DE1773363A1 - Verfahren und Produkt zum Pruefen des Vorhandenseins von Haemoglobin S - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE I / / O O D O

DIPL-ING. HANS BEGRICH · DIPL-ING. ALFONS WASMEIER

REGENSBURG 3 · LESSINGSTRASSE 10

Patentanwälte Beglich · Wasmeier, 8400 Regensburg 3, Postfach Π

An das

Deutsche Patentamt 8 Bfiinchen 2

Telefon 0941/31055 Bayer. Staatsbank, Regensburg 507 Postscheckkonto: München 89369 Telegramme: Begpatent Regensburg

Ihr Zeichen Ihre Nachricht vom

In der Antwort bitte angeben Unser Zeichen

T/p 6252

23. April 1968 B/We

Harold Benjamin Tillem, 109 South Munn Avenue, East Orange,

New Jersey, U.S.A.

Verfahren und Produkt zum Prüfen des Vorhandenseins von

Hämoglobin S.

Ein Verfahren und Produkt zum Prüfen des Vorhandenseins von Hämoglobin S enthält folgende Schritte: Präparieren einer Pufferlösung, vorzugsweise eines Phosphatpuffers und Hinzugeben zu dem Phosphatpuffer eines Reduktionsmittels beispielsweise Fatriumdithionit. Mach dem Auflösen des Reduktionsmittels in der Pufferlösung wird ein erythrozytisches Hämolysemittel, beispielsweise eine 2$ige Saponinlösung hinzugetan und mit dem Puffer und dem Reduktionsmittel gemischt. Die resultierende Lösung wird dann in ein Reagensglas getan und eine abgemessene Menge an Blut hinzugetan. Das Prüfglas wird gemischt und inner-

109830/0666 ^BÄD

ΐ/ρ 6252 B/We 23.April 1968

"halb awei Minuten können die Ergebnisse bestimmt werden«, Das heißt, wenn die resultierende Lösung trübe oder schlammig ist und einen Niederschlag zeigt, ist Hämoglobin S vorhanden, '.'/enn die Lösung opalisierend oder durchsichtig mit keinem Niederschlag ist, dann ist das Ergebnis negativ und bedeutet die Abwesenheit von Hämoglobin ä.

Hämoglobin S wird heutzutage als ein erbliches, genetisches Rassenmerkmal betrachtet, welches, wenn gemischterbig oder heterozygot einen geringen klinischen Beweis seines Vorhandenseins ergibt, aber, wenn reinerbig oder homozygot, eine tiefe Anämie ^ur Folge hat.

Ein Sichelzellenmerkmal ist vorherrschend bei Personen der lieger ras se gefunden worden» Reinerbiges Hämoglobin S hat eine Anämie zur ffolge, deren Symtome Beingeschwüre und akute Schmeraanfälle einschließen. Der Jtteinerbige oder homozygote Zustand wird normalerweise durch das Vorhandensein von besonderen sichel·· förmigen und haierförmigen roten Korpuskeln unterschieden» Obgleich es in der Hauptsache Personen der Negerrasse augeordnet worden ist, gibt es Anzeigen, daß das Sichelaellenmerkmal in Afrika von Nordwesten über die frühere Landbrücke zwischen Ägypten und Afrika eingeführt worden sein kann. Es hat jedoch den Anschein, dau dicheraellenanämie gegenwärtig häufiger bei Personen der Negerrasse'oder Personen mit einer Mischung von *'■ Negerblut gefunden wird»

109830/0666 bad original

Τ/ρ 6252 . 23.4.68 B/We

Der den Patienten untersuchende Arzt, welcher an Sichelsellenanämie leidet und diese nögliehkeit ohne eine geeignete Blutprlifung nicht in Erwägung gezogen hat , kann in der Diagnose einen Irrtum machen, da die Symtome der iSieherzellenanämie ebenfalls einer Unterleibskrankheit, rheumatischem Heber oder einer neurologischen Störung gemeinsam sind.

