AT411688B - Verfahren zur bestimmung der aktivität von diaminooxidase - Google Patents
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Description
<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Diaminooxdase (DAO; EC 1.4.3.6).
Histamin, ein basisches biogenes Amin, ist eine einfache chemische Substanz mit einem Molekulargewicht von 111 Da. Die IUPAC-Bezeichnung ist 1 H-lmidazol-4-Ethylamin. Es ist das Decarboxylierungsprodukt von Histidin und kommt beim Menschen in allen Körpergeweben, insbe- sondere in Mastzellen und basophilen Granulozyten vor. Die höchste Konzentrationen werden in der Lunge gemessen. Die wichtigsten Funktionen sind: 1) Dilatation der Kapillaren, Erhöhung der Kapillarpermeabilität und Blutdruckabfall.
2) Kontraktionen der glatten Muskulatur, u. a. der Bronchialmuskeln in der Lunge.
3) Induktion einer erhöhten Magensäuresekretion.
4) Erhöhung der Herzfrequenz.
5) Histamin ist der Mediator der allergischen Soforttyp-Reaktion, es ist der wichtigste Mediator bei allergischen Erkrankungen wie Rhinitis allergica (Heuschnupfen) und Asthma bronchia- le.
6) Darüber hinaus ist Histamin der klassische Auslöser einer Urticaria (Nesselausschlag) und spielt bei Medikamenten-Allergien bzw. Unverträglichkeiten eine wichtige Rolle.
Die unerwünschten Wirkungen von Histamin sind Kopfschmerzen, verlegte bzw. rinnende Na- se, Atemwegsobstruktionen, Tachykardie sowie Extrasystolen, weiters Magen- und Darmbe- schwerden, die zu weichem Stuhl bis Durchfällen führen können, und Hypotonie. Oft werden auch Schwellungen der Augenlider, gelegentlich auch urticarielle Exantheme beschrieben.
Histamin wird vom Menschen selbst produziert und in Blut- und Gewebszellen (basophilen Granulozyten bzw. Mastzellen) gelagert und steht zur sofortigen Freisetzung jederzeit zur Verfü- gung. Darüber hinaus kann Histamin auch von aussen in den Körper gelangen, einerseits durch Einatmen oder aber auf dem oralen Weg. Enterozyten produzieren ein Enzym, das Histamin ab- bauen kann, eben die DAO, welches ein Molekulargewicht von 90. 000 kD hat und Kupfer enthält.
Das allgemeine Reaktionsschema der von DAO katalysierten Reaktionen lautet: RCH2NH2 + H20 + O2 = > RCHO + NH3 + H202, wobei der Rest R eine Aminogruppe enthält.
DAO ist hauptsächlich im Dünndarm, in der Leber, in den Nieren und im Blut in weissen Blutzel- len zu finden. Bei Schwangeren wird DAO zusätzlich in der Plazenta gebildet. Schwangere haben etwa 500 bis 1000 mal höhere Blut-DAO-Spiegel als Nicht-Schwangere. DAO wird kontinuierlich produziert und in das Darmlumen ausgeschieden. Bei einem gesunden Menschen wird Histamin- reiche Nahrung daher bereits im Darm von Histamin weitgehend befreit. Das verbleibende Hista- min wird beim Durchtritt durch die Darmschleimhaut von der dort sitzenden DAO abgebaut. Hista- min wird zu Imidazolacetaldehyd und weiters zu Imidazolacetessigsäure zerlegt. Die Co-Faktoren der Diaminooxidase sind 6-Hydroxydopa und wahrscheinlich Pyridoxalphosphat, das Vitamin B6.
Diaminooxidase ist ein empfindliches Enzym, das von verschiedenen Substanzen, wie anderen biogenen Aminen, Alkohol und seinem Abbauprodukt Acetaldehyd und verschiedenen Medikamen- ten, gehemmt werden kann.
