KR101467371B1 - 타액 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 급속한 온도 변화 및 pH 변화를 통해 타액 내에 포함되어 있는 단백질을 변성시켜 타액을 정제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종래의 타액 전처리 방법과 비교하여 그 정확성을 더욱 높일 수 있어, 타액 내 미량의 호르몬을 검출할 수 있게 하므로 매우 유용하다. 즉, 타액을 시료로 하는 다양한 분석에 그 전처리 공정으로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

타액 정제 방법{A Method of Purifying a Saliva}
본 발명은 타액 내 호르몬 등의 분석을 위해 호르몬 외에 여타 필요없는 물질들을 제거하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 특정 pH 조절 및 온도 조절을 통해 효과적으로 타액을 정제하는 방법에 관한 것이다.
분석 대상물질인 스테로이드 호르몬들은 콜레스테롤(cholesterol)을 전구물질로 하여 다양한 효소의 작용를 통해 합성되어지는 남성호르몬(androgen), 여성호르몬(estrogen), 황체호르몬(progestin), 부신피질호르몬(corticoid), 그리고 스테롤(sterol)등을 포함한다. 내분비계를 조절하는 스테로이드 호르몬은 그들의 대사에 관여하는 효소의 결핍(enzyme deficiency) 또는 과잉(excess)등에 의한 생물학적 변화가 생기면 질환이 발생하게 되는데, 최근 특정 생리, 병리적 상태에서 관련 스테로이드 호르몬의 변화를 분석한 후 이것을 생리적 기능과 연관 지어 해석함으로써 질환 발병의 원인을 규명하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
다양한 스테로이드 호르몬을 평가하기 위한 분석법이 광범위하게 개발되고 있으며[Endo. J., 2003, 50: 783-792], 이를 통해 1) 활성이 높은 스테로이드들간의 상대적 변화 측정, 2) 대사 경로 상에서의 전구물질과 생성물질 간 대사균형의 변화 규명, 3) 대사 경로 상에서 나타나는 불균형으로부터 이에 관련된 효소의 활성도 등을 측정함으로써 질환에 따른 내인성 물질들의 변화된 대사 과정을 종합적으로 평가할 수 있다.
타액 내에 극 미량의 스테로이드 호르몬들이 포함되어 있으므로, 이들을 정확히 분석할 수 있으면 손쉽게 부신 및 생식소 기능을 파악하고 스트레스 정도, 성기능 이상 등에 대한 정보를 얻을 수 있다.
타액채취는 비 침습적이기 때문에 개인의 하루 주기리듬 (기상~취침)에 맞추어 의료진의 도움없이도 타액 채취가 가능하여 개인의 호르몬생성, 분비의 일주기리듬을 파악할 수있고 아울러 타액에 포함되어 있는 스테로이드 호르몬은 조직에 작용하는 활성형의 호르몬으로 구성되어 있기 때문에 임상적 활용도가 높다 (Wood, 2009)
그러나 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 혈액의 1/100-1/1000 정도로 낮기 때문에 상용화된 호르몬 분석키트로는 분석이 불가능하며 세계적으로도 몇 군데 실험실에서만 측정하고 있다.
타액 내에는 아밀라제 등 소화효소, 박테리아, 미끈거리는 성분의 뮤코당등이 포함되어 있고(Schenkels et al., 1995; Pogrel et al., 1997; Humphrey et al., 2001; Whembolua, et al., 2006), 이들 물질은 타액내에 포함되어 있는 스테로이드 호르몬을 면역측정법을 이용하여 정량분석하는 과정 중, 항원-항체 반응에 영향을 미쳐 호르몬 수치의 변화를 유도할 수 있다 (Tallon et al., 1985). 즉, 단백질 등 다양한 이물질은 항원-항체 반응과정에 교란의 요인으로 작용하여 실제 호르몬 수치와 다른 결과를 나타내므로 정확한 분석이 매우 어렵다.
따라서, 타액시료를 임상적 목적의 호르몬 분석에 이용할 수 있기 위해서는 면역측정법에 적합하도록 정확성(accuracy)과 반복성(repoductivity)을 갖춘 전처리 공정이 필수적이다. 종래에는 타액을 2시간 정도 56℃에서 열처리한 후 타액에 포함되어 있는 스테로이드 호르몬을 분석하였지만 (Howard et al., 1989; Tamate et al., 1997), 그 정확성에 있어서 신뢰성을 갖기 어려웠다.
이에 본 발명자는, 채취한 타액에 포함되어 있는 여러가지 물질들을 효과적으로 제거하면서 분석하고자 하는 스테로이드 호르몬 등을 정확히 검출하기 위해서는 종래의 열처리 방법에서 벗어나 특정 pH 조절 및 온도 조절을 통해 스테로이드 호르몬 검출의 정확성을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 타액 내 호르몬 등의 분석을 위해, 타액을 정제하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 타액을 정제하는 방법을 제공한다:
(a) 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기를 처리하는 단계;
(b) 가열 후 냉각시키는 단계;
(c) 중화 단계; 및
(d) 뮤코단백질(mucoprotein) 제거단계.