Üs ist wichtig, daß sogar ein isiehelzellenmerkmal durch einen behandelnden ,krzt erkannt wird, da eine Person mit diesem Merkmal nicht zu geringen iiauerstoffverhältnissen unterworfen werden sollte. Weiterniii ist dieses auch wichtig, wo jemand mit einem SichelzellenmerkBial Blut für andere spendet. Ea würde sicherlich nicht wünschenswert sein, ein Bluttransfusion von jemandem mit Hämoglobin 6 einem Patienten zu geben, bei welchem ein Sauerstoffmangel vorhanden ist.

jus ko"nrien verschiedene i»iethoden verwendet werden, um die Sichelzelleneigenschaft zu bestimmen» 3>as einfachste Verfahren besteht darin, einen Blutstropfen auf einen Schieber zu tun, ein Leckblättchen anzuwenden und das Präparat abzudichten. Yienn das Präparat steht, wird Sauerstoff verbraucht, oichelzellen werden unter einem luikroskop in wenigen Stunden in dem Pail einer Sichelaellenanämie sichtbar und langsamer bei einem ^ichelzeilenras seniaerkmal, und sie können durch einen geschickten 'i-'echniker beobachtet werden. Die Bildung der öichela-ellen kann dadurch oeschleunii-.t werden, daß ein Gummiband fest um einen finger ^e-

109830/0666 _{6AD 0RI(3INA1}.

Τ/ρ 6252 23.4.68 B/We

wickelt und ungefälir 5 Minuten dort beiessen wird, bevor ein feuchtes Präparat gemacht wird. Eine maximale ^üichelbildung wird durch hinzufügung eines Eeduktionsmittels wie beispielsweise jtfatriundisulfit (Ba^ii^O^) oder l\latriumdithionit (Ia₂S?^/) zu dem Blut erzeugt werden. Das Jtfatriunidisulfit wird zum Abschirmen oder Sieben in Übereinstimmung mit den folgenden üchritten verwendet:

1. E's wird ein kleiner Tropfen an kapillarem- oder öxalatblut aui einem sauberen Schieber getan und dem Schieber zwei Tropfen von der gleichen üröße einer 2$igen Katriumdisulfitldsung hinzugefügt.

2. Die Blut- und i\iatriumdisulfitlösung wird gemischt, mit einem &las aDgedeckt und 30 üiinuten stehen gelassen.

3. Durc-u Beobachten unter einem Mikroskop (Hociileiötungslinsen ) ist es möglich, mit einem geübten iiuge das Vorhandensein von ^uichel2ellen zu erkennen.

üiine ₆egenwärtig verwendete qualitative Probe zum Unterscheiden von einem iSichelz eil enmerkmal von Sichelzellenanämie ist die Sherman Hi et hode. Diese Methode benutzt eine 10/oige Pormalinlösune· ide Schritte sind folgende;

1. 2ml einer "livigen iOrmalinsalzlösung wird in ein kleines •keagena&las ^etan und mit einer ochicht aus Mineralöl abgedeckt.

ο1>830/0666 BAD ORIGINAL

Τ/ρ 6252 23.4.68 Β/Λβ

2. Der tote Kaum einer 5ml Spritae wird mit Mineralöl gefüllt und der Überfluß weggetan.

3. Eine sterile Nadel wird auf die Spritze getan und 2ml Blut durch Venenpunktion eingezogen.

4. Die Nadel wird auf der Spritze belassen und unmittelbar 1ml Blut unter die Ölschicht in dem Eeagensglas zugetan,

5. Es wird duroh Unirühren mit einer G-lasstange gemischt-«

6. Nachdem die Mischung 10 Minuten stehengelassen worden ist, kann ein kleiner Betrag an Blutmischung mit einer Kapillarpipette entfernt werden,

7. Die Mischung wird dann auf den Schieber getropft, mit einem Deckglas abgedeckt und auf Sichelzellen unter HochleistungaIinaen eines Mikroskops geprüfte

Das Ergebnis ist, daß man beobachtet, daß entweder keine Sichelaellen vorhanden sind oder man würde die Erythrozyten und den Proaentsata an vorhandenen sichelförmigen Erythrozyten zählen. Wenn 1$ oder weniger sichelförmige Erythrozyten oder rote Blutkörperchen vorhanden sind, dann würde ein ciichelzellenmerkmal angezeigt werden. Sichelzellenanämie zeigt beständig. mehr al3 1$ , gewöhnlich awisehen 30 und 60$ sichelförmiger Erytbroayten.