Hinsichtlich der klinischen Wertigkeit sind mindestens drei Formen einer Histamin-Intoleranz auf der Basis einer verminderten Diaminooxidaseaktivität hervorzuheben : - Wenige Menschen haben einen angeborenen DAO-Mangel und verlieren diesen auch nicht.
- Während eines Infektes der Darmschleimhaut kann ein vorübergehender DAO-Mangel auf- treten. Nach Abheilen des Infektes normalisiert sich auch die DAO-Aktivität.
- Im Rahmen der Gabe verschiedener aktivitätshemmender Substanzen kann es exogen zu einer verminderten DAO-Aktivität kommen. Dazu gehören vorrangig Alkohol und sein Ab- bauprodukt Acetaldehyd, gewisse aminreiche Nahrungsmittel und viele Medikamente.
In allen Fällen treten die eingangs beschriebenen Symptome mehr oder weniger massiv auf und lassen sich in den meisten Fällen nicht einfach zuordnen. Eine schnelle Abklärung der funktio- nellen Aktivität des Enzyms erlaubt eine rasche und einfache Therapie und die Erstellung eines entsprechenden Diätplans.
Die Methodik des Nachweises der Enzymaktivität im Plasma beruht auf der Eigenschaft der DAO, die Oxidation von Diaminen, wie Histamin, Putrescin (1,4-Butandiamin) und Kadaverin (1,5- Pentandiamin), zu katalysieren (siehe Fig.1).
Die heute übliche Standard-Methode zur Bestimmung der DAO-Aktivität beruht auf der Umset- zung von 1@C-markienrten Putrescin oder Kadaverin mit DAO. Der dabei gebildete Monoaldehyd
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zyklisiert intramolekular mit der Aminogruppe und kann aufgrund der schlechteren Wasserlöslich- keit mit Chloroform (CHCI3) extrahiert werden. Anschliessend erfolgt die Aktivitätsbestimmung mittels Flüssigszintillationszählung (Tufvesson G ; N: .Determination of diamine oxidase activity in normal human blood serum", Scand J Clin Lab Invest 1969 Sep;24(2):163-8(ISSN: 0036- 5513)).
Diese Methodik weist, obwohl nahezu universell angewendet, essentielle Schwachstellen auf, die bislang einer weiteren Verbreitung der Anwendung dieses Prinzips im Wege standen : spielsweise sind die eingesetzten Reagenzien als giftig bzw. gesundheitsschädlich einzustufen.
Um die Extraktionsausbeute zu verbessern, wurde in einer derzeit angewandten Methode Chloro- form (mutagen, krebserregend) durch Toluol (gesundheitsschädlich, leicht entzündlich, fortpflan- zungsgefährdend, fruchtschädigend) ersetzt. Auch dieses Reagenz ist daher nicht unbedenklich.
Zudem muss das Gemisch aus Plasma und Toluol gefroren werden, um eine brauchbare Trennung von der dann festen Plasmaphase und der flüssigen Toluolphase zu ermöglichen. Weiters ist auch die Reaktivität des Enzyms relativ schwach, so dass mindestens 250 l Probe eingesetzt werden müssen, was eine entsprechend grosse Menge an Extraktionsmittel bedingt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher darin, die bislang zur Verfügung stehenden Methoden zur DAO-Aktivitätsbestimmung zu verbessern und ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, das breit anwendbar und für grosstechnische Reihentestungen geeignet ist. Weiters soll das erfindungsgemässe System einfach handzuhaben sein und demgemäss ohne den Einsatz toxischer Substanzen auskommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Diami- nooxidase (DAO; EC 1.4.3.6), welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Umsetzen einer wässerigen Lösung einer bestimmten Menge eines Diamins, das intramole- kular zyklisiert, nachdem eine der Amingruppen von DAO zu einer Aldehydgruppe umge- wandelt wird, wobei das zyklisierte Molekül in Ethylacetat eine höhere Löslichkeit aufweist als das nicht zyklisierte Diamin, mit DAO, wobei eine der Aminogruppen zu einer Aldehyd- gruppe oxidiert wird und diese Aldehydgruppe intramolekular mit der zweiten Amingruppe zyklisiert, - Extrahieren des zyklisierten Produktes mit Ethylacetat und - Detektieren der Menge an zyklisiertem Produkt.
