DE2553587C3

DE2553587C3 - Verfahren zur Bestimmung von infektiösen und immunologischen Vorgängen sowie Mittel für Blutuntersuchungen

Info

Publication number: DE2553587C3
Application number: DE19752553587
Authority: DE
Inventors: Horst Dr.Med. 8391 Kellberg Veith
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-11-28
Filing date: 1975-11-28
Publication date: 1978-06-22
Also published as: DE2553587A1; DE2553587B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Als Test zur Bestimmung von immunologischen Vorgängen ist der Leukozytenresistenztest nach Schröder bekannt. Dieser hat aber den erheblichen Nachteil, daß die Leukozyten im Blutbild ausgezählt werden müssen und bestimmte morphologische Veränderungen der Leukozyten zu beachten sind. Dies ergibt selbst bei geübtem und gut geschultem Laboratoriumspersonal, wie es vom Anmelder aufgrund einiger hundert Tests festgestellt wurde, instabile Ergebnisse.

Andeni immunologische Tests beruhen auf dem Prinzip der Agglutination. Solche sind hauptsächlich der Coombs-Test und seine Varianten, bei welchen stets ein antigenhaltiges Serum mit dem Blut der zu testenden Person in Berührung gebracht wird. Sämtliche Agglutinationstests sind nicht nur qualitativ. Es gibt auch Serumflockungstests, die einen Titer ergeben, das heißt auch qualitativ auswertbar sind. Der Prototyp ist die Gruber-Widalsche Reaktion. Dieser Test ist aber streng spezifisch auf bestimmte Antigen/Antikörper- Reaktionen eingestellt und kann nicht als Ausgangsbasis für andere Antigen/Antikörper-Reaktionen verwendet werden.

Ein gemeinsamer erheblicher Nachteil aller bekannten Tests besteht darin, daß sie nur durch einen sogenannten Verdünnungstiter eine quantitative Aussage zulassen.

Ferner haben die bekannten Tests den Nachteil, daß ihre Anwendung auf bestimmte Fälle beschränkt ist. Beim Einsatz verschiedener bekannter serologischer Verfahren und bei der Bewertung der Ergebnisse ist nämlich zu beachten, daß die Antikörper zwar eine spezifische (das heißt durch bestimmte Strukturen des Antigens bedingte) Reaktionsfähigkeit mit dem Antigen besitzen, daß diese Reaktionsfähigkeit jedoch nicht durch jedes serologische Verfahren erfaßt werden muß. So gibt es präzipitierende und nichtpräzipitierende Antikörper, komplementbindende und nichtkomplementbindende Antikörper sowie Antikörper, die nicht im Kochsalzmedium oder nur im Serummedium reagieren und letzten Endes sogar Antikörper (Reagine), die zwar eine positive Hautreaktion im Prausnitz-Küstner Test herbeiführen, aber durch kein derzeit bekanntes serologisches Verfahren in vitro erfaßt werden können. Ec ist also klar, daß ein nichtpräzipitierender Antikörper durch die Präzipitationsreaktion nicht erfaßt werden kann, hingegen aber zum Beispiel durch die Komplementbindungsreaktion, wenn er eine komplementbindende Eigenschaft besitzt. Ein negativer Befund bei Verwendung eines einzelnen serologischen Verfahrens muß daher noch nicht zwangsläufig bedeuten, daß kein Antikörper vorhanden ist (Deutsch-Geyer: »Laboratoriumsdiagnostik«, Seite 622).

Bekannt ist ferner ein Hämoiysetest, bei aem dii: osmotische Resistenz der Erythrozyten (roten Blutkörperchen) bestimmt wird, vgl. N. Henning, «Klinische Laboratoriumgsdiagnostik«, 3. Auflage. 1966, S. 193. Dieser Test erlaubt jedoch keine spezifischen Aussagen über immunologische Vorgänge.

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Verfahren zur Bestimmung von infektiösen und immunologischen Vorgängen mittels eines immunologischen Hämolysetests zu schaffen, welcher hochspezifisch, genau, allgemein anwendbar und schon in sich quantitativ angelegt ist und einfach und mit geringem Aufwand durchgeführt werden kann und mit welchem eine sehr hohe Sicherheitsquote erreicht wird.

Diese Aufgabe wird gemäß dem Kennzeichen des Patentanspruchs 1 gelöst.

Bei den Erythrozyten befinden sich Antigen/Antikörper-Komplexe vorwiegend an der Oberfläche der älteren roten Blutzellen. Antigen/Antikörper-Komplexe verursachen intrazellulär eine Umbildung des Hämoglobins zu Bilirubin. Hierdurch werden die Zellmembranen vorgeschädigL

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß durch Borhämoiyse nur die Fraktion der erythrozyten, welche eine vorgeschädigte Zellmembran aufweisen, erfaßt wird.

Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine durch immunologische Vorgänge hervorgerufene Vermehrung des intrazellulären Bilirubingehaltes der Erythrozyten eine Vermehrung des Bilirubingehaltes im Serum bei erfolgter Borhämoiyse proportional der Menge der Antigen/Antikörper-Komplexe bewirkt.

Es ist deswegen bevorzugt, den Bilirubingehalt des Serums zu bestimmen und diesen als Maß zugrundezulegen, weil dies die sicherste Verfahrensweise ist, indem nur das aus den alten Erythrozyten freigesetzte Bilirubin bestimmt wird. Es ist aber auch möglich, alle anderen in den Erythrozyten enthaltenen Substanzen, wie das freigesetzte Hämoglobin, Eiweiß und Kalium, welche beim Borhämolysetest in das Prüfserum übertreten, zu bestimmen.

Beispiele für Substanzen, die auf dem Wege chemischsynthetischer Herstellung gewonnen worden sind oder tierischer, pfanzlicher oder mineralischer Herkunft sein können, sind Arzneimittelzubereitungen aus Schwefelsäure, Flußsäure und Kaliumcarbonat, Arzneimitteizubereitungen aus Pflanzenextrakten, wie Extrakten von Digitalis beziehungsweise Aloe, Arzneimittelzubereitungen aus Extrakten aus tierischen Organismen, wie Sepia (Tintenfisch), und Arzneimittelpräparate der sogenannten Suis-Reihe, bei welchen es sich um Zubereitungen von Organextrakten aus allen möglichen Schweineorganen handelt (»homöopathische Frischzellentherapie«), sowie sogenannte homöopathisierte Allopathica, wie Aminophenazon oder Salicylsäure.

Durch Zugabe der Lösung c) werden biologisch ruhende Aktionspotentiale eines Wirkstoffes durch Zugabe desselben Wirkstoffes in hoher Verdünnung oder homöopathischer Zubereitung aktiviert, was als »Schärfungseffekt« bezeichnet wird (Biologische Medizin, 4. Jahrgang, 1975, Nr. 2 [1. April 1975], Seite 271 bis 273). Damit kann also erfindungsgemäß das richtige homöopathische Medikament (Siniilimum) objektiv fesgestellt werden. Es ist ein bedeutender Vorteil der Erfindung, daß für die obigen Zwecke praktisch alle gelösten Substanzen, die nur hoch zu verdünnen beziehungsweise zu homöopathisieren Mnd, herangezogen werden können. Durch Zugabe von hochverdünnten oder homöopathisierten Atvigenen bekannter Spezifität entsteht bei passender Spezifität einer Blutprobe eine höhers Borhämolysequote als bei Proben mit nicht passender Spezifität. Die Höhe der Borhämolysequote ist zudem direkt abhängig von der Mpngp Ηργ spezifisch »geschärften« Antigen/Antikörper-KompIexe auf der Zelloberfläche. Bei einem Reihentest mit verschiedenen in Frage kommenden Allergenen können sowohl qualitative als auch quantitative Aussagen über die Antigenität verschiedenster Substanzen bei einem Individuum gemacht werden. Hiermit können hauptsächlich »unterschwellige« Antigene, die klinisch nicht durch allergische Symptome in Erscheinung treten, aber dennoch bereits im betreffenden Organismus pathogenetisch wirksam sind, erfaßt werden.

Die Hauptanwendungsgebiete der Erfindung sind also die spezifisch qualitative und quantitative Bestimmung von Antigen/Antikörper-Komplexen und die objektive Ermittlung des richtigen homöopathischen Medikamentes.

Zweckmäßigerweise wird die Abtrennung des Serums durch Zentrifugieren durchgeführt, wobei es als Oberstand erhalten wird.

Es ist bevorzugt, die Analyse des Serums durch Photometrieren durchzuführen. So kann insbesondere sein Bilirubingehalt, aber auch sein Hämoglobingehalt bestimmt werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mittel für Blutuntersuchungen, das sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders eignet. Dieses Mittel ist im Patentanspruch 4, und bevorzugte Ausführungsformen sind in den Patentanspüchen 5 bis 9 beschrieben.

In den vorliegenden Unterlagen handelt es sich bei den Prozentangaben stets um Gewichtsprozente in Volumkonzentration ausgedrückt.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Es erfolgte eine Blutentnahme wie üblich durch Aufsaugen von Venenblut in zwei 10-cm³-Einmalspritzen, die je 3,0 cm³ einer 3,8%igen Natriumcitratlösung enthielten. Dit so gewonnene, im folgenden mit »Citratblut« bezeichnete Mischung wurde in einem großen Reagenzglas durchgemischt.