Hämoglobin-llektrophor«aa lot das am meisten apesiflache

j 10M30/06IS

Τ/ρ 6252 " 23.4,6b h/»e

Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von abnormalem Hämoglobin wie beispielsweise Hämoglobin S, und zum Unterscheiden von Sichelzellenanämie (homozygotisch) von bichel-■zellehmerkmal (heterozygotisch) .

■4»

Ein drittes Verfahren zur qualitativen Analyse des Blutes für einen Prozentsatz an üichelzellen wird durch C.A.J. Goldberg in einem Artikel "Clinical Chemistry, YoI.3, So.1" vom Februar 1957 auf den Seiten 1 -19 unter dem l'itel "Identification of Hemoglobins" Geschrieben, in welcnem besondere Blutpräparate, welche das folgende erfordern, benutzt werden:

Vier oder fünf Jkillimeter an oxalatem Blut wird in Zentrifu_öenrohren von 15ml Fassungsvermögen eingetan und 10 Minuten lang zentrifugiert.

Der Überschuß wird abgezogen und 1CmI an iaalz wird den gepackten Zellen hinzugefügt.

Dies wird weich gequirlt und wieder 10 Minuten lan_& zentrifugiert. üVieder wird der Überschuß abgezogen und die Zellen werden dreimal mit 10ml Teilen von Salz gewaschen.

Dies wird wiederum 10 Minuten lang zentrifugiert oder geschleudert.

Die gewaschenen, gepackten Zellen werden in graduierte

109830/0668 bad original

Ί/₁ 6252 23.4.63 Jy»ie

Zei triiUfeenroiirCiien ^etan, und es werden zwei Volumen an Jarbitalpuiiei pa Ö.6 unter sanitem itühr en hinzu_betan, und die wlIspendieren werden dann aui bevorratende lieirierrührchen üuertra^eno ^ie ^eirorenen auster weruen mindestens Hber Laent n, und sie können in den; _belroreuen Zustand belassen bis oie benötigt werden.

üämoljse v\ird durch Auttauen "bewirkt. Mn itonr wird in dem Ivüiilsu^raiik oder ο ei kaumteji.peratui aufgetaut. Jjas iioJar kariii bei Lorpcrteiiperatur erwärmt wer den, es sollte aber so DaU _toekli^lt weraen, als alles ώίε versciiAunaen idt. iJas itülir- c^eu kam. nicnt in warmes ouer iieifces nasser sum aui tau en ii weiden.

Las «.ueter oder die irooe v.ird 10 iiiinuten lan^, zer:tri±Ut,iert, und üas klare hhx-ä^ä^t ist dann lüi eine weitere -trrüiunt braucliuar.

Ein Hiospiiatpuiier wiru dann durch Auilöeen von 16,9 & vom einbasigen, oder primären Kaliumplaosphat (KHpPO.) und 21_O7 g von sekundärem Kaliuuphospliat (KpHPO /) oder 17*7 g von sekun-" dar ein latriumphospiiat (WapHPO.) in kohlensuurefreiem distillieiten nasser präpariert und die uienge wird auf 100ml eingestellt.

1,B al an Phosphat pull er, 2J m^ an Eatriumdithionit uiid 2ml an deputierter fiän.oglobinlösun^: wird einer kleinen Probenrohre zugetan.

109830/06 6 6 ^ßAD

Τ/ρ 6252 23.4ο68 B/We

Die Proben- oder Prüfröhre wird gemischt und 15 Minuten stehengelassen. Ein Niederschlag wird gebildet, welcher dann durch Filtern der lösung durch einen Whatmanfilter Papier Ur. 5 oder etwas gleichwertiges separiert wird_o

3.8 ml an Phosphatpuffer und 20 mg. Natriumdithionit werden in Küvetten gemessen. Dann wird 0.2 ml an Hämoglobinfiltrat hinzugetan und durch Umkehren der Küvetten 2 mal gemischt. Das Absorptionsvermögen oder die optische Dichte der Lösung wird dann in einem Spektrophotometer bei 415 my gemessen.

