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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung des hämolysierbaren Anteiles der Erythrozyten von Blutproben sowie auf ein Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens.
Als Test zur Bestimmung der Immunitätslage eines bestimmten Organismus ist der Leukozytenresistenztest nach Schröder [vgl. Folia Haematologica 94,4, 1970, Akademische Verlagsgesellschaft Geest und
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314erheblichen Nachteil, dass die Leukozyten im Blutbild ausgezählt werden müssen und bestimmte morphologische Veränderungen der Leukozyten zu beachten sind. Dies ergibt selbst bei geübtem und gut geschultem Laboratoriumspersonal, wie es von dem Patentinhaber auf Grund einiger hundert Tests festgestellt wurde, nicht streng reproduzierbare Ergebnisse.
Andere immunologische Test beruhen auf dem Prinzip der Agglutination. Solche sind hauptsächlich der Coombs-Test und seine Varianten, bei welchen stets ein antigenhaltiges Serum mit dem Blut der zu testenden Person in Berührung gebracht wird. Sämtliche Agglutinationstests sind nicht nur qualitativ. Es
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h.per-Reaktionen verwendet werden.
Ein gemeinsamer erheblicher Nachteil aller bekannten Tests besteht darin, dass sie nur durch einen sogenannten Verdünnungstiter eine quantitative Aussage zulassen.
Ferner ist die Anwendung der bekannten Tests auf bestimmte Fälle beschränkt. Beim Einsatz verschiedener bekannter serologischer Verfahren und bei der Bewertung der Ergebnisse ist nämlich zu beachten, dass die Antikörper zwar eine spezifische (d. h. durch bestimmte Strukturen des Antigens bedingte) Reaktionsfähigkeit mit dem Antigen besitzen, dass diese Reaktionsfähigkeit jedoch nicht durch jedes serologische Verfahren erfasst werden muss.
So gibt es präzipitierende und nichtpräzipitierende Antikörper, komplementbindenden und nichtkomplementbindende Antikörper sowie Antikörper, die nicht im Kochsalzmedium oder nur im Serummedium reagieren und letzten Endes sogar Antikörper (Reagine), die zwar eine positive Hautreaktion im Prausnitz-Küstner-Test herbeiführen, aber durch kein derzeit bekanntes serologisches Verfahren in vitro erfasst werden können. Es ist also klar, dass ein nichtpräzipitierender Antikörper durch die Präzipitationsreaktion nicht erfasst werden kann, hingegen aber z. B. durch die Komplementbindungsreaktion, wenn er eine komplementbindende Eigenschaft besitzt. Ein
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:"Laboratoriumsdiagnostik",S. 193. Dieser Test erlaubt jedoch keine spezifischen Aussagen über die Immunitätslage.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung der Immunitätslage eines bestimmten Organismus mittels eines immunologischen Hämolysetests zu schaffen, welcher hochspezifisch, genau, allgemein anwendbar und schon in sich quantitativ angelegt ist und einfach und mit geringem Aufwand durchgeführt werden kann und mit welchem eine sehr hohe Sicherheitsquote erreicht wird, sowie ein Mittel für Blutuntersuchungen, insbesondere zur Durchführung des genannten Verfahrens, vorzusehen.
Diese Aufgabe wird durch das im kennzeichnenden Teil des Patentanspruches 1 beschriebene Verfahren gelöst.
Bei den Erythrozyten befinden sich Antigen/Antikörper-Komplexe vorwiegend an der Oberfläche der älteren roten Blutzellen. Antigen/Antikorper-Komplexe verursachen intrazellulär eine Umbildung des Hämoglobins zu Bilirubin. Hiedurch werden die Zellmembranen vorgeschädigt.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass durch Borhämolyse nur die Fraktion der Erythrozyten, welche eine vorgeschädigte Zellmembran aufweisen, erfasst wird.
Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine durch immunologische Vorgänge hervorgerufene Vermehrung des intrazellulären Bilirubingehaltes der Erythrozyten eine Vermehrung des Bilirubingehaltes im Serum bei erfolgter Borhämolyse proportional der Menge der Antigen/Antikörper-Kom- plexe bewirkt.
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Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens sind in den Patentansprüchen 2 bis 8 beschrieben.