특히 본 발명의 방법은 타액 내 존재하는 성호르몬 또는 부신피질 호르몬 등의 스테로이드 호르몬의 정량분석을 위해 타액을 전처리하는 공정으로서, 본 발명의 전처리 후 방사면역측정법을 이용하여 스테로이드 호르몬을 정확히 검출할 수 있다.
타액의 채취는 기상 후 1시간 이내에 이루어지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간별로 채취하여 그 변화 등을 분석하는데 사용될 수 있다.
(a)단계에서 pH 12~14의 강염기는 NaOH, LiOH, KOH, Ca(OH)2 로 구성된 군에서 선택되는 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 1N NaOH를 사용하였다.
또한, 상기 (b)단계에서 가열은 70~90℃의 온도로 이루어지는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 80℃이다. 그리고, 상기 냉각은 예를 들어, 얼음수조를 이용하여 급냉시키는 것에 의해 수행될 수 있다.
그리고, 상기 (b) 단계 후, 원심분리에 의해 타액으로부터 pH 및 열에 의하여 변성된 소화효소 및 박테리아를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (c) 중화단계는 pH 1~2의 강산을 처리하는 것에 의해 수행되는 것이 가장 대표적인데, 특히, 상기 pH 1~2의 강산은 HCl, H2SO4, HNO3로 구성된 군에서 선택되는 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 1N HCl을 사용하였다.
또한, 상기 (d) 단계에서 점액질(뮤코당) 제거는 뮤코단백질(mucoprotein) 분해효소를 처리하는 것에 의해 이루어진다. 상기 뮤코단백질(mucoprotein)은 열에 의해 변성되지 않기 때문에 효소를 이용하여 제거하는 방법을 사용하는 것이다.
이 때, 상기 점액질(뮤코당) 분해효소는 β-Nacetylhexosamine-[1→4] glycosidic bond을 분해할 수 있는 효소면 어느 것이나 가능하며, 본 발명의 일 실시예에서는 hyaluronidase type 1 (H 3506, Sigmaaldrich chemical co.) 500 IU를 사용하였다.
그리고, 뮤코단백질(mucoprotein) 제거 후, 원심분리에 의해 뮤코단백질(mucoprotein) 분해효소를 제거하는 단계를 추가로 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
마지막으로, 완충액을 혼합하는 단계를 추가로 수행함으로써, 타액 정제공정을 마무리할 수 있다. 이 때, 상기 완충액은 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 젤라틴은 타액 내 미량의 에스트라디올이 균질하게 분포하도록 유도하고 타액이 분석과정 중 외부 공기에 노출되더라도 최적의 산도를 유지하도록 한다.
본 발명은 타액 내 스테로이드 호르몬, 예를 들어 에스트라디올, 테스토스테론, 코티졸 등의 농도를 정확히 측정하기 위해, 급속한 온도 변화 및 pH 변화를 이용하여 타액 내 단백질을 변성시키는 공정을 이용함을 특징으로 하고 있다. 이러한 정확한 호르몬의 농도분석에 의해 여성의 생리활성 진단, 스트레스 진단 등에 필요한 정보를 수집할 수 있다.
본 발명은 급속한 온도 변화 및 pH 변화를 통해 타액 내에 포함되어 있는 단백질을 변성시켜 타액을 정제하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종래의 타액 전처리 방법과 비교하여 그 정확성을 더욱 높일 수 있어, 타액 내 미량의 호르몬을 검출할 수 있게 하므로 매우 유용하다.
도 1은 종래 열처리 방법 및 산도 (pH) 변화/뮤코당분해를 병행한 본 발명의 방법으로 타액시료 전처리 후 흡광도 (A280nm)의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 2는 종래 열처리 방법 및 산도 (pH) 변화/뮤코당분해를 병행한 본 발명의 방법으로 타액시료 전처리 후 스테로이드 회수율의 차이를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"대상" 또는 "개체"는 동물, 몇몇 구체예에서는 포유동물, 그리고 다른 구체예에서는 치료, 관찰 또는 실험 대상인 인간을 의미하는 것이다. 특히, 본 발명에서는 인간 여성을 대상으로 하였다.
"시료" 또는 "샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 액형 조직일 수 있다. 본 발명에서는 타액(saliva)을 사용한다.
"스테로이드호르몬(steroid hormone)"이란 4원자고리 탄화수소인 스테로이드 고리(사이클로펜타노하이드로페난트렌 고리)를 기본 구조로 가진 호르몬으로, 고등동물이나 사람에게서 볼 수 있는 웅성·자성의 생식선 호르몬(성호르몬)이나 부신피질 호르몬 등이 포함된다.