Dann wird in einen -Meßzylinder von 25 ml Passungsvermögen 20 ml distilliertes Wasser hinzugetan, und 0.1 ml an Hämoglobinlösung wird in den Zylinder getan. Dann wird die Pipette ausgespült und der Zylinder durch Umkehren gemischt. Ungefähr 4 ml an Lösung wird auf eine Küvette übertragen.

Dann wird die Absorptionsfähigkeit der Kontroilösung gemäß der folgenden Formel gemessen:

A unbekannt

Löslichkeit in fo χ 100

A kontrolliert

Die Lösung an Hämoglobin A und F wird auf 90$ oder höher durch dieses Verfahren festgestellt. Die löalichkeit an Hämoglobin S "ist sehr geringe

Alle drei der oben beschriebenen qualitativ«:)! Verfahren, immlieh

10 9 8 30 /OGß6 ' ^; »AD

ϊ/ρ 6252 24.4.68 B/We

das Sherman-Verfahren, die Elektrophoreses und das Goldberg-Verfahren haben wesentliche Nachteile» Sie benötigen eine sehr lange Zeit bis zur vollständigen Durchführung (das Goldberg-Verfahren würde mindestens 24 Stunden dauern) und erfordern geprüfte Fachleute, um sowohl das Verfahren durchzuführen als auch die Ergebnisse zu erkennen₀ Somit ist keines dieser drei Verfahren für ein Sieben oder Trennen von einer großen Anzahl von Blutproben in kurzer Zeit durch ungeübtes Personal geeignete Weiterhin erfordern alle die obenen beschriebenen Verfahren eine große Ausrüstung.

Das einzige in der Vergangenheit für eine Verwendung als ein Abschirmungs- oder Trennungstest vorgeschlagene und tatsächlich als Abschirmung^- oder Siebungstest benutzte Verfahren ist der oben beschriebene Natriumdisulfittest. Dieser Test oder diese Prüfung erfordert dazu mindestens 30 oder 35 Minuten bis zu seiner Durchführung und zusätzlich eine geübte Person, um die Resultate zu beobachten. D.h„, die Person muß im Stande sein, ein Mikroskop zu benutzen, um Sichelzellen im Gegensatz zu anderen normalen Zellen und anderen abnormalen Blutzellen zu erkennen, welche Sichelzellen ähneln bzw. gleichen. Im Falle von einem Sichelzellenmerkmal kann dieses manchmal ein Problem sein, da die Anzahl von vorhandenen üichelzellen auf dem Schieber gering und der Beobachter das kontrolltypische der Zellen vermissen kann welches somit ein negatives Kesulfe.it ergibt. Es kann außerordentlich gefährlich sein, ein positives Ergebnia, d_oh« die

BAD 109830/0666

Τ/ρ 6252 24.4.68 B/We

Anwesenheit von Sichelzellen zu verfehlen. Manchmal ist das Sichelzellenmerkmal nicht innerhalb 30 Minuten zu beobachten, und das Blut muß nach einer wesentlich längeren Zeitdauer wieder geprüft werden.

Ein weiteres wichtiges Problem mit bestimmten der Tests besteht darin, daß sie entweder große Mengen an Blut erfordern oder sie können nicht ganzes Blut benutzen. In solchen Fällen, wo keine ausgearbeiteten Erleichterungen zur Behandlung von Blut vorhanden sind, kann es nicht möglich sein, bestimmte von den oben beschriebenen Prüfverfahren zu benutzen und es kann notwendig werden, daß Blut offensichtlich in einer größeren Menge an ein zentrales Prüflabor zu schicken, wo der Test durchgeführt werden kann«

Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen 2 Minutentest zum Ermitteln des Vorhandenseins von Hämoglobin S zu schaffen» Dieser Test oder diese Prüfung erfordert nur 0,02 ml vollen Blutes und kann deshalb mit einem Tropfen von Blut durchgeführt werden. Weiterhin kann es von ungeübten Personen durchgeführt und ausgewertet werden,,>

Venöses Blut ist nicht erforderlich, und der Test kann von einem Nadelstich erhaltenes Blut verwenden. Dieser Test benutzt die gleichen Vorgänge wie bei dem Goldbergtest, nämlich dass Hämoglobin S eine niedrige !Ferrohämoglobinlösliehkeit zum Unterschied von allen anderen Hämoglobinen mit Ausnahme vielleicht von