Dann wurden in einem Röhrchen-Reihentest, in welchem die Röhrchen fortlaufend numeriert waren, je Röhrchen
45

a) 2,5 cm³ einer Lösung, bestehend aus

3 Gew.-Teilen 3%iger Borsäure und
1 Gew.-Teil einer 3,8%igen Natriumcitratlösung,
b) 0,5 cm³ einer O,9°/oigen Natriumchloridlösung,

c) 0,5 cm³ einer Lösung einer

im Verhältnis von 1 :10¹² verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanz, die auf dem Wege chemisch-synthetischer Herstellung gewonnen worden

sein oder tierischer, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft sein konnte, beziehungsweise eines Antigenes passender bekannter Spezifität in einer isotonischen Salzlösung und

d) 1,0 cm³ Citratblut

pipettiert. Alie Röhrchen wurden gut durchgeschüttelt und 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann warden alle Röhrchen genau 10 Minuten mit 3000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, und der Überstand wurde sorgfältig in je ein mit der gleichen Nummer versehenes frisches Röhrchen umeeeossen.

Anschließend wurde im so gewonnenen Überstand der Bilirubingehalt nach einer der gebräuchlichen Verfahrensweisen, beispielsweise mit Hilfe des Lange-Fhotonieters oder Eppendorf-Photometers (L J e η d rassik und P. Grof, Biochem. Z, 297 [1938], Seite 81; L. Jendrassik und R. Cleghorn, Biochem. Z., 289 [1937J Seite 1; G. Schellong und U. Wende, Arch. Kinderlieb 162 [1960J Seite 126; G. Schellong und U. Wende, KHn. Wschr., 38 [I960], Seite 703; R. Richterich, Klinische Chemie, Akademische Verlagsgesellschaf ι, Frankfurt a. M. [1968], Seite 412) bestimmt. Die so erhaltenen Werte wurden in eine vorgedruckte Skala eingetragen.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde mit dem Unterschied wiederholt, daß im gewonnenen Zentrifugierüberstand der freigesetzte Hämoglobingehalt statt des Bilirubingehaltes photometrisch bestimmt wurde.

Beispiel 3

Es wurde eine Lösung von 0,5 g Calciumgluconat und 0,875 g Calciumlactobionat in 10 cm³ Lösungsmittel, im folgenden kurz als »Calciumgluconatlösung« bezeichnet, verwendet.

5 Tropfen der obigen konzentrierten Calciumgluconatlösung wurden zu 5 cm³ eines von einem beliebigen Probanden stammenden Citratblutes, welci es wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden ist, zugegeben, welches dann 45 Minuten bei 37° C bebrütet wurde.

Von der obigen Calciumgluconatlösung wurdi eine hohe Verdünnung wie folgt hergestellt: 0,1 cm³ der Calciumgluconatlösung wurde in 9,9 cm³ physiologischer Kochsalzlösung gelöst, und diese Lösung wurde in einem Reagenzglas 80mal in vertikaler Richtung geschüttelt. Der so erhaltenen Lösung, die als Lösung Q bezeichnet wird, wurden 0,1 cm³ entnommen und diese wieder mit 9,9 cm³ physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und 80mal geschüttelt. Die so erhaltene Lösung wird als Lösung Ci bezeichnet. In dieser Weise wurde fraktioniert verdünnend weiter vorgegangen, bis eine Verdünnung von 1 :10¹² der Calciumgluconatlösung, die als Lösung Q, bezeichnet wird, erhalten wurde.

Dann wurde der im Beispiel 1 beschriebene Borhämolysetest mit dem Unterschied durchgeführt, daß er doppelt angesetzt wurde. Eine ersts Probe wurde in der Weise bereitet, daß das wie vorstehend beschrieben hergestellte, mit der konzentrierten Calciumgluconatlösung versetzte Citratblut wie im Beispiel 1 beschrieben, verarbeitet wurde, wobei als Lösung c) 0,5 cm³ der wie vorstehend beschrieben bereiteten hochverdünnten Calciumgluconatlösung (Lösung Cei) verwendet wurde. Eine zweite Probe wurde mit dem Unterschied bereitet, daß die Zugabe der hochverdünnten Calciumgluconatlösung fortfiel, also außer der Lösung, bestehend aus Borsäure und Natriumcitratlösung, nur eine 0,9%ige Natriumchloridlösung (physiologische Kochsalzlösung) verwendet wurde. Die Feststellung des Bilirubingehaltes beider Lösungen erfolgte relativ, das heißt, der Bilirubingehalt der Probe, die nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, wurde mit dem der Probe, welche auch die hochverdünnte Calciumgluconatlösung (Lösung Q,) enthielt, in Beziehung gesetzt:

Von jeder Probe wurde 1 cm³ des gewonnenen Überstandes mit 0,25 cm³ einer Sulfanilsäurelösung in einer Konzentration von 29 Millimol/1 und 0,5 cm³ einer Diazoiösung, die vorher so zubereitet worden ist, daß zu 3 cm³ physiologischer Kochsalzlösung 3 Tropfen Diazoreagens (Natriumnitritlösung vnit einer Konzentration von 25 Millimol Natriumnitrit/I) zugegeben worden sind, versetzt. Zu beiden so erhaltenen Lösungen wurden noch jeweils 0,5 cm³ physiologische Kochsalzlösung zugegeben. Am Meßwert wurde eine signifikante

ίο Steigerung der Borhämolyse bei der Probe, welche die hochverdünnte Calciumgluconatlösung enthielt, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, festgestellt.

