KR102085974B1 - 타액 중 펩신 함량 측정에 의한 역류성 인후두염 진단 방법 및 이를 위한 시료 준비 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 i) 전타액 수집법에 의해 시료를 준비하고, ii) 상기 시료 중의 펩신 함량을 측정하는, 역류성 인후두염 진단을 위한 정보제공 방법 및 이를 위한 시료 준비 방법에 관한 것이다.

Description

타액 중 펩신 함량 측정에 의한 역류성 인후두염 진단 방법 및 이를 위한 시료 준비 방법{A method for diagnosis of Laryngopharyngeal Reflux by detection of pepsin content in saliva and a preparation method of a sample therefor}

본 발명은 i) 전타액 수집법에 의해 시료를 준비하고, ii) 상기 시료 중의 펩신 함량을 측정하는, 역류성 인후두염 진단을 위한 정보제공 방법 및 이를 위한 시료 준비 방법에 관한 것이다.

역류성 인후두염은 위산을 포함한 내용물이 식도를 거쳐 후두와 인두로 역류하여 유발되는 후두와 인두의 만성 염증 또는 점막의 손상을 말한다. 현대인의 식생활 습관 변화 및 산업화, 도시화에 따른 기후와 대기 변화가 심해짐에 따라 역류성 인후두염을 호소하는 환자 수가 점차 증가하고 있지만, 아직까지 이를 간단하면서도 정확히 진단할 수 있는 방법이 부재하며, 진단한다 하더라도 치료하는 방법은 대부분 위산 분비의 억제에 머물러 있을 뿐이어서, 치료 후에도 증상이 지속되는 등 효율적인 치료가 어려운 상황이므로, 정확하고 빠른 진단을 통한 적절한 치료가 반드시 필요하다.

역류성 인후두염 진단의 gold standard로 알려져 있는 24시간 식도 산성도 검사법(Postma GN, et al., Ear Nose Throat; 2002; 81:14-18)은 비용이 많이 들고, 검사 시간이 길고, 불편하여 쉽게 이용하기 어려울 뿐 아니라 비전형적인 증상을 가진 환자들에 있어서는 치료 반응을 예측할 수 없다. 역류성 인후두염 환자들은 역류 증상보다는 목의 이물감, 기침, 음성 변화와 같은 비특이적 증상을 호소하는 경우가 많으나, 이를 정확히 진단하기는 어려워 이러한 증상을 호소하는 많은 환자들에서 외래에서 바로 시행하고 결과를 확인할 수 있는 비침습적이고 객관적인 진단 방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 펩신은 위에서만 생성되는 단백분해 효소이므로, 타액 내 펩신 검출기술은 위 내용물의 역류에 대한 민감하면서도 비침습적인 방법으로 유용할 수 있다. Saritas 등은 고속 측방 유동 장치(rapid lateral flow device)를 이용하여 타액 내 펩신의 검출이 역류성 식도염의 진단에 도움이 된다는 것을 밝혔으며(Saritas Yuksel, E. et al., Laryngoscope, 2012, 122(6): 1312-1316), Darija 등은 역류성 인후두염 환자에서 타액 내 펩신의 양이 정상인에 비해 유의하게 높음을 밝혔다(Darija, B. et al., Collegium Antropologicum, 2012, Supp. 2, 36: 83-86). 이에, 현재 미국을 비롯한 여러 나라에서, 보다 간단하고 신뢰도 높으며, 비침습적인 진단 방법을 개발하고 있으나 현재 우리나라에서는 이에 대한 연구 및 개발이 전무한 상태이다. 또한 아직까지 역류성 인후두염의 진단을 위해 타액 내에서 펩신을 측정하고자 할 때 타액의 수집 방법과 수집시기에 대해서는 알려진 바 없다. 이에 대한 선제적인 기술 확보가 필수적이다.