"생식선 호르몬 또는 성호르몬"이란 척추동물의 암컷·수컷의 생식선에서 분비되는 호르몬으로 생식기의 발육을 촉진시키고 그 기능을 유지시키는 역할을 한다. 호르몬을 분비하는 생식선은 웅성의 경우는 정소 중의 간세포(間細胞)이고 자성은 주로 난소(卵巢) 중의 여포나 황체이다. 생식선뿐만 아니라 부신피질로부터도 성호르몬의 작용을 갖는 물질이 분비된다. 또, 임신 중에는 태반으로부터도 성호르몬이 분비되어 임신유지에 기여한다. 성호르몬은 모두 스테로이드계 물질이다
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 타액 속에 존재하는 특정 단백질, 호르몬 등의 분석을 위해 필요한 전처리 공정에 관한 것으로, 가장 바람직하게는 스테로이드 호르몬 분석을 위해 스테로이드 호르몬을 제외한 여타 다른 물질들을 효율적으로 제거할 수 있는 타액 정제방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예로서, 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기를 처리하는 단계;
(b) 가열 후 냉각시키는 단계;
(c) 중화 단계; 및
(d) 뮤코단백질(mucoprotein) 제거단계.
이 때, 상기 (b)단계 이후, 원심분리에 의해 타액으로부터 pH 및 열에 의하여 변성된 소화효소 및 박테리아를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하고, (d)단계 후, 완충액을 혼합하는 단계를 추가로 수행하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 각 공정을 중심으로 이하 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 분석 시료로 "타액(saliva)"을 사용하는 경우를 위한 전처리 공정에 관한 것이다.
그 동안 호르몬의 농도는 혈액에서 주로 측정하였다. 내분비학 관점에서 보면 혈액은 호르몬의 표적기관이 아니라 단순한 호르몬의 이동매체이다. 대부분의 혈중 단백질계열 호르몬 (성장호르몬, 인슐린 등)은 물에 잘 용해되며 혈중에서는 활성화된 형태로 존재하지만 부신피질, 성선에서 생성되는 스테로이드는 물에 잘 녹지 않기 때문에 다른 매체 (운반단백질)와 결합하여 혈중에 존재한다. 스테로이드가 운반매체와 결합되어 있을 때는 표적기관의 호르몬 수용체에 작용하지 못하기 때문에 '불활성 상태'라 하며 생리적인 기작을 유도할 수 없다. 혈중 스테로이드 대부분(95-99%)은 이러한 불활성 상태로 존재하며 극히 일부 (1-4%)만 운반매체와 결합되어있지 않은 상태(활성상태)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈중 스테로이드의 농도는 활성 상태의 호르몬의 농도라기보다는 대부분 불활성 상태의 농도라 할 수 있다.
이에 반하여, 타액에 포함되어 있는 스테로이드는 혈액과 달리 모두 운반매체와 결합되어 있지 않은 활성 상태이며 조직외액(extracelluar fluid)에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드가 단순 확산방식(passive diffusion)에 의해 타액샘으로 이동한 것 이다. 따라서 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 조직 안에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드로 인식되고 있다.
또한, 타액은 혈액과 달리 의료진의 도움 없이도 개인의 수면주기에 맞추어 일반인이 쉽게 채취할 수 있기 때문에 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 연구를 쉽게 진행할 수 있는 장점을 가지고 있다. 즉, 타액을 이용할 경우 혈액으로 접근이 어려웠던 활성상태의 스테로이드의 농도와 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 접근이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명은 타액을 시료로 하는 분석에 사용할 수 있는 타액 정제 방법에 관한 것인 바, 상기와 같은 장점을 효과로 발휘할 수 있다.
타액채취는 집적 채취용 시험관에 타액을 뱉는 방법과 타액이 잘 스며들 수 있는 솜 등을 이용하는 방법이 있으나, 솜 등의 소재를 이용하여 타액을 채취할 경우 타액에 포함되어 있는 스테로이드 호르몬이 이들 소재와 결합하거나 소재 자체의 영향으로 실제 호르몬의 양과 다른 농도로 정량될 위험이 있다. 그러므로, 본 발명에서 바람직한 타액 채취 방법은 직접 타액을 채취용기에 뱉도록 하는 방법이다.
특히, 스테로이드 호르몬 중에서 성호르몬의 분석을 위해서는, 바람직하게는 아침에 잠에서 깨는 순간(기상직후, 1분이내), 기상 후 30분, 기상 후 60분별로 각각 타액 시료를 제공된 채취용 튜브에 직접 뱉도록 하여 채취할 수 있다. 이 때, 기상 후 1시간 동안 양치질, 흡연, 카페인이 포함되어 있는 음료 섭취 및 간식이나 식사를 하지 않는 것이 좋다.
타액에 포함되어 있는 미량의 호르몬 농도를 측정하기 위하여 본 발명은 종래의 가열 방법이 아니라, "pH 조절 및 급격한 온도변화"를 활용한 단백질 변성원리를 이용한다
일반적인 타액 정제공정에서는 열처리로 약 60 ℃에서 2시간 동안 가열하고 식힌 후, 원심분리하고 바로 분석을 행한다(Howard et al., 1989; Tamate et al., 1997) 그러나, 온도에 의해 변성된 단백질은 온도가 서서히 내려갈 때, 원 상태로 돌아가는 성질이 있고 원래 상태로 돌아가면 원심분리로 분리가 어려워지는 문제점이 있다.
