CN101632022B - 脓毒性并发症的诊断 - Google Patents

Abstract

本发明描述了用于在受到多发性创伤的人或动物患者中诊断脓毒性并发症的方法，所述患者无外伤性脑损伤，该方法通过下列方式来进行：测定这个患者中的C型钠尿肽(CNP)、其前体或其片段，尤其是C型钠尿肽的前体(NT-proCNP)的水平；并且如果与正常水平相比较，CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的水平增加，那么将所述患者诊断为具有脓毒性并发症或者处于形成脓毒性并发症的危险中。

Description

脓毒性并发症的诊断

本发明涉及脓毒性并发症(septic complication)的诊断。

术语“脓毒症”用于描述与伴随有感染的炎症的全身表现相关的各种临床病状。由于与继发于非感染性病因学的炎症应答的临床相似性，鉴定脓毒症已成为特别有挑战性的诊断问题。在这个方面，已提供了关于“全身性炎症应答综合征(Systemic Inflammatory ResponseSyndrome)”(或“SIRS”)的定义，其一般是指对于感染性或非感染性损害的严重的全身性应答，并且还提供了关于相关的综合征“脓毒症”、“严重脓毒症”和“败血性休克”的定义(Bone等人，Chest101：1644-53，1992)。SIRS可以涉及感染和众多非感染性病因学，包括创伤。

尽管可采用抗生素和支持疗法，脓毒症仍为发病率和死亡率的重要原因。已研究了几种实验室测试，以用于与受试者的完整临床检查相结合地用于脓毒症的诊断/预后(Giamarellos-Bourboulis等人，Intensive Care Med.28：1351-56，2002)。

已讨论了几种分子标志物，以促进人和几种动物物种中脓毒症的诊断和治疗监控。最广泛使用的可能是CRP(C反应蛋白)和PCT(降钙素原)。作为脓毒症的潜在生物标志物，还已讨论了各种白介素。然而，由于缺乏特异性，它们目前具有有限的用途。例如，Carrigan等人(Clinical Chemistry 50(8)(2004)1301-1314)报告了下述的在人中这些标志物的灵敏度和特异性：

这些数据显示，即使在其中脓毒性病模式被深入研究的人类中，当前的标志物的灵敏度和特异性也可以(即使作为平均值)分别低至33％和66％，更不用说目前公开的数据的均一性。

这些数据显示，明确存在有关于具有改善的临床特征的新型诊断标志物的需要。因此，脓毒症的诊断，尤其是脓毒症的早期诊断，仍是临床医学中的极大需要。最佳诊断应当揭示出具有形成脓毒症的危险的人或者处于脓毒症的早期阶段的人。在下列文献中已提出或公开了CNP和NT-proCNP在动物脓毒症模型中的使用或用作脓毒症标志物：WO 01/14885 A2，Hama等人(BBRC 198(3)(1994)：1177-1182)，Prickett等人(The New Zealand Medical Journal 115(1157)(2002)：第6页)或WO 2006/071583 A2。

然而，脓毒症的诊断被证实在特殊领域中，尤其是在重症监护医学(intensive care medicine)中是不同的和复杂的。在这些领域中，所描述的脓毒症标志物常常不是足够可靠的。特别地，在受到多重创伤的患者中，此种诊断常常是非常困难的，因为存在有干扰在标准重症监护医学中所测量的“正常”生理学值和参数的其他病理学过程。

受到多发性创伤的(polytraumatised)患者中的脓毒性并发症的诊断是非常特殊的问题，在重症监护医学中对于其存在有高度的需要。

因此，本发明的目的是提供用于在已处于重症监护中的患者中，特别是在受到多发性创伤的患者中诊断脓毒症的合适方法。

因此，本发明提供了用于在受到多发性创伤的人患者中诊断脓毒性并发症的方法，所述患者无外伤性脑损伤，该方法通过下列方式来进行：测定这个患者中的人C型钠尿肽(CNP)或其前体或其片段，尤其是C型钠尿肽的前体的N-末端片段(NT-proCNP)的水平；并且如果与正常水平相比较，NT-proCNP的水平增加，那么将所述患者诊断为具有脓毒性并发症或者处于形成脓毒性并发症的危险中。