Vorzugsweise weist das erfindungsgemässe Verfahren die folgenden Schritte auf: - Umsetzen einer wässerigen Lösung einer bestimmten Menge von Putrescin oder Kadaverin mit DAO, wobei ¯1-Pyrrolin (2,3,4-Trihydropyrrol) bzw. 6'-Piperidin (2,3,4,5-Tetrahydro- pyridin) entsteht, - Extrahieren des ¯1-PyTTolin oder 6'-Piperidin mit Ethylacetat und - Detektieren der Menge an ¯1-Pyrrolin oder 6'-Piperidin.
Neben Putrescin und Kadaverin sind aber auch alle weiteren Diamine zur Verwendung im er- findungsgemässen Verfahren geeignet, die - nach DAO-Oxidation einer der Amingruppen zu einem Aldehyd - zur intramolekularen Zyklisierung (durch die Aldehydgruppe mit der zweiten Amingruppe) befähigt sind und das zyklisierte Molekül in Ethylacetat eine höhere Löslichkeit aufweist als das nicht zyklisierte Diamin.
Es zeigte sich, dass die Extraktion des zyklisierten Produktes mit dem ungiftigen und dadurch leichter handhabbaren Ethylacetat im Vergleich zu den toxischen Extraktionsmitteln Toluol oder Chloroform überraschenderweise effizienter und spezifischer ist. So kann mit der erfindungsgemä- #en Extraktion - im Vergleich zur Extraktion mit Toluol - fast die doppelte Menge an zyklisiertem Reaktionsprodukt extrahiert werden.
Vorzugsweise ist das Diamin, insbesondere das Putrescin oder Kadaverin, markiert, besonders bevorzugt radioaktiv markiert, insbesondere mit 13C oder 14C, oder mit einem Farbstoff oder einer chromogenen Gruppe markiert, insbesondere mit einem Fluoreszenz-Farbstoff oder einem Fluoro- gen.
Beim Einsatz von radioaktiv markierten Diaminen, insbesondere Putrescin oder Kadaverin, wird vorzugsweise beim Detektieren ein wasserlöslicher Szintillator, wie der insbesondere ein Phenylxylylmethan-enthaltender Szintillator, Ready Safe Liquid Szintillator (Beckman) eingesetzt.
Dieser Szintillator ist nicht brennbar, biologisch abbaubar, wenig flüchtig und hat eine hohe Kapazi- tät.
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Bevorzugterweise wird die erfindungsgemässe Umsetzung mit DAO in Gegenwart eines Borat- puffers, insbesondere in Anwesenheit von 10 bis 300 mM Boratpuffer, durchgeführt. Durch diese Massnahme kann die Aktivität der DAO im Ansatzgemisch deutlich gesteigert werden (z. B. um das 2,5- bis 5-fache gegenüber einem PBS-Puffer). Dadurch wird die Sensitivität des Testsystems entscheidend verbessert.
Der erfindungsgemässe Test, z. B. realisiert als Radioextraktionsassay, zeichnet sich durch ei- nen hohen dynamischen Messbereich aus. Die Standards können ohne weiteres die Aktivität von 0,03 bis 1 nKat (nano-Katal) abdecken. Aufgrund des exzellent niedrigen Hintergrundes kann die Nachweisgrenze deutlich unter 0,01 nKat/ml liegen. Daher können auch Patientenproben mit nur mehr sehr schwacher DAO-Aktivität zweifelsfrei gemessen und daher korrekt diagnostiziert wer- den. Es zeigte sich, dass die durchschnittliche Wiederfindung von zugesetzter DAO in Plasma mehr als zufriedenstellend ist ; so wurden Werte von 104,5% (bei n = 20) in den ersten Testserien festgestellt. Die Reproduzierbarkeit dieser ersten Testserien war intraassay < 10% ; interassay < 15%.