단백질 변성이란 단백질이 물리적 요인(가열, 건조, 교반, 압력, X-선, 초음파, 진동, 동결), 화학적 요인(산, 염기, 요소, 유기용매, 중금속, 계면활성제) 및 효소작용 등에 의해 1차 구조(peptide structure)의 변화없이 특유의 고차구조(2차, 3차, 4차)가 변하는 현상을 일컫는다. 이 중에서, 열변성의 온도는 대개의 단백질에서 60∼70℃이며 온도가 높아질수록 변성속도는 빨라진다.
더구나, 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 혈액의 1/100-1/1000 정도로 매우 낮기 때문에, 상용화된 호르몬 분석 키트로는 단백질 열변성의 불확실성 및 스테로이드 호르몬의 극미량으로 정확한 분석이 쉽지 않았다.
그러나, 본 발명에서는 강염기 처리 후 20~30분의 단시간의 고열에 노출·급냉시킴으로써 보다 효과적으로 단백질을 변성시키는 방법을 이용하여 원심분리시 정확성을 높이게 된다.
보다 구체적으로 설명하면, 우선 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기를 처리한다. 상기 pH 12~14의 강염기는 제한은 없으나, NaOH, LiOH, KOH, Ca(OH)2 로 구성된 군에서 선택되는 1종의 강염기 용액일 수 있으며, 약 1N 농도인 것이 바람직하다.
다음으로, 강염기를 처리한 타액을 약 20분 내지 30분 동안 70℃~90℃의 온도로 가열한 후, 급속히 온도를 낮춘다. 본 발명의 일 실시예에서는 80℃에서 약 20분동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다.
이와 같이, 본 발명은 pH 및 급격한 온도 변화를 통한 단백질 변성 원리를 이용하여 타액을 정제함으로써, 타액 내 미량의 스테로이드 호르몬을 높은 정확성으로 검출가능하게 한다. 즉, 종래 가열 후 냉각공정과 비교하여, 본 발명은 강염기 처리 후 20~30분의 단시간의 고열에 노출시키고 얼음 수조 등을 이용하여 급냉시키기 때문에 변성된 단백질이 다시 원래 구조로 돌아가려는 문제점이 없는 것이고, 이를 통해 호르몬 검출의 정확성을 높이고, 분석 시간을 단축시키는 효과를 가지는 것이다.
본 발명에서, 상기과 같은 가열 및 급냉 공정 후, 타액에 포함되어 있는 소화효소, 박테리아 등을 제거하기 위해 원심분리를 수행한다. 이 때, 약 15000~17000rpm, 3~5℃, 5~10분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 16000rpm으로 4℃에서 5분 동안 수행한다.
다음으로, 본 발명에서는 염기성을 나타내고 있는 상기 시료에 대하여 중성 pH로 맞추는 중화단계를 수행한다.
가장 대표적으로 사용할 수 있는 방법은 pH 1~2의 강산 용액을 처리하는 것이다. pH 1~2의 강산은 예를 들어, HCl, H2SO4, HNO3 등으로 구성된 군에서 선택되는 1종을 사용할 수 있으며, 약 1N 농도로 사용할 수 있다.
바람직하게는, 원심분리 후 수득한 상층액에 대하여 1N 농도로 pH 1~2의 강산 용액을 처리하여 중성 산도(pH)를 맞춘다.
그리고,상기 수득한 중성 시료에 대하여 뮤코단백질 분해효소를 처리하여 타액 내의 뮤코단백질(mucoprotein)을 제거한다. 특히, 뮤코단백질은 열에 의해 변성되지 않기 때문에, 상기 설명한 변성공정만으로는 추후 호르몬 분석에 있어서 정확한 결과를 도출하는데 장애 요소가 될 가능성이 높다.
따라서, 본 발명에서는 이러한 뮤코단백질(mucoprotein)을 효소를 이용하여 분해시키는 공정을 함께 포함하는 것이다.
점액(mucus)은 겔을 형성할 수 있는 생물학적 액체로, 물과 다양한 세포의 분비산물을 포함하는 성분들의 혼합물이다. 또한, 뮤신(mucin)은 뮤코단백질(mucus glycoprotein) 또는 상피당단백질(epithelialglycoprotein)로 불리우며, 다수의 이당류 측쇄(side chain)가 펩티드 중심(core)에 N- 및 O- 결합으로 연결되어 있는 것으로 특정지워지는 점액과 당복합물(glycoconjugate)의 주 구성성분이다
상기 뮤코단백질(mucoprotein)은 열에 의해 변성되지 않기 때문에 직접 이를 분해할 수 있는 다양한 점액분해제들 또는 뮤코단백질 분해효소들을 사용한다.
본 발명의 뮤코단백질(mucoprotein) 분해효소는 β-Nacetylhexosamine-[1→4] glycosidic bond을 분해할 수 있는 효소면 어느 것이나 가능하며, 본 발명의 일 실시예에서는 hyaluronidase type 1 (H 3506, Sigmaaldrich chemical co.) 500 IU를 사용하였다.