■ · ItJ 9 ö 3 U / U b 6 ο

Τ/ρ 6252 24.4ο68 B/We

Hämoglobin H hat. Hämoglobin H ist jedoch ein so seltener Zustand, daß er von vernaehlässigbarer Bedeutung ist. Da ferner der Test lediglich als ein Abschirmungs- oder Siebungstest verwendet wird, wo dieser Test Hämoglobin S als vorhanden zeigt, folgt diesem normalerweise einer der oben beschriebenen quantitativen Tests und höchstwahrscheinlich Elektrophoreses, um die genaue Zusammensetzung des Blutes zu bestimmen. Somit kann bei der Erörterung der Ferrohämoglobinlöslichkeit gesagt werden, daß Hämoglobin S in seiner reduzierten Form in einem Phosphatpuffer in Gegenwart von Natrium- Dithionit unlöslich ist_o Ein Phosphatpuffer wird präpariert, welcher bei der bevorzugten Ausführun^sform von 16,9 g primären Kaliumphosphat und 21,7 g von sekundärem Kaliumphosphat gebildet war, welche mit destilliertem i'/asser zu einer Menge von 100 ml gelöst werden. Der Phosphatpuffer hat eine hohe Wasserstoffionenkonzentration, und der pH-i'ert der Lösung liegt zwischen 6,5 und 6,8. Der Phosphat pufferlösung werden 6g Matriumdithionit hinzugefügt. Das Itfatriumdithionit wird in der Phosphatpufferlösung durch Durchwirbeln oder durch ein Wirbel- oder Mischverfahren gelöst.

Ein schnelles erythrozytisches HUmolysierun_;-.smJ ttel, welches in der Lage ist, mehrfache Verletzungen der erythroaytisclien Vfcnd zu induzieren, wird dann der resullä.erenden Lösung hinzugefügte Bei der bevorzugten iiusiünrungsform wurden 10 ml von einei >:;ii.gen u h poiii ill ü nun,;, in i so tonischem -tetriun-rr. joric (l.aGl) aar vnvh-:V _t:eDildeten L euu_t. üugeiüßt. Die ru-ylij :Πνΐ·<ιο Lcnun^ wv:rje dann

98 3

Τ/ρ 6252 . 24.4.»68 B/w"e

gemisclit und in 10 χ 75 mm Rohre ausgeteilt, wobei 2ml der Lösung in jedes Rohr getan wurde.

0,02 ml von dem vollen Blut wird dann in eine der 10 χ 75 mm Röhren getan und durch Wirblung oder seitliches Verschwenken oder durch mehrfaches Umdrehen gemischte Dann wartet man lediglich maximal 2 Minuten_e ^enn die Lösung in dem 10 χ 75 mm Röhrchen opalisierend, rötlich oder durchscheinend ist, ist das Resultat negativ und es ist kein Hämoglobin S in dem zu prüfenden Blut vorhandene Zur Unterstützung bei der Ermittlung der Resultate kann eine weiße Karte mit einer schwarzen Linie hinter dem Prüfröhrchen angebracht werden. Wenn man nach zwei Minuten die scharze Linie sehen kann, würden die Resultate des Testes negativ sein. Wenn man die schwarze Linie nicht sehen kann, ist das Resultat positiv und besagt, daß Hämoglobin S vorhanden ist. Das Resultat ist spannend und die weiße Karte ist gewöhnlich aum Auffinden des Resultate der Prüfung nicht erforderlich. Die präparierte Lösung gemäß dem oben genannten Verfahren würde über 50 Prüfröhrchen füllen und es könnten somit 50 Teste durchgeführt werden. Es hat sich herausgestellt, daß die Lösung mit dem erythrozyt-ischen hämolysierenden Mittel mindestens sechs.Wochen unter Kühlung und die Lösung sogar noch länger aufbewahrt werden kann, wenn das erythrozytische hämolysierende Mittel und das Reduktionsmittel besonders aufbewahrt werden.