Das vorwiegende medizinische Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung der DAO-Aktivität in Körperflüssigkeiten. Demgemäss wird daher erfindungsgemäss vorzugsweise die im Verfahren eingesetzte DAO aus der Probe einer Körperflüssigkeit entnommen, insbesonde- re einer Blut- oder Plasmaprobe. Durch die Einfachheit, Robustheit und Sensitivität des erfin- dungsgemässen Systems sind dabei Reihentestungen sogar in grossem Umfang möglich, insbeson- dere da die Mittel zur Durchführung des erfindungsgemässen Tests als Kit in lagerstabiler Form bereitgestellt werden können. Es zeigte sich, dass der bevorzugte Boratpuffer nicht nur zu einer erhöhten Sensitivität der DAO führt, sondern auch die Stabilität des Enzyms entscheidend verbes- sern kann, so dass auch eine längere Lagerung sowohl im Standard als auch in einer verdünnten Probe ermöglicht wird.
Diese hohe Stabilität ermöglicht es, die Reagenzien gebrauchsfertig zu lagern und auszuliefern, was dem Kunden eine deutliche Vereinfachung im Handling und günstige- re Transportkosten bringt. Auch die Verdünnungslinearität von Standards und Proben ist sehr gut.
Damit ist sichergestellt, dass die Aktivität des Enzyms sowohl in der Standardmatrix als auch in der Probe gleich ist und somit klinisch-analytisch richtige Messwerte liefert.
Vorzugsweise wird das Diamin, insbesondere Putrescin oder Kadaverin, als 14C-Putrescin oder 14C-Kadaverin zur Verfügung gestellt, womit auf die an sich bekannte Methodologie im Tufvesson/ Tryding-Verfahren zurückgegriffen werden kann.
Besonders bevorzugt werden die DAO und gegebenenfalls das Diamin, insbesondere Putres- cin oder Kadaverin, in einem Puffer mit einem pH von 7,5 bis 8,5, insbesondere bei etwa 8,0 0,2, bereitgestellt.
Gemäss einem weiteren bevorzugten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur in vitro-Diagnose einer Histaminunverträglichkeit eines Organismus, insbesondere eines Menschen, durch Analyse der DAO-Aktivität in einer Probe einer Körperflüssigkeit, die von diesem Organismus stammt.
Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur in vitro- Kontrolle einer Therapie, umfassend die Einhaltung von histaminarmer Diät, in der Probe einer Körperflüssigkeit.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Testkit, geeignet zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, umfassend jeweils ein oder mehrere der fol- genden Komponenten: - ein DAO-Präparat und/oder eine DAO-Probe - Ethylacetat als Extraktionsmittel 14C¯
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lagerstabiler Form, und, - ein DAO-Puffer und/oder ein Diamin-Lösungsmittel, insbesondere ein Putrescin- oder Kada- verin-Lösungsmittel.
Vorzugsweise ist dabei der DAO-Puffer und gegebenenfalls das Diamin-Lösungsmittel, insbe- sondere ein Putrescin- oder Kadaverin-Lösungsmittel, ein Boratpuffer, vorzugsweise mit einem pH von 7,5 bis 8,5 und gegebenenfalls mit 1 bis 20 %, insbesondere 3 bis 8 %, Glukose.
Eine weitere bevorzugte Kit-Komponente ist ein Szintillator, der die Kriterien biologisch abbau- bar, nicht brennbar, nicht flüchtig und hohe Kapazität erfüllt, insbesondere ein Phenylxylylmethan-
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enthaltender Szintillator, wie der Ready Safe Liquid Szintillator (Beckman). Die hohe Kapazität ist für die Sensitivität des Testsystems günstig.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht beschränkt ist, näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1: die Oxidation von Diaminen durch DAO; Fig. 2 : Vergleich der Extraktion des zyklisierten Produkts mit Ethylacetat bzw. Toluol; Fig. 3 : Vergleich der Reaktivität der DAO mit Boratpuffer bzw. PBS-Puffer; Fig. 4 : Stabilität des als Standard eingesetzten Enzyms im Puffer; Fig. 5 : dieVerdünnungslinearität von Standards und Proben im erfindungsgemässen System; Fig. 6 : dynamischen Messbereich des erfindungsgemässen Systems.