뿐만 아니라, 뮤코단백질 분해효소의 작용의 기전들에 근거하여, 점액분해제들 또는 뮤코단백질 분해효소들은 흔히 다음에 오는 그룹들로 분류될 수 있다 : 뮤신 당단백질들의 단백질 중심부를 분해시키는 프로테아제들 (예를 들면, 프로나아제(pronase), 파파인(papain)); 뮤코단백질(mucoprotein) 이황화 연결들(disulfide linkages)을 쪼개는 설프히드릴 화합물들 ; 그리고 점액질 내에서 비공유 결합들을 파괴시키는 세척제들 (예를 들면, 트리톤 엑스-100, 트윈 20). 추가적인 화합물들은 이러한 맥락에서, 거기에 국한되지는 않으나, 담즙산염과 계면 활성제들, 예를 들면, 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 소듐 타우로데옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate), 소듐 글리콜레이트, 그리고 리소포스파티딜 콜린(lysophosphatidylcholine)을 포함한다.
본 발명에서는 상기 뮤코단백질 분해효소를 처리하고 약 37℃ 에서 10~15분 동안 반응시켜 타액 내의 뮤코단백질을 분해한다.
그리고, 앞의 공정과 유사하게, 상기 시료를 70℃~90℃의 온도로 다시 가열한 후, 급속히 온도를 낮추어 상기 뮤코단백질 분해효소의 변성을 유도한다. 본 발명의 일 실시예에서는 80℃에서 약 10분동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상기 변성된 뮤코단백질 분해효소를 제거한다.
마지막으로, 상기 수득된 시료에 완충액을 섞어 타액 정제과정을 마무리하는 것이 바람직하다.
특히, 상기 완충액은 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 젤라틴은 미량의 스테로이드, 에스트라디올이 균질하게 분포하도록 유도하고 타액이 분석과정 중 외부 공기에 노출되더라도 최적의 산도를 유지하도록 한다.
본 발명의 타액 정제 공정은 강염기 처리, 가열 및 급냉 단계에 약 25분 ~30분이 소요되고, 뮤코단백질(mucoprotein) 제거 및 여기에 사용된 효소 제거에 약 20분 ~25분이 소요되므로, 총 50분 ~ 60분의 시간이 소요된다. 이는 약 56℃로 2시간 이상의 가열이 필요했던 종래의 타액 정제 공정과 비교하여 시간적으로 훨씬 단축되는 효과가 있다.
또한, 본 발명이 타액 정제공정의 가장 큰 효과는 이후 호르몬 등의 분석에 높은 정확성을 가져다 주는 것이다. 즉, 본 발명은 타액 내 미량으로 존재하고 있는 스테로이드 호르몬 외의 불순물 및 여타 성분들을 효과적으로 제거한다. 이는 본 발명의 실시예를 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 방법은 타액 내 함유되어 있는 목적 단백질, 가장 바람직하게는 스테로이드 호르몬, 예를 들어 성 호르몬, 부신피질 호르몬 등의 정확한 분석을 위한 타액 전처리 공정에 관한 것이므로, 본 발명의 방법 수행 후, 이어서 스테로이드 호르몬을 적절한 방법으로 검출한다. 이하와 같은 호르몬을 예로 들 수 있다.
"성호르몬"은 웅성 또는 자성 생식기관의 발달 및 그 기능을 발현시킨다. 정소에서는 테스토스테론이 만들어지는데, 그 작용에 따라 안드로겐이라는 이름이 사용된다. 난소에서는 2종의 스테로이드 호르몬이 만들어진다. 즉, 성숙여포상피(成熟濾胞上皮)에서는 여포 호르몬인 에스트라디올, 황체에서는 황체 호르몬인 프로게스테론이 만들어진다. 이것들은 그 작용에 주목하는 경우에는 각각 에스트로겐·게스타겐이라는 이름이 사용된다
상기 "안드로겐"은, 예를 들어, 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone,DHT), 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 테스토스테론(testosterone), 5α-안드로스탄-3α,17β-디올(5α-androstane-3α,17β-diol), 안드로스텐디온(androstenedione), 에피테스토스테론(epitestosterone), 5α-안드로스탄-3β,17β-디올(5α-androstane-3β,17β-diol), 안드로스텐디올(androstenediol), 안드로스테론(androsterone), 에티오콜아놀론(etiocholanolone), 11-케토-안드로스테론(11-keto-androsterone: 11-keto-A), 11-케토-에티오콜아놀론(11-keto-etiocholanolone: 11-keto-E), 11-히드록시-안드로스테론(11-hydroxy-androsterone: 11-OH-A), 11-히드록시-에티오콜아놀론(11-hydroxy-etiocholanolone:11-OH-E) 및 5α-안드로스탄디온(5α-androstanedione) 등을 포함한다.
상기 "에스트로겐"은 에스트론(estrone), 17β-에스트라디올(17β-estradiol), 에스트리올(estriol), 2-히드록시-에스트론(2-hydroxy-estrone: 2-OH-E1), 2-히드록시-에스트라디올(2-hydroxy-estradiol: 2-OH-E2), 17-에피에스트리올(17-epiestriol), 4-히드록시-에스트론(4-hydroxy-estrone: 4-OH-E1), 4-히드록시-에스트라디올(4-hydroxy-estradiol: 4-OH-E2), 2-메톡시-에스트론(2-methoxy-estrone: 2-MeO-E1), 2-메톡시-에스트라디올(2-methoxy-estradiol: 2-MeO-E2) 및 16α-히드록시-에스트론(16α-hydroxy-estrone: 16α-OH-E1) 등을 포함한다.