본 발명의 하나의 목적은 역류성 인후두염 발병이 의심되는 개체로부터 전타액 수집법에 의해 타액을 채취하여 시료를 준비하는 제1단계; 및 이전 단계로부터 준비한 시료 중의 펩신 함량을 측정하는 제2단계를 포함하는 역류성 인후두염 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 기상 직후로부터 30분 이내에 타액을 수집하는 제1단계; 및 상기 수집한 타액을 0 내지 25℃에서 보관하는 제2단계를 포함하는 펩신 검출을 위한 타액 시료 준비 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 역류성 인후두염 발병이 의심되는 개체로부터 전타액 수집법에 의해 타액을 채취하여 시료를 준비하는 제1단계; 및 이전 단계로부터 준비한 시료 중의 펩신 함량을 측정하는 제2단계를 포함하는 역류성 인후두염 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 용어 "역류성 인후두염(Laryngopharyngeal Reflux; LPR)"은 다양한 원인에 의해 위 내용물, 특히 pH가 낮은 산성물질이 식도로 올라와 정상 상태에서는 중성의 pH를 유지하는 목(인두)을 오염시켜 여러 가지 증상, 예를 들면 목이 칼칼하고 아프다든지, 가슴이 답답하거나, 목이 뻐근하거나, 목소리가 변하거나, 가래가 나오며 기침을 자주하게 되는 질환을 총칭할 수 있다. 상기와 같은 불편한 증상을 나타내지만 진찰 결과에서는 별다른 이상소견이 나타나지 않는 경우 이와 같은 역류성 인후두염을 의심할 수 있다. 이와 같이 역류성 인후두염이 발병하였더라도 보통 이비인후과에서 검사하거나 내과에서 위내시경 검사를 하더라도 정상이라고 하거나 특별한 이상이 없다고 하는 경우가 다수 있다. 현재로서 이를 가장 정확히 진단할 수 있는 방법은 24시간 식도 산성도 검사법이나, 이는 검사시 환자에 불편을 초래할 수 있는 단점이 있다. 따라서, 비침습적이며, 환자에 불쾌감을 주지 않으면서 역류성 인후두염을 정확히 진단할 수 있는 방법을 발굴할 필요가 있다.

본 발명의 용어 "개체"는 상기 역류성 인후두염이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.

본 발명의 용어 "타액(saliva)"은 침샘으로부터 입 안으로 분비되는 분비액으로, 흔히 침이라고 한다. 그 성분은 99% 이상이 물(수분)이며, 총 1%도 안되는 성분에 다양한 전해질들, 단백질들, 효소들, 면역글로불린, 항균물질들, 점막 당단백질들, 수종의 폴리펩티드들과 올리고펩티드들 및 극소량의 알부민을 포함한다.

본 발명의 용어 "진단"은 특정 병리 또는 생리 상태의 존재 또는 활성을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명에 있어서 진단은 위산을 포함한 내용물이 식도를 거쳐 후두와 인두로 역류하여 유발되는 후두와 인두의 만성 염증 또는 점막의 손상을 확인하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "펩신(pepsin)"은 위에서 분비되는 소화 효소로, 위의 주세포(chief cell)에서 분비되는 펩시노겐(pepsinogen)이 염산에 의해 활성화된 형태이다. 펩신은 단백질을 폴리펩타이드로 분해하며, pH 2 정도의 낮은 산성 환경에서 가장 활성이 높다. 정상 상태에서 펩신은 산성 환경의 위에 존재하며 중성 pH를 나타내는 인후두에서는 존재하지 않는 물질이므로, 타액 중의 펩신은 역류성 인후두염의 표지로 사용할 수 있다.

이에 본 발명자들은 타액 중의 펩신 농도를 측정함으로써 역류성 인후두염을 진단할 수 있음을 규명하였다. 나아가 진단의 정확성을 극대화하여 양성 및 음성 예측도를 향상시키기 위한 최적의 시료 수집 및/또는 보관 조건을 발굴하였다.

본 발명의 용어 "전타액 수집법"은 면구 등의 도구를 사용하지 않고 개체가 직접 용기에 뱉도록 하여 타액을 수집하는 방법으로, 구체적으로 타액 채취 전 의자에 앉은 상태에서 쉬도록 한 다음, 입술을 다물고 있다가 입안에 고인 타액을 1분에 1 내지 2회 깔대기를 이용하여 시험관에 뱉거나, 자연스럽게 흘러나오도록 하여 안정시 분비되는 전타액을 시험관에 수집할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 전타액 수집법을 이용하여 채취한 타액 중의 펩신 농도는 동일한 피검체에서 종래 Salivette법으로 수집한 타액 중의 펩신 농도에 비해 평균적으로 높은 수치를 나타내므로 보다 높은 민감도로 검출할 수 있으므로 이를 토대로 하여 보다 정확한 진단이 가능할 수 있다(도 1 및 표 1).