Beispiele :
Beispiel 1: Herstellung des erfindungsgemässen Testsystems
Ein erfindungsgemässer Puffer wird folgendermassen hergestellt:
15,45 g H3B03 (0,07 M)
1,9 g NaOH-Plätzchen
2,5 ml Proclin 300 (0,05%) (2-Methyl-4-isothiazolin-3-on und 5-Chloro-2-methyl-4- isothiazolin-3-on als Stabilisatoren)
250 g Glucose-Monohydrat
5 g BSA(0,1%)
5000 ml Wasser
DAO aus Schwein (hergestellt nach Hata A: Purification and some properties of diamine oxidase from pig kidney and human placenta. Bull Tokyo Med Dent Univ 1976 Jun;23(2):63-70; Kusche J ; RichterH; Schmidt J ; R ; C ; W: Intestinal diamine oxidase : isolation, substrate specificity and pathophysiological significance. Agents Actions 1973 Oct;3(3):182-3) wird mit obigem Puffer auf eine Endaktivität von 1 bis 0,03 nKat verdünnt.
14C-Putrescin wird im obigen Puffer mit einer Aktivität der Originalsubstanz von 4 000 000 cpm/ 5 l sowie Ethanol (Endkonzentration 2%) verdünnt.
Arbeitsvorschrift für den REA zur Bestimmung der Aktivität von DAO in biologischen Flüssigkeiten :
Alle Reagenzien und Proben müssen Raumtemperatur (18 - 26 C) haben, bevor sie im Test eingesetzt werden.
PP-Röhrchen für NSB (Non Specific Binding), Standards, Kontrolle und Proben vorbereiten und beschriften.
1. 100 l Assaypuffer in alle Röhrchen vorlegen (ausser NSB)
2.200 l Assaypuffer in die NSB-Röhrchen pipettieren
3. 100 l Standards, Kontrolle bzw. Probe in die entsprechenden Röhrchen pipettieren
4.50 l Substrat in jedes Röhrchen pipettieren (auch NSB)
5. Alle Röhrchen gut schütteln (Vortex-Mischer)
6. Alle Röhrchen 150 min bei 37 C inkubieren, wenn möglich schütteln
7. In jedes Röhrchen 1 ml Extraktionslösung zugeben, 15 s am Vortex gut mischen
8. Extraktionsgemisch 1 min bei > 3000 x g zentrifugieren
9. 800 l der oberen (organischen) Phase in ein Szintillationsgefäss überführen
10. 1 ml Szintillator in jedes Szintillationsgefäss zugeben, gut mischen
11.
Jedes Szintillationsgefäss 1 min im Beta-Counter zählen
Wobei : Assaypuffer = 50 mM Boratpuffer mit 5% Glucose
Beispiel 2 : Vergleich zwischen der Extraktion mit Ethylacetat und mit Toluol
Durchführung des Ansatzes wie oben beschrieben mit PBS pH = 7,4 als Assaypuffer; als Extraktionsmittel wurden parallel gleiche Mengen Toluol und Ethylacetat eingesetzt. Mit Ethylacetat konnte eine etwa um 50% höhere Extraktionsausbeute erreicht werden. Das heisst, vom umgesetz-
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ten 14 C-Putrescin kann mehr für den analytischen Nachweis verwendet werden. Somit können auch schon sehr geringe umgesetzte Mengen nachgewiesen werden. Damit wird auch die Mes- sung von Proben, die von Patienten mit stark reduzierter DAO-Aktivität stammen, ermöglicht.
Die Ergebnisse sind auch in Fig. 2 gezeigt.