또한, 부신피질에서는 코르티노이드라고 총칭하는 스테로이드 호르몬(부신피질 호르몬)이 만들어진다. 이것들은 모두 생명유지에 불가결한 것이며, 그 중에서도 중요한 것은 알도스테론(무기질 코르티코이드), 코르티코스테론·코르티솔·코르티손(당질 코르티코이드) 등이 있다.
상기 "부신피질호르몬"은 트리암시놀론(triamcinolone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 플루오클로로코르티손(fluochlorocortisone), 6α-메틸프레드니솔론(6α-methylprednisolone), 베타메타손(betamethasone), 덱사메타손(dexamethasone), 플루메타손(flumethasone), 베크로메타손(beclomethasone), 트리암시놀론 아세토나이드(triamcinolone acetonide), 데소나이드(desonide), 플루니솔라이드(flunisolide), 플루르안드레놀라이드(flurandrenolide), 플루오시놀론 아세토나이드(fluocinolone acetonide), 데스옥소메타손(desoximethasone),부데소나이드(budesonide), 플루시노나이드( flucinonide), 암시노나이드(amcinonide), 코르티졸(cortisol) 및 코르티손(cortisone) 등을 포함한다.
한편, 정제된 타액 시료에서 상기와 같은 스테로이드 호르몬 검출하기 위한 방법으로는, 제한은 없으나, 방사선 면역 측정법을 이용하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 효소를 표지자로 이용한 효소면역측정법(EIA), luminol이나 그 유도체 또는 aminobutyl-ethylisoluminol(ABEI)로 감도를 증가시킨 화학섬광면역측정법(chemiluminescence immunoassay; CIA), 또는 형광물질표지자(fluorescent label)를 이용한 형광면역측정법(fluorescence immunoassay; FIA) 등이 사용될 수 있고, 특히, 방사면역측정법을 사용하는 것이 좋다.
방사면역측정법은 높은 감도(sensitivity)와 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 나타내며, 반응 후의 분명하고 명백한 검출을 가능케 해주는 등 여러 이점을 가지고 있는 바, 가장 바람직하게는 방사선 면역 측정법을 사용할 수 있고, 이를 위해 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법을 이용할 수 있다. 보다 상세한 측정과정은 액상-이중항체 방법을 이용한 호르몬 측정에 관한 논문(Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population; age-related differences, diurnal,and correlations with serum levels. Yonsei Med J. 2007;48:379-88)을 참조할 수 있다.
대부분의 호르몬 분석은 주로 항원-항체 반응을 이용한 면역 측정법을 이용하는데, 다양한 이물질이 항원-항체 반응과정에 교란의 요인으로 작용하여 실제 호르몬 수치와 다른 결과를 나타내는 경우가 많으므로, 본 발명의 방법으로 정제된 타액 시료를 이용하면 이와같은 다양한 이물질이 효과적으로 제거되어 있는 바, 보다 정확한 농도측정이 가능하다.
타액 중의 스테로이드 호르몬은 매우 낮은 수준이지만 본 발명의 방법으로 정제된 타액은 상기 호르몬의 검출효율을 현저히 높여주기 때문에, 방사면역측정법 등을 이용하여 정확히 측정할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 타액 정제
타액을 채취하는 대상은 치료목적의 의약품 복용력, 생리주기, 폐경여부 및 시기 등을 확인하였고 몸무게와 키, 체질량지수를 측정하였다. 대상여성 중 최근 3개월 동안 지속적으로 정상적인 생리주기를 가진 여성과 최근 1년전에 지속적으로 정상적인 생리주기가 없는 폐경기 여성을 대상으로 포함시켰다.
그러나, 호르몬 대체요법, 경구 피임약 복용, tamoxifen 혹은 에스트로젠, 프로제스테론 코티졸이 포함되어 있는 약물을 복용하고 있는 여성; 임신중, 수유중, 불임판정, 성병 혹은 난소기능에 이상이 있다고 판정 받은 여성; 암, 당뇨, 고/저혈압등의 심각한 질환이 있거나 체질량지수가 비정상 (BMI ≤18 or ≥25)인 여성은 제외하였다.
스크리닝 대상에 포함된 여성들에게 아침에 잠에서 깨는 순간(기상직후, 1분이내), 기상 후 30분, 기상 후 60분별로 각각 1ml의 타액 시료를 제공된 채취용 튜브에 직접 뱉도록 하였다.
여기서, 스크리닝 대상에 포함된 여성은 기상 후 1시간 동안 양치질, 흡연, 카페인이 포함되어 있는 음료수 섭취 및 간식이나 식사를 하지 않도록 하였으며, 타액 채취시간을 채취용 튜브표면에 유성펜을 이용하여 표기하도록 하였다.