상기 제1단계에서 타액은, 이후 검출하고자 하는 분석물질인 펩신을 안정화하기 위하여, 10 내지 200 μmol의 시트르산을 함유하는 용기에 채취할 수 있다. 상기 시트르산은 용매에 용해시킨 용액이나 자체 분말로써 제공될 수 있다. 예컨대, 0.05 M 내지 0.5 M 수용액의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용액의 형태로 사용하는 경우 0.05 M 미만으로 농도가 너무 낮으면 동일한 몰수의 시트르산을 제공하기 위하여 증가된 부피의 용액을 사용해야 하며, 이에 따라 시료를 희석할 수 있다. 또는 0.5 M 초과하는 농도의 용액을 사용하는 경우 부피 편차에 따른 시트르산 몰수 변화가 크므로 이를 방지하기 위하여, 상기 범위의 농도를 갖는 용액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 사용한 시트르산의 양이 10 μmol 미만인 경우 전술한 목적을 달성하기 어려워 시료 중의 펩신 분해를 야기하거나, 시료의 감염 및/또는 오염을 야기할 수 있으며, 200 μmol 초과인 경우 불필요한 시약 낭비를 초래할 수 있고, 추후 시료 분석시 검출 신호에 간섭할 수 있다.

구체적으로, 상기 제1단계에서 타액은 기상 직후로부터 30분 이내에 채취할 수 있다. 예컨대, 상기 타액은 기상 후 입을 헹구지 않고, 음식물이나 물조차 섭취하지 않고, 양치질도 하지 않은 상태에서 채취할 수 있다.

상기 제2단계에서 사용하는 시료는 채취 후 0 내지 10℃에서 0시간 초과 24시간 미만으로 보관한 것일 수 있다. 구체적으로 0시간 초과 12시간 이하로, 보다 구체적으로는 0시간 초과 6시간 이하로 보관한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는, 상기 제2단계에서 사용하는 시료는 채취 후 10 내지 25℃에서 0시간 초과 6시간 이하로 보관한 것일 수 있다. 구체적으로 0시간 초과 4시간 이하로 보관한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 0 내지 10℃에서 24시간 이상 보관하거나 10 내지 25℃에서 6시간을 초과하여 보관한 시료는 이에 함유된 펩신의 양이 현저히 감소되어 정확한 양을 측정하기 어렵거나 아예 측정할 수 없을 수 있으며, 이에 따라 상기 측정된 수치를 토대로 역류성 인후두염의 발병 여부를 판단하는 경우 실제 양성인 환자이더라도 시간에 따라 펩신 농도가 현저히 감소되어 음성인 것으로 판단하게 되는 케이스가 발생할 수 있다. 한편, 0℃ 이하의 냉동 조건에서 보관하는 경우, 펩신의 양은 빠르게 감소하여 6시간 이내에 50% 미만으로 떨어지므로 진단의 정확도를 신뢰하기 어렵고 검출 자체가 불가능할 수도 있다(도 3).

상기 제2단계로부터 측정한 값이 4 ng/mL 이상인 경우 역류성 인후두염이 발병한 것으로 판단하는 제3단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 기상 직후로부터 30분 이내에 타액을 수집하는 제1단계; 및 상기 수집한 타액을 0 내지 25℃에서 보관하는 제2단계를 포함하는 펩신 검출을 위한 타액 시료 준비 방법을 제공한다.

상기 제1단계에서 타액은, 이후 검출하고자 하는 분석물질인 펩신을 안정화하기 위하여, 10 내지 200 μmol의 시트르산을 함유하는 용기에 채취할 수 있다. 상기 시트르산은 용매에 용해시킨 용액이나 자체 분말로써 제공될 수 있다. 예컨대, 0.05 M 내지 0.5 M 수용액의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용액의 형태로 사용하는 경우 0.05 M 미만으로 농도가 너무 낮으면 동일한 몰수의 시트르산을 제공하기 위하여 증가된 부피의 용액을 사용해야하며, 이에 따라 시료를 희석할 수 있다. 또는 0.5 M 초과하는 농도의 용액을 사용하는 경우 부피 편차에 따른 시트르산 몰수 변화가 크므로 이를 방지하기 위하여, 상기 범위의 농도를 갖는 용액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 제2단계는 0 내지 10℃에서 0시간 초과 24시간 미만으로 수행할 수 있다. 구체적으로 0시간 초과 12시간 이하로, 보다 구체적으로는 0시간 초과 6시간 이하로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는, 제2단계는 10 내지 25℃에서 0시간 초과 6시간 이하로 수행할 수 있다. 구체적으로 0시간 초과 4시간 이하로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 0 내지 10℃에서 6시간 이내로 보관할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 실온 예컨대, 또는 10 내지 25℃에서 보관한 경우 6시간까지 보관한 시료는 초기 펩신 함량에 비해 약 10% 이내로 감소된 수준에서 펩신 함량을 유지하므로 여전히 높은 민감도 및/또는 선택성으로 펩신을 검출할 수 있고, 이에 따라 역류성 인후두염의 진단이 가능할 수 있다. 나아가, 냉장 조건 예컨대, 0 내지 10℃에서 보관하는 경우에는 6시간 보관한 이후에도 초기와 동등한 수준으로 펩신 농도를 유지하므로 높은 민감도 및/또는 선택성으로 펩신을 검출할 수 있고, 이에 따라 역류성 인후두염의 진단이 가능할 수 있다.