Beispiel 3 : Vergleich der Reaktivität der DAO im Boratpuffer mit der Reaktivität im PBS- Puffer
Durchführung des Ansatzes wie vorher beschrieben. Als Assaypuffer für die Verdünnung der DAO und der Proben wurden parallel PBS pH = 7,4 und 50 mM Boratpuffer mit 5% Glucose einge- setzt. Als Extraktionsmittel wurde in diesem Ansatz bereits das sehr effiziente Ethylacetat einge- setzt. In Abänderung von Beispiel 2 wurden die Standardkonzentrationen für die klinischen Erfor- dernisse adaptiert. Die gesteigerte Aktivität der DAO kommt besonders bei den niedrigen Konzen- trationen sehr stark zum Tragen. Hier kann das Messsignal nahezu vervierfacht werden.
Die Ergebnisse sind auch in Fig. 3 gezeigt.
Beispiel 4 : der Stabilität des DAO-Standards
Das Enzym wurde in verschiedenen Verdünnungen, wie sie als Standardreihe dem Kit beige- packt wird, aliquotiert und bei drei verschiedenen Temperaturen eine Woche lang gelagert. Danach wurden die Verdünnungen parallel in einem Assay gemessen und die Aktivität der DAO bestimmt.
Es zeigt sich, dass nach einer Woche die Aktivität bei allen drei Temperaturen nahezu ident ist.
Aus den allgemein akzeptierten Regeln der beschleunigten biologischen Stabilität bei 37 C kann man ableiten, dass DAO im gewählten Puffersystem mindestens 6 Monate bei 4 C stabil bleibt.
Dies ist eine wichtige Voraussetzung für den Einsatz in der klinischen Labordiagnostik.
Die Ergebnisse sind auch in Fig. 4 gezeigt.
Beispiel 5 : Bestimmung der Verdünnungslinearität von Standards und Proben im erfin- dungsgemässen System
In der anfangs beschriebenen Konfiguration wurden sowohl die Standards als auch verschie- dene Proben mit Assaypuffer verdünnt gemessen. Dabei sieht man über den gesamten dynami- schen Messbereich parallel laufende Kurven. Das bedeutet, dass die in den Proben vorkommende DAO im vorliegenden Assaysystem die gleiche Reaktionscharakteristik gegenüber 14 C-Putrescin hat wie die im Standard eingesetzte DAO aus Schweineniere. Damit wird eine analytisch richtige Aktivitätsbestimmung über den gesamten dynamischen Messbereich sichergestellt.
Die Ergebnisse sind auch in Fig. 5 gezeigt.
Beispiel 6: Bestimmung des dynamischen Messbereichs des erfindungsgemässen Systems.
Unter dem dynamischen Messbereich eines Systems versteht man den Konzentrationsbereich des Analyten, der mit dem Kit erfasst wird. Je grösser dieser Bereich ist, desto weniger Arbeitsauf- wand muss für die Probenvorbereitung (in diesem Fall Verdünnung) geleistet werden. Um eine analytisch korrekte Messung zu gewährleisten, muss auch in den sehr hohen und sehr niedrigen Konzentrationen die Verdünnungsgerechtigkeit und Wiederfindung gewährleistet sein.
Die Grenzen des dynamischen Bereiches sind wie folgt definiert : Nachweisgrenze ist jene Konzentration, die sich durch 3 SD vom Nullwert unterscheidet. Der Nullwert wurde in 13fach-Bestimmungen ermittelt: Mittelwert = 70 cpm, 1 SD = 7 cpm, daher als Nachweisgrenze die Aktivität von DAO bei 91 cpm = 0.00015 nKat/ml.
Das obere Ende des dynamischen Messbereiches wird einerseits durch die Steigung der Kurve festgelegt, andererseits durch die Menge an umsetzbarem Substrat bzw. der Kapazität des En- zyms begrenzt. Da mit dem Testsystem eine DAO-Insuffizienz gemessen werden soll, ist die Obergrenze des dynamischen Messbereiches analytisch nicht relevant.
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Die Ergebnisse sind auch in Fig. 6 gezeigt.
PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Diaminooxidase (DAO; EC 1.4.3.6), gekenn- zeichnet durch die folgenden Schritte: - Umsetzen einer wässerigen Lösung einer bestimmten Menge eines Diamins, das intra- molekular zyklisiert, nachdem eine der Amingruppen von DAO zu einer Aldehydgruppe umgewandelt wird, wobei das zyklisierte Molekül in Ethylacetat eine höhere Löslichkeit aufweist als das nicht zyklisierte Diamin, mit DAO, wobei eine der Aminogruppen zu ei- ner Aldehydgruppe oxidiert wird und diese Aldehydgruppe intramolekular mit der zwei- ten Amingruppe zyklisiert, - Extrahieren des zyklisierten Produktes mit Ethylacetat und - Detektieren der Menge an zyklisiertem Produkt.
Claims (1)
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Diamin, insbesondere Putrescin oder Kadaverin, makiert ist, vorzugsweise radioaktiv markiert, insbesondere mit 13C oder '4C, oder mit einem Farbstoff oder einer chromogenen Gruppe markiert, insbe- sondere mit einem Fluoreszenz-Farbstoff oder einem Fluorogen.3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Diamin, insbeson- dere Putrescin oder Kadaverin, radioaktiv markiert ist und beim Detektieren ein wasserlös- licher Szintillator, insbesondere Ready Safe Liquid Szintillator, eingesetzt wird.4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Umset- zen mit DAO in Gegenwart eines Boratpuffers, insbesondere in Anwesenheit von 10 bis 300 mM Boratpuffer, durchgeführt wird.5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DAO aus der Probe einer Körperflüssigkeit entnommen ist.6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Diamin, insbesondere Putrescin oder Kadaverin, 14 C-Putrescin oder 14 C-Kadaverin ist.7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die DAO und gegebenenfalls das Diamin, insbesondere Putrescin oder Kadaverin, in einem Puffer mit einem pH von 7,5 bis 8,5, insbesondere bei etwa 8,0 0,2, bereitgestellt werden.8. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Diaminooxidase (DAO; EC 1. 4.3.6), gekenn- zeichnet durch die folgenden Schritte: - Umsetzen einer wässerigen Lösung einer bestimmten Menge von Putrescin oder Kadaverin mit DAO, wobei /:). -Pyrrolin (2,3,4-Trihydropyrrol) bzw. /:).1-Piperidin (2,3,4,5-Tetra- hydropyridin) entsteht, - Extrahieren des ¯1-Pyrrolin oder /:).1-Piperidin mit Ethylacetat und - Detektieren der Menge an ¯1-Pyrrolin oder /:).1-Piperidin.9. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur in vitro-Diagnose einer Histaminunverträglichkeit eines Organismus, insbesondere eines Menschen, durch Analyse der DAO-Aktivität in einer Probe einer Körperflüssigkeit, die von diesem Organis- mus stammt.10. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur in vitro-Kontrolle einer Therapie, umfassend die Einhaltung von histaminarmer Diät, in der Probe einer Kör- perflüssigkeit.11. Testkit, geeignet zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend jeweils ein oder mehrere der folgenden Komponenten: - ein DAO-Präparat und/oder eine DAO-Probe - Ethylacetat als Extraktionsmittel 14C¯ - ein markiertes Diamin, insbesondere Putrescin oder Kadaverin, insbesondere 14C- Putrescin oder 14 C-Kadaverin, gegebenenfalls in lagerstabiler Form, und - ein DAO-Puffer und/oder ein Diamin-Lösungsmittel, insbesondere Putrescin- oder Kada- verin-Lösungsmittel.12. Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der DAO-Puffer und gegebenen- <Desc/Clms Page number 7> falls das Diamin-Lösungsmittel, insbesondere Putrescin- oder Kadaverin-Lösungsmittel ein Boratpuffer, vorzugsweise mit einem pH von 7,5 bis 8,5 und gegebenfalls mit 1 bis 20 %, insbesondere 3 bis 8 %, Glukose, ist.
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