부신에서 생성, 분비되는 코티졸은 매우 뚜렷한 일주기 리듬을 보이며 특히 기상직후 30분에 하루중 최고의 농도를 나타낸다. 그러나 기상 직후에 정확히 타액이 채취되지 않을 경우 기상 30분 후의 타액에서 측정한 코티졸 농도와의 차이가 나지 않는다. 이러한 결과는 최소 2.8nmol/L 정도의 차이가 있어야지 기상 직후에 정확히 타액이 채취되었다고 간주된다. 따라서 스크리닝 대상으로 포함된 여성들의 타액에서 먼저 코티졸을 정량 분석한 후, 기상 직후와 기상 후 30분에 채취한 시료에서 2.8nmol/L 이상 차이가 있는 시료만 선별하였다. 아울러 성기능이 내/외적 스트레스 요인에 의하여 영향을 받는바, 코티졸 농조가 극단적으로 낮거나 높아 부신기능에 이사이 있다고 판단되는 시료는 스크리닝 대상에서 제외하였다.
그리고, 상기 채취한 타액 시료를 정제하였다.
우선 1N NaOH를 각각 처리한 타액을, 80℃에서 약 20분동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다. 그리고, 원심분리를 수행하여 타액에 포함되어 있는 소화효소, 박테리아 등을 제거하였다. 그 후, 상청액을 수거하여 1N HCl을 처리하여 pH를 중성산도로 맞추었다.
그리고, 여기에 뮤코당 분해효소 hyaluronidase type 1 (H 3506, Sigmaaldrich chemical co.) 500 IU를 처리하고 약 37℃ 에서 10분 동안 반응시켜 타액 내의 뮤코단백질(mucoprotein)을 분해하였다. 상기 시료를 80℃에서 약 10분 동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상기 변성된 뮤코단백질 분해효소를 제거하였다.
마지막으로, 타액과 동일양의 0.2% 젤라틴을 포함하는 완충액을 섞어 타액 정제과정을 마무리하였다.
상기 공정에 총 1시간 30분 정도가 소요되었다.
비교예 1 : 기존 열처리에 의한 전처리와 본 발명에 의한 전처리의 경우 단백질양 변화 비교
기존에 사용되던 방법과의 비교를 위해, 기존의 타액 전처리 방법에 의거하여 (Howard et al., 1989; Tamate et al., 1997), 타액에 포함되어 있는 객담 및 이물질을 원심분리하여 (3000g, 10분) 제거한 후 타액 시료를 56℃에서 2시간 가열한 후 상온 (25℃) 에 10분간 방치한 후, 원심분리 (3000g, 20분)하고 상층액을 취하였다. (소요시간 약 3시간). spectrophotometer (Beckman DU 800 UV/VIS)를 이용하여 280nm (A280) 흡광도를 측정하였다
실시예 1의 본 발명의 방법으로 처리된 타액시료에 대하여도 spectrophotometer (Beckman DU 800 UV/VIS)를 이용하여 280nm (A280) 흡광도를 측정하였다.
대조군으로는 전처리 않은 타액시료를 사용하였다.
그 결과를 도 1에 도시하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 전처리 하지않은 타액시료의 흡광도는 0.05664 0.0002 였으며, 기존 방법으로 전처리된 타액 시료의 흡광도는 0.3794 0.0006이었다. 본 발명의 방법으로 전처리된 타액시료의 흡굉도는 0.0361 00003이었다.
Dunn's Multiple Comparison Test결과, 종래 방법과 본 발명의 방법으로 전처리된 시료는, 전치리하지 않은 시료에 비해 흡광도가 유의하게 떨어져 있음을 확인할 수 있었으며 (p < 0.05), 종래 방법과 본 발명의 방법 사이에는 유의한 차이가 없었다 (p>0.05).
이는 종래 방법과 본 발명의 방법 모두 타액에 포함되어 있는 단백질계 물질을 제거하는 효과 있음을 의미하며 두 방법 간에 단백질계 물질 제거효과의 차이는 크지 않음을 의미한다.
비교예 2 : 종래 열처리에 의한 전처리와 본 발명에 의한 전처리의 경우 스테로이드 호르몬 손실율의 비교
56℃로 (2시간) 가열 후 원심분리하여 타액시료를 전처리하였을 때 (종래 방법)와 산도 (pH) 변화/뮤코당분해를 병용하여 타액시료를 전처리하였을 때 (본 발명 방법) 타액시료의 전처리과정 중 스테로이드 호르몬의 손실이 있는지를 확인하기 위하여 타액시료에 방사선 동위원소로 표지된 스테로이드 호르몬 (코티졸, 테스토스테론, 에스트라디올)을 약 5000 cpm을 각각 첨가한 후, 스테로이드 호르몬의 회수율을 조사하였다.
그 결과를 도 2에 도시하였다.
Kruskal-Wallis test 결과, 종래 방법과 본 발명의 방법으로 타액 시료를 전처리 하였을 때 전처리 과정중 스테로이드 호르몬(코티졸, 테스토스테론, 에스트라디올)의 회수율에는 차이가 없었으며 (p > 0.05) 이들 두 과정 모두에서 스테로이드 호르몬의 회수율을 전처리하지 않은 타액시료의 회수율과 비교하여도 유의한 차이가 없었다 (p > 0.05).