본 발명의 역류성 인후두염 진단방법은 비침습적이며, 타액의 수집 시점 및 방법, 그리고 수집한 타액의 보관 조건 및 시간을 조절함으로써 수집한 타액 내의 펩신 농도를 극대화하여 민감하고 선택성있는 검출이 가능하며 이에 따라 높은 양성 및 음성 예측도로 역류성 인후두염을 진단할 수 있으므로, 종래 환자에 불쾌감을 주는 24시간 식도 산성도 검사법을 대신하여 역류성 인후두염의 진단에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 역류성 인후두염 환자군으로부터 전타액 수집법과 Salivette을 이용하여 수집한 타액에서 측정한 타액 내 펩신 양의 평균치 및 오차범위를 나타낸 도이다.
도 2는 역류성 인후두염 환자군과 정상 대조군으로부터 기상시, 아침 식사 후, 점심 식사 후, 저녁 식사 후 수집한 타액에서 측정한 타액 내 펩신 양을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 보관 온도 및/또는 시간에 따른 펩신 양의 변화를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 타액 수집 방법에 따른 타액 내 펩신 검출에 의한 역류성 인후두염 진단력

24시간 다중채널 강내 임피던스(multi-channel intraluminal impedance) 검사에 의해 역류성 인후두염으로 진단받은 환자군과 역류가 없는 정상 대조군으로부터 다음과 같은 두 가지 방법으로 타액을 수집하였다.

1) 전타액 수집법: 타액 채취 전 의자에 앉은 상태에서 쉬도록 한 다음, 입술을 다물고 있다가 입안에 고인 타액을 1분에 1 내지 2회 깔대기를 이용하여 시험관에 뱉거나, 자연스럽게 흘러나오도록 하여 안정시 분비되는 전타액을 시험관에 수집하였다.

2) Salivette 이용법: Salivette(Sarstedt, Numbrecht, Germany)의 면구(tampon)를 1분간 부드럽게 씹은 후 튜브에 넣어 1,000 g에서 2분 동안 원심분리하여 추출한 타액을 수집하였다.

수집한 타액 중의 펩신 분석은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(Cloud-Clone, Houston, TX, USA)를 이용하여 수행하였다. 우선 타액을 96웰 플레이트에 넣고 검출시약(detection reagent) A를 즉시 투입한 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이를 세척한 후, 검출시약 B를 투입하여 37℃에서 30분 더 인큐베이션하였다. 다시 세척한 후, TMB 기질 용액(substrate solution)을 투입하여 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 정지용액(stop solution)을 첨가하여 반응을 중단시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3회 반복하여 수행하고 대상자의 정보를 알지 못하는 한명의 검사자가 판독하도록 하였다.

측정된 타액 내 펩신 양의 평균치 및 오차범위를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 전타액 수집법으로 수집한 타액에서 검출된 펩신의 평균치는 20.92±20.74 ng/mL 이고, 범위는 2.66 내지 80.22 ng/mL 이었다. 한편, Salivette법으로 수집한 타액에서 검출된 펩신의 평균치는 10.30±6.56 ng/mL 이고, 범위는 2.46 내지 25.86 ng/mL 이었다. 상기 두 가지 방법으로 채취한 타액 중의 펩신 검출에 대한 민감도와 특이도 및 이를 이용한 역류성 인후두염 진단에 대한 양성 및 음성 예측도를 산출하여 하기 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타난 바와 같이, 타액 내 펩신 검출의 민감도 및 특이도는 물론, 역류성 인후두염 진단에 대한 양성 및 음성 예측도 모두 Salivette법을 이용한 경우에 비해 전타액 수집법을 이용한 경우 현저히 우수한 결과를 나타내었다. 특히 음성 예측도에 있어서 두 방법은 주목할만한 차이를 나타내었다. 상기 두 가지 타액 채취법 중 펩신 검출 및 역류성 인후두염 진단에 우수한 결과를 나타낸 전타액 수집법을 이후 실험에 사용하였다.

