitive that This method can also detect weak antigens to which other methods do not respond.
The serum is expediently separated by centrifugation, with it being obtained as a supernatant.
It is preferred to analyze the serum by photometry. In particular, its bilirubin content, but also its hemoglobin content, can be determined. It should also be noted that not only positive, but also negative photometer rashes (in the case of inhibition of boron hemolysis) can occur. In the latter case, the procedure can be such that the value for the sample which contains the solution c) is set to zero and the sample which contains a physiological saline solution instead of the solution c) is measured against the former sample and thus the negative photometer deflection is recorded as a positive value.
The invention also relates to an agent for blood tests which is particularly suitable for carrying out the method according to the invention. This means is in claim 13 and preferred embodiments thereof are described in claims 14 to 22.
In the documents at hand, the percentages are always percentages by weight in volume concentration.
The invention is illustrated by the following examples.
Example I
Blood was drawn as usual by drawing venous blood into 2 10 cm3 disposable syringes, each containing 3.0 cm3 of a 3.8% sodium citrate solution. The resulting mixture, referred to below as citrated blood, was mixed in a large test tube.
Then in a tube series test in which the tubes were numbered consecutively, each tube a) 2.5 cm3 of a solution consisting of 3 parts by weight of 3% boric acid and 1 part by weight of a 3.8% Sodium citrate solution, b) 0.5 cm3 of a 0.9% sodium chloride solution, c) 0.5 cm3 of a solution of a substance to be tested diluted in a ratio of 1: 1012 or homeopathically prepared, which is obtained by chemical-synthetic production could have been of animal, vegetable or mineral origin, or an antigen of suitable known specificity in an isotonic saline solution and d) pipetted 1.0 cm3 of citrate blood. All tubes were shaken well and left to stand at room temperature for 20 minutes.
Then all tubes were centrifuged for exactly 10 minutes at 3000 revolutions / minute and the supernatant was carefully poured into 1 fresh tube with the same number.
The bilirubin content in the supernatant obtained in this way was then determined using one of the customary methods, for example with the aid of the Lange photometer or Eppendorf photometer [L. Jendrassik and P. Grof, Biochem. Z. 297 (1938), page 81; L. Jendrassik and R. Cleghorn, Biochem. Z.
289 (1937), page 1; G. Schellong and U. Wende, Arch. Kinderheilk. 162 (1960), page 126; G. Schellong and U. Wende, Klin.
Wschr. 38 (1960), page 703; R. Richterich, Clinical Chemistry, Akademische Verlagsgesellschaft Frankfurt a.M. (1968), page 412]. The values thus obtained were entered on a pre-printed scale.
Example2
Example 1 was repeated with the difference that in the centrifuging supernatant obtained the released hemoglobin content was determined photometrically instead of the bilirubin content.
Example 3
A solution of 0.5 g of calcium gluconate and 0.875 g of calcium lactobionate in 10 cm 3 of solvent, hereinafter referred to as calcium gluconate solution, was used.
5 drops of the above concentrated calcium gluconate solution were added to 5 cm 3 of citrate blood from any test subject, which was prepared as described in Example 1, which was then incubated at 37 ° C. for 45 minutes.
A high dilution of the above calcium gluconate solution was made as follows: 0.1 cm3 of the calcium gluconate solution was dissolved in 9.9 cm3 of physiological saline and this solution was shaken in a test tube 80 times in the vertical direction. 0.1 cm3 was removed from the solution thus obtained, which is referred to as solution C1, and this was again diluted with 9.9 cm3 of physiological saline and shaken 80 times. The solution thus obtained is referred to as solution C2. This was followed by fractional dilution until a 1: 1012 dilution of the calcium gluconate solution, referred to as solution C6, was obtained.
The boron hemolysis test described in Example 1 was then carried out with the difference that it was set up twice. A first sample was prepared in such a way that the citrated blood spiked with the concentrated calcium gluconate solution prepared as described above was processed as described in Example 1, 0.5 cc of the highly diluted calcium gluconate solution (solution C6) prepared as described above being used has been. A second sample was prepared with the difference that the addition of the highly diluted calcium gluconate solution was discontinued, i.e. apart from the solution consisting of boric acid and sodium citrate solution, only a 0.9% sodium chloride solution (physiological saline solution) was used.
The bilirubin content of both solutions was determined relatively, i.e. the bilirubin content of the sample, which only contained the physiological saline solution, was compared with that of the sample, which also contained the highly diluted calcium gluconate solution (solution C6):
1 cm3 of the supernatant obtained from each sample was mixed with 0.25 cm3 of a sulfanilic acid solution in a concentration of 29 millimoles / l and 0.5 cm3 of a diazo solution, which had previously been prepared in such a way that 3 drops of diazo reagent (sodium nitrite solution with a concentration of 25 millimoles of sodium nitrite / l) were added. 0.5 cm3 of physiological saline solution was added to each of the solutions thus obtained.
The measured value showed a significant increase in boron hemolysis in the sample which contained the highly diluted calcium gluconate solution compared to the sample which contained only the physiological saline solution.
Example 4
It became a commercially available mother tincture, i.e. a concentrated alcoholic extract, a substance of animal origin, for example a mother tincture from Apis mel. (Honeybee).
2 drops of the above mother tincture were added to 5 cm3 of physiological saline. In order to drive out the alcohol that would later have disrupted the result in connection with the blood, the physiological saline solution prepared in this way was boiled once briefly and then left open for 24 hours at room temperature.
Any floor covering formed was separated from the solution by filtration or centrifugation. The now clear, albeit, depending on the substance, possibly colored solution was analogous to the concentrated solution (of calcium gluconate) used in Example 3 and 5 drops were used instead of the 5 drops of the latter in this example. Otherwise, the procedure was analogous to that described in Example 3. In this procedure, analogous to example 3, significant changes in measured values were found on the photometer in the samples which contained a mother tincture of a substance of animal origin compared to the sample which only contained the physiological saline solution.
Example 5
Example 4 was repeated with the difference that a commercially available mother tincture, that is to say a concentrated alcoholic extract, of a substance of plant origin, for example a mother tincture of Thuja (tree of life), was used.
Analogous to example 3, significant changes in the measured values were found in the samples which contained a mother tincture of a substance of plant origin compared to the sample which contained only the physiological saline solution.
Example 6
Example 4 was repeated with the difference that a commercially available mother tincture, that is to say an alcoholic-aqueous solution, of a substance of mineral origin, for example a mother tincture of silica (silica), was used.
Analogous to example 3, significant changes in the measured values were found in the samples containing a mother tincture of a substance of mineral origin compared to the sample containing only the physiological saline solution.