CN1630817A - 哺乳动物中样品鉴定的方法以及进行该方法的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于研究哺乳动物的生物样品中至少一种组分的方法以及进行该方法的试剂盒，其中所述方法包括下列步骤：(a)给予哺乳动物至少一种标记物；(b)等待足以使至少一种标记物到达样品取出位置的时间；(c)从哺乳动物中取出样品；(d)如果至少一种标记物或其衍生物在生物样品中可检测，研究生物样品中至少一种标记物或其衍生物的存在和/或量；(e)研究生物样品中的分析物。

Description

哺乳动物中样品鉴定的方法以及进行该方法的试剂盒
本发明涉及取自排泄物的样品的方法，哺乳动物的体液或作为组织样品，可根据样品来源鉴定，并且这样可清楚地指定样品的供体，样品可研究分析物。此外，发明的目的是使用此方法的试剂盒。
诊断方法，监控人的治疗措施进程、预防的常规研究和法医医学研究的方法通常包括实验室中样品的分析研究，例如取自试验者的血液或血清样品，以及试验者排泄物的研究，例如尿。由于多种现有的动物的医学诊断和治疗方法，现在许多动物样品的分析方法非常普通。特别与集约畜牧相关产生的问题，如由于喂食动物饲料或混合非法食物添加剂至动物群中引起的BSE疾病，非法食物添加剂以激素和/或抗生素制备的形式，使农业中动物群的定期对照研究的扩展成为必要。
在此情况下，样品的任何分析研究仅在如果研究所得的结果也可清楚地指定给各个样品供体时有意义，以随后在评估试验结果中开始正确反应。
不断地发展新分析和试验方法作为科学技术进步的部分。分子生物的进步例如可使用以DNA分析为基础的一系列检测方法，人或动物中某些疾病通过这些方法可被诊断。
许多更新的分析和检测方法也应用于法医医学，或由于后者一贯更具挑战性的任务，它们的发展归功于它，例如用于运动员中掺杂物质(doping substance)的检测或用于车辆驾驶员中药物检测的具体试验方法。
由于多种使用的分析方法及它们的复杂性，高标准预期自技术设备和实验室中进行这些研究的人员。通常许多样品必须用现代分析仪器同时研究，因此混淆样品的问题不可避免地产生，从而导致关于样品供体的研究结果的不正确分配。此问题不是新的且甚至被恶化，尤其通过新分析方法的迅速发展和对于它们使用的相关上升需要。
因为待分析样品混淆或交换的结果不同但通常不理想，如何解决这个问题已有一整套建议。
这些解决办法的尝试主要涉及研究实验室中工作人员改进的组成，下列某些行为规范旨在使样品混淆的危险最小化。然而，因为这些分析方法中的许多操作步骤由实验室人员进行，由于人误差引起的混淆不能完全去除。
知道这一点，样品待进行的各操作步骤的计算机-控制的监控广泛使用，例如用计算机-可读的代号标记样品管，从而各样品可在整个研究过程中追踪，以样品进入为开始并包括处理和储存实验结果。所以此计算机-监控和计算机-控制样品分析允许大量的不同样品的平行确定，没有混淆的显著危险。
然而本领域普通技术人员明白即使监控实验室中待研究样品和分配实验结果给这些样品的最聪明的系统，和此样品供体的分配，不能完全去除样品的混淆或交换，因为仅仅样品或其试验结果的不适当标记可发生。
所述样品的混淆或交换的问题在应用领域中尤其增加，在这些领域中试验结果可用作针对样品供体的控告证据或在来源于牲畜动物样品的情况中，用作针对动物所有者的控告证据。在这些情况中存在试验者或所有者的特殊兴趣，损坏试验样品以防止产生控告证据。
然而，尤其在这些情况中清楚地分配试验结果给样品供体特别重要，由于某些法律条款通常仅可这样执行。
关于这个问题，已存在于前面防止损坏样品的领域的解决方法的尝试专门涉及监控取出样品。例如监督从参与美沙酮治疗的试验者中获得尿是常规操作。
然而，即使在获得尿样中对试验者最聪明的监控和监督并不完全防止样品的交换。在德国120,000-140,000个吸毒成瘾者中有20,000个用美沙酮治疗。未来这个数字预期有大量的增加。由于美沙酮病人经常用其它麻醉药及巴比妥酸盐和镇定剂，病人所用物质的控制在治疗上是必需的。
根据使用美沙酮治疗的指南，尿必须至少一周检查一次，或在某些情况下，甚至更频繁。通常，在观察中获得尿样在常规医生办公室中不可能，因为仅存在一个小休息室且一般没有适当配备男性医护人员来陪伴男性美沙酮病人。适于在观察中获得尿样的休息室的建造需要高财政支出。仅仅Duesseldorf健康办公室的这些调查费用达到50TDM。
由于通常观察到的获得尿样的损坏，在用于检测唾液释放中药物的分析方法上进行了越来越多的工作。甚至如果，与使用血液、血浆或尿作为试验样品相反，唾液样品可无损坏性的侵入或侵犯试验者隐私而获得，疏忽的混淆或故意损坏样品的危险仍不能防止。
因此本发明的目的是确保清楚地分配样品给供体，这样以克服前面领域中普遍的问题或劣势。