Die Teste oder Prüfungen können weiterhin dadurch abgeändert werden, daß nur ein Tropfen des Puffers, des Re-duktionsmittels

,-,: 10 9 8 3 0/0666

BAD ORIGINAL

-13-Τ/ρ 6252 24.4.68 B/We

und der hämolysierenden Mittellösung auf eine Glasplatte aufgebrachtuund dann weniger als ein Tropfen Blut von einem Stab
in die lösung getan wird* Wenn die Glasplatte über einem Hintergrund mit einer linie gehalten wird, welche unterhalb der Stelle verläuft, wo der Test durchgeführt wird, ist die Linie in zwei
Minuten entweder sichtbar, wenn das Resultat negativ ist oder
sie ist durch die Trübung der Lösung und der Blutmischung blockiert, wenn Hämoglobin S vorhanden ist. Dieses würde eine Massensiebung oder -abschirmung von Blut in der einfachsten und in der elementarsten Form ermöglichen. Ferner können beiden oben bezeichneten Prüfungen von Personen durchgeführt werden» welche beim Prüfen
von Blut ungeübt sind, da sie nur einen Tropfen von 0,02 ml von dem vollen Blut in einer vorpräparierten Lösung benötigen und
durch Augenschein bestimmen müssen, ob die resultierende Lösung durchscheinend oder trüb ist, was zur Bestimmung dient, ob
Hämoglobin S vorhanden ist.

Zum Zwecke der Darstellung der Erfindung sind in den Zeichnungen (| gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen dargestellt,

Fig. 1 ist eine Vorderansicht einer Prüfvorrichtung nach der Erfindung vor der Hinzugabe von vollem Blut.

Fig. 2 zeigt die Vorrichtung nach Figo 1, nachdem Blut mit Hämoglobin S zu der Prüflösung zugetan worden ist, welche
ein positives Resultat ergibt.

Fig. "3 ist eine Draufsicht auf eine Glasplatte, welche zum

10 9 8 3 0/0666

BADORlGiNAL

Τ/ρ 6252 · 24.4.68 B/We

Massenabschirmen von Blut zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens von Hämoglobin S verwendet wird.

Die grundliegende Erfindung wird durch Präparieren einer Phosphatpufferlösung durchgeführt, wie oben beschrieben worden ist, d.h.,· 21,7 g von sekundärem Kaliumphosphat (K₂HPO,) werden mit 16,9 g von primärem Kaliumphosphat (KE₂PO₄) gemischt und mit destilliertem Wasser auf 100 ml verdünnt.

Ein Reduktionsmittel in der form von 6 g von Hatriemdithionit wird dann mit dem Kaliumphosphatpuffer gemischt und in dem Puffer durch Wirbeln, Quirlen oder anderen geeigneten Mitteln gelöst.

Dsehämolytische Mittel wird dann dem Phosphatpuffer und der Reduktionslösung zugefügt. Es stehen viele Arten von hämolytischen Mitteln zur Verfügung,» Ein bevorzugtes hämolytisehes Mittel ist jedoch eine 2$ige Saponinlösung in isotonischem Natriumchlorid. Es hat sich herausgestellt, daß diese für ein schnelles flämolysieren besonders wirksam ist» Saponin (C^JE Ο17) is* ein Ausdruck, welcher für zwei Gruppen von Pflanzenglukosiden verwendet wird, welche die Möglichkeit haben, rote Korpuskeln bei sehr großen Verdünnungen zu hämolysieren. Die Schnelligkeit der Hämolyse unter Benutzung dieser Saponine hängt zu einem großen Ausmaß von den Pflanzen ab, von welchen ein besonderes Saponin erzeugt wird, der Reinheit des Saponine und möglicherweise sogar, wo die besondere Pflanze gewachsen war» Es hat sich herausgestellt,

109830/0666

BAD

T/p 6252 24.4.68 B/We

die von d.er ünna Glenwood Chemical Company, 83 Summit Street, Tenafly, Hew Jersey, unter dem Warenzeichen Sapolysin und von aer Firma Coulter El electronics Company von Hialeah, Florida erzeugten Saponine in dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wirksam sind. Es sind jedoch auch andere Saponine entsprechend den Lehren der vorliegenden Erfindung mit der Ausnahme wirksam, daß diese mit weniger hämolytisehen Wirkungen natürlich längere Zeit zum Lösen der roten Zellwand und Freigabe des Hämoglobin in Anspruch nehmen« In diesem Fall wird die Wartezeit über die zwei Minuten hinaus verlängert.