	전타액 수집법	Salivette법
민감도	92.0%	68.7%
특이도	83.3%	50.5%
양성 예측도	95.8%	95.6%
음성 예측도	71.4%	9.1%

상기 표 1에서 민감도는 역류성 인후두염 확진 환자로부터 채취한 타액에서 펩신이 검출될 확률을, 특이도는 역류성 인후두염이 발병하지 않은 정상 개체로부터 채취한 타액에서 펩신이 검출되지 않을 확률을, 양성 예측도는 타액에서 펩신이 검출된 환자들 중에서 실제로 역류성 인후두염이 진단된 환자의 분율을, 음성 예측도는 타액에서 펩신이 검출되지 않은 개체들 중 실제 역류성 인후두염이 발병하지 않은 정상 개체의 분율을 나타내며, 이들 인자는 각각 다음의 식으로 도출하였다.

실시예 2: 타액 수집 시점에 따른 타액 내 펩신 검출 양

모든 피검사자들에게 기상시; 아침, 점심 및 저녁 식사 후 각 1시간 경과한 시점; 및 기침이나 이물감 등의 인후두 역류증 증상 발생시 타액을 모으도록 지시하였다. 피검자들은 기상시 음식이나 물을 섭취하지 않고 양치질을 하지 않은 상태에서 타액을 수집하였다. 타액 중의 펩신을 안정화시키기 위하여 0.1 M 시트르산 0.5 mL을 미리 투입하여 준비한 튜브에 타액을 수집하도록 하였다. 타액은 실시예 1의 전타액 수집법과 동일한 방법을 수집하도록 하였으며, 수집한 시료는 -80℃의 냉동고에 보과하고 2개월 이내에 분석에 사용하였다. 분석시 타액을 1,000 g, 4℃에서 원심분리한 후 상층부만 회수하여 분석에 사용하였다. ELISA 키트를 이용한 펩신 분석 및 판독은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 수행하였다. 측정된 결과는 도 2 및 하기 표 2에 나타내었다.

도 2 및 표 2에 나타난 바와 같이, 모든 시점에서 타액 내 펩신의 양은 정상 대조군에 비해 역류성 인후두염으로 진단받은 환자군에서 유의하게 높았으며, 각 시점 별로 비교하였을 때, 기상시에 측정한 값이 17.2 ng/mL로 가장 높은 수치를 나타내었으며, 이는 다른 시점에서 측정한 값에 비해 4.4배 내지 6.6배 높은 값이었다. 이와 같이 기상시 채취한 타액에서 펩신의 양이 현저히 높은 것은, 호르몬 주기 등에 따라 분비량이 증감하는 타액 내 다른 바이오 마커와는 달리 위산의 역류를 반영하는 펩신의 특성에 따른 것으로 사료된다. 즉, 수면시 앙와위 자세(supine position)에서 지속적으로 역류물과 위액 내 펩신의 축적이 발생하며 또한 수면 중에는 삼킴 현상이 없으므로 타액의 삼킴에 의해 펩신이 희석되는 것을 최소화할 수 있기 때문인 것으로 사료된다.

채취 시점	기상시	아침 식사 후	점심 식사 후	저녁 식사 후	증상 발생시
타액 내 펩신 농도 (ng/mL)	17.2	3.0	3.0	2.6	3.9

실시예 3: 보관 온도 및/또는 시간에 따른 펩신의 안정도

100 ng 펩신을 포함하는 1 mL의 PBS 용액에 0.1 M 시트르산 0.5 mL을 첨가하여 혼합 직후, 및 상온(20℃), 냉장(4℃) 및 냉동(-20℃) 조건에서 각각 6시간 및 24시간 보관한 후 펩신의 농도를 측정하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 동일한 온도에서 보관시 시간의 경과에 따라 펩신의 농도가 감소하였으며, 특히 냉장 보관시 감소율이 현저히 높았다. 반면, 상온에서 보관한 경우 6시간이 경과한 후에도 10% 이내의 감소율을 나타내었으나, 24시간 경과 후에는 초기 농도에 비해 약 65% 정도까지 감소하였다. 나아가, 냉장보관한 경우에는 6시간 보관 후까지도 초기 농도를 그대로 유지하였으나, 24시간이 경과한 후에는 초기 농도에 대해 80%까지 감소하여 검출의 민감성이나 진단의 정확성에 부정적인 영향을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

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8. 기상 직후로부터 30분 이내에 10 내지 200 μmol의 시트르산을 함유하는 용기에 타액을 수집하는 제1단계; 및
   상기 수집한 타액을 0 내지 10℃에서 0시간 초과 6시간 이하로 보관하는 제2단계를 포함하는, 역류성 인후두염으로 진단받은 개체에서 펩신 검출을 위한 타액 시료 준비 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 제1단계에서 타액은 입을 헹구지 않고, 음식물이나 물조차 섭취하지 않고, 양치질도 하지 않은 상태에서 수집하는 것인 타액 시료 준비 방법.
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