根据发明，此目的通过提供研究来自哺乳动物生物样品至少一种组分的方法达到，其中方法包括下列步骤：
(a)给予哺乳动物至少一种标记物；
(b)等待足以使至少一种标记物到达样品取出位置的时间；
(c)从哺乳动物中取出样品；
(d)如果至少一种标记物或其衍生物在生物样品中可检测，研究生物样品中至少一种标记物或其衍生物的存在和/或量；
(e)研究生物样品中的分析物。
因此本发明的想法是发现待研究样品可被标记的可能性，防止此标记通过外行会用的方法从样品中去除。所以方法适合例如监控美沙酮治疗及掺杂物检查。有优势的标记物一般以一系列具体特性为特色。这些标记物对哺乳动物机体产生药物副作用，以根据发明在血液、尿或其它体液或身体排泄物中检测这些标记物必需的浓度。
衍生物从至少一种标记物中具体形成，也可用于代替后者。对“衍生物”要理解的是所有后续产物产生，作为试验者机体或取出样品的化学转化的结果，然而其中所有后续产物排除，这些产物不专门归于试验者机体或取出样品中具体标记的转化。
具有优势的是如果标记物溶于液体，液体的一般味道例如果汁不由于添加改变，或在水中溶解后，所得溶液没有令人不快的味道由标记物引起，因此试验者可自愿喝含标记的液体。
有优势的标记物特征在于它们通过肠粘膜迅速吸收并从试验者尿中排泄。进一步的优势是如果尿样中这些标记物可以尽量简单方式检测，检测方法已在化学研究实验室中建立例如临床分析化学的常规方法。根据发明，试验者吸收后使用未代谢的标记物较佳。
优选标记物是糖或糖衍生物例如阿拉伯糖、赤藓酮糖、肌醇、顺式-肌醇、甘露醇、山梨糖、鼠李糖、山梨醇、木糖和木酮糖，它们溶于水且可通过酶试验方便地检测。
也有优势的是使用类异戊二烯、脂类、糖类、多羟基化合物、聚乙二醇、这些物质的衍生物或混合物作为标记物。
尤其优选的是使用根据发明的方法在研究尿样中。为此，标记物或多种标记物的组合溶于液体，液体经口给予，试验者在排尿前约30到60分钟喝下液体。聚乙二醇或其混合物用作研究尿样的标记物最为优选。
同时给予多种标记物尤其优选，其中通过结合标记物以发展某一属于各样品的数字代号是可能的。为了提高抵抗损坏的安全，优选的是同时给予至少2种标记物，特别优选的是至少3种，尤其特别优选的是至少5种。使用总共n种标记物，在双数字系统中存在2n-1种不同组合。因此损坏试验者的样品时不可能的，因为试验者必须知道标记物的化学性质，他的尿样的数字代号和建立代号所根据的标记物的序列。
给予标记物可以不同的方式完成。对“给予”要理解的是导入一种或多种标记物到样品供体的机体中。根据发明，标记物或多种标记物可给予于样品供体，肠胃外或口服较佳。尤其优选的是标记物或多种标记物通过消化管吸收，在吸收中没有标记物的代谢发生。
取决于至少一种给予的标记物的类型和待取出样品的类型，取出待研究样品前，在样品取出前等待一段足够长的时间是必要的。时间长度代表至少一种标记物需要到达样品取出位置的时间。在从现存与样品供体分离的组分中取出样品的情况中，例如来自身体排泄物样品取出，时间要理解为直到至少一种标记物存在于可分离的组分且此组分从样品供体中分离所需的时间。必须等待的时间可根据经验确定，然而在大部分的情况中，相应的值或方法的确定在前面的领域中已知(van Rossum，J.M.：药物作用的动力学(Kinetics of Drug Action).Handbuch derexperimentellen Pharmakologie，第47卷.Springer，Berlin 1977；Forth，W.：Allgemeine und spezielle Pharmakologie and Toxikologie.BibliographischesInstitut和F.A.Brockhaus，Mannheim 1988)。
样品取出以不同的方式进行，取决于待研究的样品类型。在分析身体排泄物的情况中，部分样品吸收入样品管中，在这段时间后准备进一步研究。在研究人尿或粪便样品中，样品通常可由试验者本身提供，仅仅给了试验者一个样品管。就从体液或组织样品中取出样品而言，对试验者直接做手术通常是必要的。在此，从试验者中获得血液可在用可随意使用的小刀刺或切割皮肤后用移液管完成或-大量-刺穿静脉后用注射器或血液收集管(德国人：Venule)。对于研究液体，后者通过腰部、枕下或心室穿刺获得。
“生物样品”意味着指定用于分析研究的哺乳动物的组分。这里相关的是身体排泄物、体液或组织样品。构成样品的组分可包括哺乳动物机体的组分，在样品取出的时间时仍存在于哺乳动物中，以及哺乳动物先前的组分。
“身体排泄物”或“排泄物”理解为尿、粪便、来自唾液的分泌物、牛脑、眼泪和汗腺。
“体液”理解为哺乳动物机体的胞外液像血液、血清和液体。
“哺乳动物”理解为除了这类动物，也有人。