Die 10 ml von der 2$igen Saponinlösung in isotonischem Natriumchlorid werden mit dem Phosphatpuffer und der Reduktionsmittellösung gemischt» Dann wird die resultierende Lösung in 10 χ 75 mm Prüfröhrchen in Mengen von 2 ml ausgeteilt. Als Unterstützung beim Bestimmen des Endpunktes der Prüfung werden die Teströhrchen 10 mit der Testlösung 12, wie in Fig. 1 dargestellt ist, vor einer Testkarte 14 aufgestellt« Die Karte H hat eine schwarze Linie 16, welche waagerecht über deren Mitte verläuft. Die Testlinie 16 ist durch die Lösung 12 und das Teströhrchen 10 sichtbar. Eine Sahlipipette (0,02 ml) 18 wird dazu benutzt, um 0,0-2 ml von vollem Blut in das Prüfröhrchen 10 zu füllen und mit der Lösung 12 zu mischen. Das Blut von der Pipette 18 und die Lösung 12 werden dann durch Wirbeln, seitliches Verschwenken oder mehrfaches Umkehren gemischt. Dann läßt man das Prüfröhrchen ungefähr 2 Minuten stehen·

109830/0666

Τ/ρ 6252 24.4.68 B/We

Am Ende der zwei Minuten, ist, wenn, wie in Hg. 2 dargestellt, die Lösung 12· einschließlich des Blutes und der ursprünglichen Testlösung 12 wolkig oder trüb infolge des Mederechlages ist, welcher aufgrund der Unlöslichkeit des Hämoglobin S in einem Phosphatpuffer in Gegenwart von Katriumdithionit hervorgerufen wird, das Ergebnis positiv und zeigt die Anwesenheit von Hämoglobin S an. Die Trübung der Lösung kann leicht durch die Tatsache festgestellt werden, daß die Linie 16 nicht länger durch die neue Lösung 12' und das Prüfröhrchen 10 zu sehen ist. Wenn die Linie 16 sichtbar ist, bedeutet das, daß das Ergebnis negativ und kein Hämoglobin S vorhanden ist. Las negative Ergebnis kann also dadurch gesehen werden, daß beobachtet wird, ob die resultierende Lösung 12' opalisieren, rötlich oder durchsichtig ist«,

Ein Verfahren von Massenabschirmen oder Masaenabsieben von Blut für Hämoglobin S ist in Hg. 3 dargestellt. Ein Tropfen der Lösung 12 von Hg. 1, welcher die Mischung des Phosphatpuffere, des Reduziermittels und des hämolytisehen Mittels enthalt, wird in Abständen 20 auf eine Glas- oder durchsichtige Platte 22 aufgebracht. Die Glasplatte 22 wird auf einen Hintergrund 24 gelegt, welcher mit Linien 26, 28 und 30 versehen ist, welche waagerecht über deren ganze Breite verlaufen. Es werden dann Proben von Blut durch einen Stab hinzugefügt, welcher in Blut getaucht und in der Lösung an den Stellen 20 herum bewegt ist. Nach zwei Minuten wird jede der Stellen 20 beobachtet. Wenn die Linien 26, 28 oder 30 bei einer besonderen Stelle 20 durch die zu prüfende Blut- Lösungsmischung zu sehen sind, ist das Prüfergebnis negativ. Wenn die

109830/0666 BAD original

Τ/ρ 6252 24.4.68 B/We

besondere Linie 26, 28 oder 30 durch, die Blut- Prüflösungsmischung nicht zu sehen ist, ist das Ergebnis positiv.

Die oben beschriebene Pufferlösung kann durch Lösen von 17,7g von sekundärem Kaliumphosphat in kohlensäurefreiem destillierten Wasser gebildet werden, und der Rest des Verfahrens zur Erzeugung gleicher Resultate ist derselbe.