Besonders bevorzugt ist die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens mittels Bestimmung des
Bilirubingehaltes des Serums und unter Zugrundelegung desselben als Mass, weil dadurch in besonders einfacher Weise besonders hervorragend genaue und hochspezifische Ergebnisse erzielt werden, wobei dies die sicherste Verfahrensweise ist, indem nur das aus den alten Erythrozyten freigesetzte Bilirubin bestimmt wird. Ein weiterer besonderer Vorteil dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass die Bestimmung des Bilirubingehaltes den Anforderungen der Qualitätskontrolle einzigartig gut entspricht. Auch handelt es sich um eine routinemässig und allgemein gebräuchlich einsetzbare Bestimmung.
Die Tatsache, dass mittels der Bilirubinbestimmung erfindungsgemäss die besten
Ergebnisse zu erzielen sind, ist besonders überraschend, da die physiologische Aufgabe der Erythro- zyten, soweit sie bisher bekannt ist, durch ihren Hämoglobingehalt erfüllt wird.
Es ist aber auch möglich, alle andern in den Erythrozyten enthaltenen Substanzen, wie das freigesetzte Hämoglobin, Eiweiss und Kalium, welche beim Borhämolysetest in das Prüfserum übertreten, zu bestimmen.
Für die Lösung c) können Verdünnungsstufen von sogar 1 : 1030 und noch mehr der verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanzen und/oder Antigene passender bekannter
Spezifität verwendet werden. Es können auch Mischungen verschiedener Verdünnungsstufen der verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanzen und/oder Antigene passender bekannter Spezifität genommen werden.
Beispiele für Substanzen, die auf dem Wege chemisch-synthetischer Herstellung gewonnen worden sein oder tierischer, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft sein können, sind Arzneimittelzubereitungen aus Schwefelsäure, Flusssäure und Kaliumcarbonat, Arzneimittelzubereitungen aus Pflanzenextrakten, wie
Extrakten von Digitalis bzw. Aloe sowie Thuja, Gelsemium bzw. Ignatia, Arzneimittelzubereitungen aus Extrakten aus Organismen von Tieren, wie Bienen bzw. Sepia (Tintenfisch), und Arzneimittelpräparate der sogenannten Suis-Reihe, bei welchen es sich um Zubereitungen von Organextrakten aus allen möglichen Schweineorganen handelt ("homöopathische Frischzellentherapie") sowie sogenannte homöopathi- sierte Allopathica, wie Aminophenazon oder Salicylsäure.
Durch Zugabe der Lösung c) werden biologisch ruhende Aktionspotentiale eines Wirkstoffes mittels Zugabe desselben Wirkstoffes in hoher Verdünnung oder homöopathischer Zubereitung aktiviert, was als "Schärfungseffekt" zu bezeichnen ist. Damit kann also erfindungsgemäss das richtige homöopathische Medikament (Similium) objektiv festgestellt werden. Es ist ein bedeutender Vorteil der Erfindung, dass für die obigen Zwecke praktisch alle gelösten Substanzen, die nur hochzuverdünnen bzw. zu homöopathisieren sind, herangezogen werden können. Durch Zugabe von hochverdünnten oder homöopathisierten Antigenen bekannter Spezifität entsteht bei passender Spezifität einer Blutprobe eine andere (meistens höhere, manchmal niedrigere) Borhämolysequote als bei Proben mit nicht passender Spezifität.
Die Höhe der Borhämolysequote ist zudem direkt abhängig von der Menge der spezifisch"geschärften"Antigen/Anti- körper-Komplexe auf der Zelloberfläche. Bei einem Reihentest mit verschiedenen in Frage kommenden Allergenen können sowohl qualitative als auch quantitative Aussagen über die Antigenität verschiedenster Substanzen bei einem Individuum gemacht werden. Hiemit können hauptsächlich "unterschwellige" Antigene, die klinisch nicht durch allergische Symptome in Erscheinung treten, aber dennoch bereits im betreffenden Organismus pathogenetisch wirksam sind, erfasst werden.
In den meisten Fällen wird durch die Lösung c) [im Vergleich zur Vergleiehslösung, wie physiologi- schen Kochsalzlösung, an deren Stelle] eine Erhöhung der Borhämolyse bewirkt. In manchen Fällen tritt dagegen durch die Lösung c) eine Hemmung der Borhämolyse ein. In jedem Fall ist aber die Änderung (Erhöhung oder Hemmung) der Borhämolyse ein den zu testenden Substanzen bzw. Antigen/AntikörperKomplexen zukommender spezifischer definitiver und reproduzierbarer Wert.