较佳的是，从哺乳动物中取出或排泄的样品是身体排泄物、体液或组织样品。
“组织样品”理解为通过活哺乳动物机体的直接手术获得相同分化细胞的组成，以及这些细胞的胞内物质。毛发样品和皮肤的脱落部分也理解为在这个定义中的含意中。
取决于样品的类型且至少一种待检测的标记物，各样品必须在分析方法前制备。制备步骤可包括用于分离固体的离心、液体样品中不溶的物质例如尿、固体样品的溶解或悬浮例如粪便、使用Centricons的离子交换层析的浓缩、用合适试剂沉淀如硫酸铵、分析方法所需pH值的调节、样品的均化如通过超声波降解或使用振动式细胞搅拌机以，例如能够研究来自原先完整组织的组分，溶解样品中所用物质的分离例如洗涤剂和其它本领域普通技术人员已知的制备步骤。
许多酶、免疫、质谱和电泳检测方法及这些方法的组合可用于确定样品中至少一种标记物的存在或缺乏。较佳的是，检测通过偶联的GC/MS或HPLC/MS方法或通过HPLC或GC完成。这些方法允许很有时间效率的研究，具体是液体样品或由于它们的制备，转移至液体的样品。同时，这些检测方法允许高度自动化，因此多种样品可在短时间分析，就层析图和情况可能而言，参考物的质谱分步分离模式已存在于计算机评估单元，至少一种标记物的实际检测也大为简化。
如果它确定为所用分析方法的评估结果，原先给予的至少一种标记物存在于研究样品中，随后这允许清楚地分配样品给试验者。如果此要求实现，即样品来自被研究的试验者，进行此样品的实际研究，或另外进行第二种样品用于分析物的实际研究。
“分析物”理解为至少一种化学物质，其中关于存在的知识，如情况允许，样品中它的浓度也允许对样品供体过去、预期或现在的情况做出结论。作为例子，关于不正确机能的结论-因为不完全-通过试验者中肾小管(糖尿)从尿中再吸收葡萄糖在分析物浓度知识的基础上可行，分析物如尿样的尿中葡萄糖浓度，通常通过葡萄糖氧化酶(GOD)或己糖激酶来酶确定。分析物可进一步为毒品、药、先前命名物质的代谢物，样品中它的检测产生试验者行为或治疗的信息。
除了根据人类医学中发明的方法使用，也在兽医领域和农业中存在多种更多应用。方法可有利地用于在农业大型畜牧中监控对使用食物添加剂的规章的遵守。
例如如果研究从大猪(mast pig)中获得的样品中生长激素或抗生素或它们的代谢物的存在，使用根据发明的方法可防止大猪群所有者损坏待研究样品的问题。
在此，尤其那些标记物具有优势，它们在动物中保持一段长时间-在整个长大的持续时间的理想情况中-仍连续地以可检测的量存在，例如在身体排泄物中。为此原因，那些标记物具有优势，它们可作为时间-释放试剂给予动物，例如由于发生通过肠粘膜的时间-延迟但仍连续的吸收，所以至少一种标记物在更长的时间中可检测，如在身体排泄物中像动物粪便。特别适合的样品是用其进行研究至少一种标记物及检测或浓缩确定至少一种标记物。
本发明的另一目的是在哺乳动物中用于样品鉴定所用描述方法的试剂盒，其中根据发明的试剂盒包括在容器中的标记物，如片剂容器以及情况可能，意味着给予至少一种标记物给哺乳动物。
如果试剂盒也包含至少一种参考物用于检测标记物或多种标记物，这是尤其有利的。
根据发明的试剂盒较佳的是饱含，对于口服标记物，这些标记物以单个可溶于水的冒泡片剂的形式。另外，这些冒泡片剂也可包含标记物如多种标记物的混合物。随后各物质代号可从片剂容器的标签中取得。
试剂盒可包括不同浓度标记物的冒泡片剂，相应于标记给予的人群，因此这些标记物可用于如孩子和成人，没有到达试验者中产生药物副作用的标记物浓度。
如果包含在试剂盒中的片剂容器提供计算机-可读的代号，这是尤其有利的。旨在标记美沙酮病人的尿样的试剂盒较佳的是包含片剂、胶囊或类似地应用形式，待给予的美沙酮及标记物混合物的量都一起可用。
根据发明的试剂盒的进一步有利的实施方案包括多种参考物，通过它标记物可容易地在样品层析分析中鉴定，例如在尿样的研究中。
例如，在用美沙酮治疗的病人尿样的研究中，安瓿管也可存在于根据发明的试剂盒中，安瓿管包含根据所选层析方法在适当的运载体方式中可溶的标记物的混合物，其中此混合物精确地相应于在对应美沙酮片剂中存在的混合物。
随后在相同的GC柱上跑，可以非常迅速地确定且由于GC分析中标记物的层析峰可确定研究的尿样是否来自用美沙酮治疗的病人。
实施例1
为了进一步对根据发明的方法示范解释，进行标记待研究的样品的实施方案在下面提供。
实施方案涉及待研究的尿样和它后来的研究。试验者接受100-300ml饮用液体，其中1g聚乙二醇600溶解作为标记物。果汁、水和其它对人来说美味的液体可用作饮用液体。
替代聚乙二醇600，单分散片断或单分散片断的混合物也可使用。在此，实验室建立了物质代号。这样的代号在下面作为5个单分散聚乙二醇片断给出。这里“0”代表不存在且“1”代表存在。