^BAD ORIGINAL 109830/0666

Claims (1)

1. -18- I7/3363

   Τ/ρ 6252 24.4.68 B/we

   Patentansprüche

   (λ). Verfahren zum Prüfen von Blut auf Vorhandensein von Hämoglobin S, dadurch gekennzeichnet, daß ein hoch ionischer Konzentrationspulfer vorgesehen, ein Reduktionsmitoel dem Puffer zugefügt, ein erythrozytisches, hämolysierendes Mittel dem Puffer und der Reduktionsmittellösung zugegeben und dann ein abgemessener Betrag an Blut der Puffer- Reduktionsmittel- und Hämolysierungsmittel- ^ lösung nach deren Mischen hinzugetan wird, und nach einer bestimmten Zeitspanne die resultierende Lösung beobachtet und bestimmt wird, ob sie trüb und Hämoglobin S vorhanden, oder ob die resultierende Lösung durchsichtig ist, was anzeigt, daß Hämoglobin S fehlt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erythrozytische, hämolysierende Mittel aus einer Saponinlösung besteht.

   ™ 3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der hoch ionische, Konzentrationspuffer aus einem Phosphatpuffer besteht.

   4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeicnnet, daß die Pufferlosung eine Mischung aus sekundärem Kaliumphosphat und prinäran Kaliumphosphat bei einer hohen Wasserstoffionenkonzentration enthält.

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorsehen eines Puffers und Hinzufügen eines Reduktionsmittels in dem Verhältnis erreicht wird, wie es durch Mischen von 21,7g von

   109830/0666

   BAD ORIGINAL

   Τ/ρ 6252 ' 24.4.68 B/We

   sekundärem Kaliumphosphat und 16.9 g von primärem Kaliumphosphat mit destillierten ffasser auf 100 ml und Hinzufügen des Reduktionsmittels in der Form von 6g von Natriumdithionit zu der Phosphatpuxierlösüng erreicnt würde.

   6. Veriahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dab die Pufferlösung sekundäres Natriumphosphat enthält.

   7. Veriahren nach Ansprucn I₁ dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel aus Hatriumdithionit besteht.

   8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüflösung in den gleichen Verhältnissen gebildet wird, wie sie durch Vorsehen von 100 ml einer Mischung des Phosphatpuffers und Reduktionsmittels und 10 ml einer Saponinlösung erreicht wird, deren Konzentration von ihrer erythrozytiscnen, hämolysierenden Fähigkeit abhängt.

   Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß das erythrozytisehe, hämolysierende Mittel aus einer üaponinlösung von niedriger Konzentration bestent.

   1ü. Verfahren nach Anspruch 1, dadurcn gekennzeichnet, daß die Puifermittel-, Reduktionsmittel- und erythrozytisehe, hämolysierende Mittellbsun*. in einen durchsichtigen Behälter eingebracht und 0,02 ml von vollem Blut hinzu_feetan wird.

   109830/0666 ^BAD original

   Ι/ρ 6252 24.4.68 B/tte

   11, Produkt zum Prüfen von ganzem Blut auf Hämoglobin S, dadurch gekennzeichnet, daß es eine hoch ionische KonzeBtrationspufferlösung enthält, welche mit einem Reduktionsmittel und einem erythrozytischen, hämolysierenden Mittel gemieofet ist.

   12. Produkt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die hoch ionische Konzentrationspufferlüsung aus einer Bbosphatpuffer-

   a* lösung besteht.

   13. Produkt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das erythrozytische, hämolysierende Mittel aus einer Saponinlösung besteht.

   14. Produkt nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Saponinlösung aus einer 2$igen Saponinlösung besteht.

   15. Produkt nach Anspruch Η, dadurch gekennzeichnet, daß die

   P erythrozytische, hämolysierende Mittellösung 10Ji Eaumanteiie von der Menge der hoch ionischen Konzentrationepuffer- und Reduktionsmittellösung beträgt.

   16. Produkt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel aus Natriumdithionit besteht.

   17. Produkt nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus einer Mischung aus primärem Kaliumphosphat, und sekundärem Kaliumphospliat in Lösung besteht.

   BAD ORIGINAL 109830/0666

   Τ/ρ 6252 24.4.68 if/We

   18. Produkt nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Kaliumphosphat in Gewichtsverhältnie zu dem sekundärem Kaliumphosphat von 16,9 zu 21,7 besteht.

   19. Produkt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer eine sekundäre Natriumphosphatlösung ist.

   ORIG/_NAL

   109830/0666

   Leerseite