Das Hauptanwendungsgebiet der Erfindung ist also die spezifisch qualitative und quantitative Bestimmung von Antigen/Antikörper-Komplexen. Auch die objektive Ermittlung des richtigen homöopathi- schen Medikamentes ist ein wichtiges Anwendungsgebiet derselben. Dabei handelt es sich um die Bestimmung der Veränderung der Oberflächenresistenz der Erythrozyten, die durch das erfindungsgemäss zugegebene verdünnte Präparat photometrisch nachweisbar in Erscheinung tritt. Diese Änderung ist im Vergleich zu einem Leerwert oder Normalwert umso grösser je "passender" das homöopathische Medikament
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ist. Hiezu ist zu bemerken, dass die Substanz, die in höherer Konzentration bestimmte Symptome hervorruft, in homöopathischer Darreichungsform diese Symptome, selbst wenn sie einen andern
Entstehungsmechanismus aufweisen, heilt.
So ist es z. B. möglich, Verstopfungen (Obstipationen), die durch eine Erschlaffung der Darmmuskulatur hervorgerufen werden, durch die homöopathisierte Form von
Stoffen, die eine Erschlaffung bzw. Lähmung der Darmmuskulatur verursachen, zu behandeln. Solche
Stoffe sind beispielsweise Blei und Opium. Welches nun von beiden als Homöopathicum verwendet werden soll, welches also für einen bestimmten Patienten das "passendere" ist, kann durch den erfindungsgemä-
Ben Borhämolysetest ermittelt werden, da nämlich das "passendere" den höheren Photometerausschlag ergibt.
Erfindungsgemäss können Substanzen, die bei dem Probanden, von dem die Blutprobe stammt, als
Antigen wirken, beispielsweise auch Vitamin B12, durch die Borhämolyse bestimmt werden. Bei der
Mischung verschiedener als Antigen wirksamer Substanzen muss man sich vorstellen, dass jede einzelne
Substanz ihre Antigenität entfaltet und dass das Messergebnis der Borhämolyseänderung die Folge der
Wirkungen der verschiedenen Antigene und ihrer Mengenrelationen zueinander ist. Summe und Relation der in das Immunsystem eingeführten Antigen/Antikörper-Komplexe von Antigenmischungen mit den dazugehörigen Komplementreaktionen erzeugen im Borhämolysetest einen bestimmten definitiven und reproduzierbaren Wert. Es ist also festzustellen, dass mit dem Borhämolysetest sowohl Einzelstoffe, die bei dem Probanden als Antigen wirken, als auch eine in bestimmter Zusammensetzung (z.
B. im Pflanzenblatt) natürlich vorkommende Gruppe von Stoffen, die bei dem Probanden Antigenität besitzen, nachgewiesen werden kann.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können also Substanzen, die in hoher Verdünnung vorliegen und sich einer sonstigen chemischen quantitativen Analyse entziehen, nachgewiesen werden, in welchem
Zusammenhang als Beispiel Calciumgluconat genannt sei. Es können alle beliebigen dem Bereich der klinischen Immunologie angehörenden Krankheiten diagnostiziert werden, wie sie beispielsweise im Buch von K. O. Vorlaender, Praxis der Immunologie, Thieme Verlag, Stuttgart, 1976 katalogisiert sind. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann auch das sogenannte homöopathische Similimum objektiv ermittelt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist also hochspezifisch zur Feststellung der durch ein bestimmtes
Antigen oder eine in bestimmter Zusammensetzung natürlich vorkommende Gruppe von solchen hervorge- rufenen Änderung der osmotischen Resistenz von Erythrozyten, u. zw. irgendeiner vom Normalwert abweichenden Resistenz als Folge einer Erkrankung und die praktische Bedeutung desselben ist, alle dem Bereich der klinischen Immunologie angehörenden Krankheiten diagnostizieren zu können, wobei es so empfindlich ist, dass durch es auch schwache Antigene, auf welche andere Verfahren nicht ansprechen, erfasst werden können.
Zweckmässigerweise wird die Abtrennung des Serums durch Zentrifugieren durchgeführt, wobei es als Überstand erhalten wird.