  物质     物质
A B C D E
  代号
    1     0     0     0     1     1
    2     0     0     1     0     1
    3     0     0     1     1     0
    4     0     0     1     1     1
    5     0     1     0     0     1
    6     0     1     0     1     0
    7     0     1     0     1     1
    8     0     1     1     0     0
    9     0     1     1     0     1
    10     0     1     1     1     0
    11     1     0     0     0     1
    12     1     0     0     1     0
    13     1     0     0     1     1
    14     1     0     1     0     0
    15     1     0     1     0     1
    16     1     0     1     1     0
    17     1     1     0     0     0
    18     1     1     0     0     1
    19     1     1     0     1     0
    20     1     1     1     0     0
物质A、B、C、D和E对应于聚乙二醇片断的分子量为：
    A     530
    B     574
    C     618
    D     662
    E     706
摄取后，要求试验者排尿前等待至少30分钟且至多4小时。允许试验者在此等待阶段食用更多液体或固体食物。在等待时间中不必监督试验者。试验者取尿不受监督。
样品管用编码工号的条形码标记辨别，也可用计算机-可读的附随标签。所附标签上注释试验者的姓名、理想的研究和标记物的组合或物质代号。发送者在实验室计算机的主数据中保存为工作号。样品和所附标签运送到实验室。所附标签用卡片阅读机输入电脑。工作以这种方式记录。在此，物质组合或物质代号也输入电脑。
为分析聚乙二醇，离心尿，100μl上清液以0.5ml/min(甲醇/水5/95)的流速给到Nucleosil C 100-(C18)，3μm(4.6×125mm)上，并通过用RI检测器检测聚乙二醇来研究。层析峰通过以参考层析为基础的保留时间鉴定为聚乙二醇。
这样，每个研究的尿样可通过所用的不同聚乙二醇片段的物质代号清楚地分配给各试验者。随后研究试验者的分析物，即检测为像海洛因或其衍生物的毒品。
标记体液的糖可以聚乙二醇片段所述相同的方式使用。这些通过酶检测反应从尿或其它体液确定。这所需的分析检测方法在前面的领域中已知(方法和酶分析(Methods of Enzymic Analysis)，Bergmeyer，H.U.编，VCH VerlagsgesellschaftmbH，Weiheim 1986)。
实施例2
对于分析前病人的准备，给予药物救护的病人1ml聚乙二醇400(“标记A”)、600(“标记B”)或400和600的混合物(“标记C”)在100ml果汁中。当病人饮水和要求排尿前等待至少30分钟时，病人在监督之下。那段时间后允许病人不受监控去排尿。随后标记尿管并直接运送到分析处。
分析前，样品制备如下：10ml尿以10500xg离心10分钟。
对于聚乙二醇分析，在柱转换模式中以周围温度等梯度操作层析。因为RI检测限制于等梯度移动相，清除的洗提掖和分析泵相同，包括44％甲醇和56％水。100μl离心尿的上清液自动注入一个用Nucleosil 100 C18，5μm填充的(60×4.6mm)预柱。洗提掖以0.4ml/min的流速和36巴的压力用清除泵传送，小型杂质(matrix impurities)释放到废物中，PEG部分阻滞在固定相上。120秒后，预柱通过六口阀转换到分析泵的洗脱液流中，分析物反冲用于以0.5ml/min的流速和96巴的压力在分析柱，Nucleosil 100 C8 5μm上分离。分析时间花了18分钟。尿层析洗提模式的现象特征用设置40℃的RI检测获得。根据观察到的模式，标记随后诊断为“标记A”、“标记B”或“标记C”，如附图1-3所示。