이는 두 과정 모두에서 스테로이드 손실은 크게 일어나지 않음을 의미한다.
비교예 3 : 종래 열처리에 의한 전처리와 본 발명에 의한 전처리의 경우 스테로이드 호르몬 검출의 정확성 비교
상기와 같이, 단백질 변화량이나 스테로이드 손실율의 큰 차이가 없는 종래 방법과 본 발명의 방법이 실제, 스테로이드 호르몬의 정량 분석시 어떠한 정확성의 차이를 보이는지 알아보기 위해 방사면역측정법을 이용하여 스테로이드 호르몬을 검출하였다.
이를 위하여 타액시료를 1차 원심분리(3000g, 10분)하여 객담성분을 1차적으로 제거하였고, 상층액을 취하였다. 상층액에 Dextrane이 코팅된 활성탄 (dextran coated 0.1% activated charcoal (w/v))을 4℃로 유지되는 저온실에서 12시간동안 교반하여 타액시료내에 포함되어 있는 스테로이드 호르몬등 분자량이 작은 물질들을 제거하였다 (charcoal stripped saliva, CSS).
이 CSS에 잔류 스테로이드 호르몬이 포함되어 있는지 RIA 방법으로 확인한 결과 CSS내에는 코티졸 및 성 호르몬이 포함되어 있지 않았다 (검출범위 이하).
CSS에 기지농도(旣知濃度)의 코티졸 (500 pg/100 ul), 테스토스테론 (50 pg/100 ul) 및 에스트라디올 (50 pg/100 ul)를 각각 첨가하여 종래 방법과 본 발명의 방법에 의한 타액시료 전처리 과정을 수행한 후 타액 시료내에 이들 스테로이드 호르몬을 각각 정량분석하였다.
그 결과를 이하 표 1에 기재하였다.
전처리 과정 없음
(pg/100 ul)		 종래 방법
(pg/100 ul)
 본 발명 방법
(pg/100 ul)
코티졸 첨가
(500pg/100 ul)		 595.5 ± 27.5
 495.1 ± 43.9
 537.2 ± 1.9
테스토스테론 첨가
(50 pg/100ul)		 65.2 ± 3.7
 42.1 ± 2.5
 48.1 ± 1.9
에스트라디올 첨가
(50 pg/100ul)		 56.2 ± 3.2
 44.6 ± 2.3
 47.9 ± 2.0
표 1에서와 같이 전처리하지 않은 타액시료에서는 스테로이드 호르몬이 기대농도보다 다소 높게 검출되었다. 이는 타액시료내에 포함되어있는 활성탄으로 제거하지 못한 분자량이 큰 물질 (단백질, 뮤코당등)이 호르몬 정량분석시 항원-항체반응을 간섭한 효과로 해석되어 진다.
종래 방법에 의하여 전처리 된 타액시료에서는 코티졸을 제외한 성호르몬은 기대농도 보다 다소 낮게 검출되었고, 표준 오차값도 다소 크게 나와 정확성이나 반복성이 낮아 신뢰성이 높지 않음을 확인할 수 있었다.
이에 반하여, 본 발명의 방법의 경우 기대농도와 유의한 차이없이 스테로이드 호르몬이 검출되는 바, 본 발명의 방법은 검출농도의 정확성을 향상시켰음을 알 수 있다.
검출이 정확하지 못하면 정량분석의 시료로써 가치가 없으므로, 본 발명은 단백질 양의 변화와 스테로이드 호르몬 손실율의 차이가 없으면서 호르몬 추출의 정확성이 향상되는 기술인 것이다.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 타액 정제 방법:
    (a) 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기를 처리하는 단계;
    (b) 가열 후 냉각시키는 단계;
    (c) 원심분리에 의해 타액으로부터 소화효소 및 박테리아를 제거하는 단계;
    (d) 중화 단계;
    (e) 뮤코단백질 분해효소에 의해 뮤코단백질 제거단계;
    (f) 원심분리에 의해 상기 뮤코단백질 분해효소를 제거하는 단계; 및
    (g) 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 완충액을 혼합하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 스테로이드 호르몬의 정량분석을 위해 타액을 전처리하는 공정인 것을 특징으로 하는 타액 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서 상기 스테로이드 호르몬은 성호르몬 또는 부신피질 호르몬인 것을 특징으로 하는 타액 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 pH 12~14의 강염기는 NaOH, LiOH, KOH, Ca(OH)2 로 구성된 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 가열은 70~90℃의 온도로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 냉각은 얼음수조를 이용하여 급냉시키는 것에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 (d) 중화단계는 pH 1~2의 강산을 처리하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 pH 1~2의 강산은 HCl, H2SO4, HNO3로 구성된 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 뮤코단백질(mucoprotein) 제거는 뮤코단백질(mucoprotein) 분해효소를 처리하는 것에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 뮤코단백질(mucoprotein) 분해효소는 Nacetylhexosamine-[1→4] glycosidic bond를 분해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 상기 (g)단계에서 완충액은 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 타액은 기상 후 1시간 이내에 채취하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, 스테로이드 호르몬의 정량분석은 방사면역측정법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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