Es ist bevorzugt, die Analyse des Serums durch Photometrieren durchzuführen. So kann insbesondere sein Bilirubingehalt, aber auch sein Hämoglobingehalt bestimmt werden. Es sei auch bemerkt, dass nicht nur positive, sondern auch negative Photometerausschläge (im Falle einer Hemmung der Borhämolyse) auftreten können. Im letzteren Fall kann so verfahren werden, dass für die Probe, welche die Lösung c) enthält, der Wert gleich Null gesetzt und die Probe, welche statt der Lösung c) eine physiologische Kochsalzlösung enthält, gegen die erstere Probe gemessen und so der negative Photometerausschlag als positiver Wert festgehalten wird.
Meistens wurde bei der Wellenlänge 546 mu mit dem Faktor 1010 photometriert. Es sind aber auch andere Wellenlängen möglich.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mittel für Blutuntersuchungen, das sich zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens besonders eignet. Dieses Mittel ist im Patentanspruch 9 beschrieben.
Vorzugsweise ist im erfindungsgemässen Mittel die Natriumcitratlösung eine etwa 3, 8%ige Natriumcitratlösung. Es ist auch bevorzugt, dass die Borsäurelösung eine etwa 3% igue Borsäurelösung ist. Ferner ist die Natriumchloridlösung vorzugsweise eine etwa 0, 9%ige Natriumchloridlösung.
Vorzugsweise ist die vereinigte Borsäure-und Natriumcitratlösung eine solche, in welcher das Verhältnis der Borsäurelösung zur Natriumcitratlösung etwa 3 : 1 ist.
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Es ist auch bevorzugt, dass das Mengenverhältnis der Lösung a) : Lösung b) : Lösung c) etwa 2, 5 : 0, 5 : 0, 5 beträgt.
In den vorliegenden Unterlagen handelt es sich bei den Prozentangaben um Gewichtsprozente oder andere Einheiten, wie etwa Volumskonzentrationen.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel l : Es erfolgte eine Blutentnahme wie üblich durch Aufsaugen von Venenblut in zwei 10 cm3 Einmalspritzen, die je 3, 0 cm3 einer 3, 8%igen Natriumcitratlösung enthielten. Die so gewonnene im folgenden mit"Citratblut"bezeichnete Mischung wurde in einem grossen Reagenzglas durchgemischt.
Dann wurden in einem Röhrchen-Reihentest, in welchem die Röhrchen fortlaufend numeriert waren, je Röhrchen a) 2, 5 cm3 einer Lösung, bestehend aus 3 Gew.-Teilen 3% iger Borsäure und 1 Gew.-Teil einer 3, 8% igen Natriumcitratlösung, b) 0, 5 cm3 einer 0, 9%igen N atriumchloridlösung, c) 0, 5 cm3 einer Lösung einer homöopathisch zubereiteten üblicherweise als D12 bezeichneten
Verdünnung der Urtinktur von beispielsweise Apis mel. (Honigbiene) als Lösungsmittel für die Herstellung der als D bezeichneten Verdünnung wurde physiologische
Kochsalzlösung verwendet und d) 1, 0 cm3 Citratblut pipettiert. Alle Röhrchen wurden gut durchgeschüttelt und 20 min bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Dann wurden alle Röhrchen genau 10 min mit 3000 Umdr/min zentrifugiert und der Überstand wurde sorgfältig in je 1 mit der gleichen Nummer versehenes frisches Röhrchen umgegossen.
Anschliessend wurde im so gewonnenen Überstand der Bilirubingehalt nach einer der gebräuchlichen
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Wende, Klin. Wschr. 38 [1960], S. 703 ; R. Richterich, Klinische Chemie, Akademische Verlagsgesellschaft Frankfurt a. M. [1968], S. 412) bestimmt. Die so erhaltenen Werte wurden in eine vorgedruckte Skala eingetragen.
Beispiel 2 : Beispiel 1 wurde mit dem Unterschied wiederholt, dass im gewonnenen Zentrifugierüberstand der freigesetzte Hämoglobingehalt statt des Bilirubingehaltes photometrisch bestimmt wurde.
Beispiel 3 : Es wurde eine Lösung von 0, 5 g Calciumgluconat und 0, 875 g Calciumlactobionat in 10 cm3 Lösungsmittel, im folgenden kurz als "Calciumgluconatlösung" bezeichnet, verwendet.