下列材料和设备用于此实施例：聚乙二醇，pH Eur质量，平均分子量400或600，来自Merck，Darmstadt，德国；HPLC-等级甲醇和乙腈，来自Baker；去离子和纯化的水，用Millipores systems Elix3和MilliQ Gradient A10，InertsilC8-3 5μm，(250×4.6)和Nucleosil 100 C18，5μm(50×4.6mm)HPLC柱，来自Schambeck SFD GmbH，Bad Honnef，德国。HPC-设备：配有100μl进样环的样品注射器S5200、预柱清除泵S2100、完整的脱气装置、六口电动转换阀ProLAB、柱烘箱SFD125-600、偏差型的折射刻度检测器、内过滤器元件PATTM，PEEK 3μm内过滤器获得自Schambeck SFD GmbH，Bad Honnef，德国。分析泵M480，脱气组件degasys DG1310和Windows NT 4.0下的数据获得系统Chromeleon 6.11购自Gynkotec。

Claims (15)

1.研究哺乳动物的生物样品中至少一种组分的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
(a)给予哺乳动物至少一种标记物；
(b)等待足以使至少一种标记物到达样品取出位置的时间；
(c)从哺乳动物中取出样品；
(d)如果至少一种标记物或其衍生物在生物样品中可检测，研究生物样品中至少一种标记物或其衍生物的存在和/或量；
(e)研究生物样品中的分析物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少一种标记物选自类异戊二烯、脂类、糖类、多羟基化合物、聚乙二醇或它们的衍生物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，阿拉伯糖、赤藓酮糖、肌醇、顺式-肌醇、甘露醇、山梨糖、鼠李糖、山梨醇、木糖和木酮糖被选作糖类。
4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少一种聚乙二醇被用作标记物。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对受体非肠道或经口施用至少一种标记物。
6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，从哺乳动物中取出生物样品是通过将尿液收集在收集器中或者用注射器从动脉取出血液或刺穿静脉后用血液收集管取出血液实现的。
7.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，上述生物样品包括身体排泄物、体液或组织。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，上述身体排泄物是尿。
9.如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，上述标记物或多种标记物用GC、GC/MS、HPLC或HPLC/MS检测。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，研究经美沙酮治疗的病人的尿样中的毒品，所述方法包括下列步骤：
(a)给经美沙酮治疗的病人经口施用分子量不同的2n-1种聚乙二醇的组合物，其中n是大于零的整数，优选至少为2，特别优选至少为3，最优选的是5；
(b)等待至少30分钟到最多4小时的时间。
(c)从病人排出的尿中取出尿样；
(d)如情况可能，研究尿样中所给予的聚乙二醇的存在情况；
(e)研究尿样中的毒品。
11.采用上述权利要求中任一项所述方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在一个容器中包括至少一种标记物，优选至少2种，特别优选至少3种，更特别优选至少5种。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在一个或更多容器中包含分子量不同的2n-1种聚乙二醇的组合。
13.如权利要求11或12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括给予至少一种标记物的方法。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括在取自哺乳动物的样品中检测至少一种标记物的方法。
15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测至少一种标记物的参考物。
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