_IS Beispiel 4

Rs wurde eine handelsübliche Urtinktur, das heißt ein konzentiierter alkoholischer Auszug, einer Substanz tierischer Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Apis mel. (Honigbiene), verwendet.

2 Tropfen der obigen Urtinktur wurden zu 5 cm³ physiologischer Kochsalzlösung zugegeben. Um den Alkohol, der später in Verbindung mit dem Blut das Ergebnis gestört hätte, auszutreiben, wurde die so zubereitete physiologische Kochsalzlösung 1mal kurz aufgekocht und dann 24 Stunden bei Zimmertemperatur offen stehengelassen.

Ein etwa entstandener Bodenbelag wurde von der Lösung durch Filtrieren oder Zentrifugieren getrennt. Die nunmehr klare, wenn auch, je nach Substanz, etwaig gefärbte Lösung stellte das Analog zu der im Beispiel 3 verwendeten konzentrierten Lösung (von Calciumgluconat) dar und es wurden von ihr in diesem Beispiel 5 Tropfen anstelle der 5 Tropfen der letzteren verwendet. Im übrigen wurde analog, wie im Beispiel 3 beschrieben, vorgegangen. Bei diesem Vorgehen wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz tierischer Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Meßwertänderungen festgestellt.

Beispiel 5

Beispiel 4 wurde mit dem Unterschied wiederholt, daß eine handelsübliche Urtinktur, das heißt ein konzentrierter alkoholischer Auszug, einer Substanz pflanzlicher Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Thuja (Lebensbaum), verwendet wurde.

Es wurde analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz pflanzlicher Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photometer signifikante Meßwertänderungen festgestellt.

Beispiel 6

Beispiel 4 wurde mit dem Unterschied wiederholt, daß eine handelsübliche Urtinktur, das heißt eine alkoholisch-wäßrige Lösung, einer Substanz mineralischer Herkunft, beispielsweise eine Urtinktur von Silicea (Kieselsäure), verwendet wurde.

Es wurden analog wie im Beispiel 3 bei den Proben, welche eine Urtinktur einer Substanz mineralischer Herkunft enthielten, gegenüber der Probe, welche nur die physiologische Kochsalzlösung enthielt, am Photo meter signifikante Meßwertänderungen festgestellt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von infektiösen und immunologischen Vorgängen durch Vermischen von Blutproben mit einer Natriumcitratlösung und einer eine verdünnte Natriumchloridlösung enthaltenden Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit der Natriumcitratlösung vermischten Blutproben mit

a) einer vereinigten Borsäure- und Natriumcitratlösung,

b) einer verdünnten Natriumchloridlösung sowie

c) einer Lösung von, zweckmäßigerweise im Verhältnis von etwa 1 :10¹², verdünnten oder homöopathisch zubereiteten zu testenden Substanzen, die auf dem Wege chemischsynthetischer Herstellung gewonnen worden sein oder tierischer, pflanzlicher oder mineralischer Herkunft sein können, und/oder von Antigenen passender bekannter Spezifität in einer isotonischen Salzlösung

vermischt, aus der Mischung nach dem Ende der Reaktionen das Serum abtrennt und darin als Maß für den Grad der eingetretenen Hämolyse eine aus ₂$ den Erythrozyten freigesetzte Substanz bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bilirubingehalt des Serums bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Analyse des Serums durch Photometrieren durchführt.

4. Mittel für Blutuntersuchungen, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mischung aus

a) einer vereinigten Borsäure- und Natriumcitratlösung,

b) einer verdünnten Natriumchloridlösung sowie

ist.

5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Natriumcitratlösung eine etwa 3,8%ige Natriumcitratlösung ist

6. Mittel nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekenn7eiohnet, daß die Borsäurelösung eine etwa 3%ige Borsäurelösung ist.

7. Mittel nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verdünnte Natriumchloridlösung eine etwa 0,9%ige Natriumchloridlösung ist.

8. Mittel nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die vereinigte Borsäure- und Natriumcitratlösung eine Borsäurelösung und eine Natriumcitratlösung im Verhältnis von etwa 3 : 1 zueinander umfaßt.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Mengenverhältnis der Lösung a): Lösung b): Lösung c) etwa 2,5 : 0,5 : 0,5 beträgt.