5 Tropfen der obigen konzentrierten Calciumgluconatlösung wurden zu 5 cm3 eines von einem beliebigen Porbanden stammenden Citratblutes, welches wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden ist, zugegeben, welches dann 45 min bei 37 C bebrütet wurde.
Von der obigen Calciumgluconatlösung wurde eine hohe Verdünnung wie folgt hergestellt : 0, 1 cm3 der Calciumgluconatlösung wurde in 9, 9 cm3 physiologischer Kochsalzlösung gelöst und diese Lösung wurde in einem Reagenzglas 80mal in vertikaler Richtung geschüttelt. Der so erhaltenen Lösung, die als Lösung Ci bezeichnet wird, wurden 0, 1 cm3 entnommen und diese wieder mit 9, 9 cm3 physiologischer
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: 1012Calciumgluconatlösung, die als Lösung Cg bezeichnet wird, erhalten wurde.
Dann wurde der im Beispiel l beschriebene Borhämolysetest mit dem Unterschied durchgeführt, dass er doppelt angesetzt wurde. Eine erste Probe wurde in der Weise bereitet, dass das wie vorstehend beschrieben hergestellte mit der konzentrierten Calciumgluconatlösung versetzte Citratblut wie im Beispiel 1 beschrieben verarbeitet wurde, wobei als Lösung c) 0, 5 cm3 der wie vorstehend beschrieben bereiteten hochverdünnten Calciumgluconatlösung (Lösung Cg) verwendet wurde. Eine zweite Probe wurde
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sung (physiologische Kochsalzlösung) verwendet wurde.
Die Feststellung des Bilirubingehaltes beider Lösungen erfolgte relativ, d. h. der Bilirubingehalt der Probe, die nur die physiologische Kochsalzlösung
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enthielt, wurde mit dem der Probe, welche auch die hochverdünnte Calciumgluconatlösung (Lösung Cg) enthielt, in Beziehung gesetzt :
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25 cm3Konzentration von 25 Millimol Natriumnitrit/l) zugegeben worden sind, versetzt. Zu beiden so erhaltenen
Lösungen wurden noch jeweils 0, 5 cm3 physiologische Kochsalzlösung zugegeben. Am Messwert wurde eine signifikante Steigerung der Borhämolyse bei der Probe, welche die hochverdünnte Calciumgluconatlösung enthielt, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, festgestellt.
Beispiel 4 : Es wurde eine handelsübliche Urtinktur, d. h. ein konzentrierter alkoholischer
Auszug, einer Substanz tierischer Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Apis mel. (Honigbiene), verwendet.
2 Tropfen der obigen Urtinktur wurden zu 5 cm3 physiologischer Kochsalzlösung zugegeben. Um den
Alkohol, der später in Verbindung mit dem Blut das Ergebnis gestört hätte, auszutreiben, wurde die so zubereitete physiologische Kochsalzlösung einmal kurz aufgekocht und dann 24 h bei Zimmertemperatur offen stehengelassen.
Ein etwa entstandener Bodenbelag wurde von der Lösung durch Filtrieren oder Zentriefugieren getrennt. Die nunmehr klare, wenn auch, je nach Substanz, etwaig gefärbte Lösung stellte das Analog zu der im Beispiel 3 verwendeten konzentrierten Lösung (von Calciumgluconat) dar und es wurden von ihr in diesem Beispiel 5 Tropfen an Stelle der 5 Tropfen der letzteren verwendet. Im übrigen wurde analog wie im Beispiel 3 beschrieben vorgegangen. Bei diesem Vorgehen wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz tierischer Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Messwertänderungen festgestellt.
Beispiel 5 : Beispiel 4 wurde mit dem Unterschied wiederholt, dass eine handelsübliche Urtinktur, d. h. ein konzentrierter alkoholischer Auszug, einer Substanz pflanzlicher Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Thuja (Lebensbaum), verwendet wurde.
Es wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz pflanzlicher Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Messwertänderungen festgestellt.
Beispiel 6 : Beispiel 4 wurde mit dem Unterschied wiederholt, dass eine handelsübliche Urtinktur, d. h. eine alkoholisch-wässerige Lösung, einer Substanz mineralischer Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Silicea (Kieselsäure) verwendet wurde.
Es wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz mineralischer Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Messwertänderungen festgestellt.
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