特别地，在人患者的重症监护医学中，CNP被证实是极佳的用于诊断受到多发性创伤的患者中的脓毒性并发症的诊断工具，然而，令人惊讶的是，本诊断仅对于无外伤性脑损伤的那些患者具有高度的可靠性和极佳的稳固性。

在本发明的过程中，收集了这样的临床数据，所述临床数据显示，人CNP、其前体或这些前体的片段的使用有益于在特定患者群体中鉴定出具有脓毒症的患者，尤其是早期脓毒症，或者甚至具有形成脓毒症的危险的人。特别地，NT-proCNP，即C型钠尿肽(CNP)前体的N-末端片段，已被证明是在受到多重创伤的患者中的脓毒症危险分级之中合适的与脓毒症有关的诊断/预后标志物。由于其稳定性、丰富性和容易检测，这种分子是特别合适的。

钠尿肽在钠调节和血压控制中起重要作用。CNP是在血管内皮细胞中产生并且可能在脉管系统中起重要的旁分泌作用的钠尿肽家族的成员。心房钠尿肽(ANP)和脑钠尿肽(BNP)强烈地刺激CNP的分泌。BNP引起比ANP大得多的刺激效应，并且ANP还显著地增强在牛动脉内皮细胞中表达的新的CNP蛋白(翻译)和mRNA的产生。

血浆钠尿肽水平受到许多因素(包括年龄和性别)的影响。在健康群体中，N-末端ANP(NT-ANP)、BNP和NT-BNP的血浆水平可变地受到临床协变量(covariates)的影响。虽然所有这三种肽在女性中更高，但仅NT-ANP和NT-BNP受年龄的影响。所有肽的水平与心率逆相关。与NT-ANP和NT-BNP不同，血浆BNP不受年龄的影响。血浆钠尿肽水平已被考虑用于诊断心力衰竭。在大多数具有起搏器的患者中注意到BNP和NT-ANP显著升高。已报道，由于收缩功能受损、年龄、肾功能受损、心脏缺血和增大以及某些药疗法，血浆N-末端proBNP浓度增加。血浆N-末端proBNP的增加已被视为比通过超声心动图测量而鉴定的异常更早的关于异常心脏功能的征兆。在这个方面，已提出，通过考虑NT-ANP和NT-BNP两者而鉴定出比单独的任一种肽更多的处于死亡或心力衰竭危险中的患者(Squire IB等人(Clin Sci(Lond).2004 Sep；107(3)：309-16))。

已显示，在具有慢性心力衰竭的患者中CNP由心脏产生，但以比ANP或BNP低得多的程度。此外，它在脑和内皮中以高数量表达。在有症状的患者中研究了血浆氨基末端C型钠尿肽(NT-CNP)作为心脏功能的标志物的潜能。这些发现暗示了通过基于内皮的血管舒张肽CNP，来自外周脉管系统的对于心力衰竭的可能的代偿性应答。

尽管CNP可以在广泛的基础上作为脓毒症的标志物而应用于人和动物，但应当记住，当由于可能遮蔽或抵消给定标志物的标志功能的特定环境而引起单种标志物不一定足够时，始终必须考虑特定适应症的存在。

然而，令人惊讶的是，这种CNP、其前体及其片段，尤其是NT-proCNP对于受到多发性创伤的人患者中的脓毒症来说是合适的标志物。值得注意的是，在受到多发性创伤的人患者中根据本发明的脓毒症诊断的重大意义在特定患者群体中显著明显的：受到多发性创伤的(即，受到多重创伤的)患者(即，具有超过一个的创伤的患者)，除了具有外伤性脑损伤的患者外。在本发明的过程中所进行的研究之中，就脓毒性并发症和后果来检查在具有和不具有外伤性脑损伤(TBI)的受到多重创伤的患者中NT-proCNP(CNP前体的N-末端片段)的长期特性谱(profile)(选择NT-proCNP是因为它以更高的量进行循环并且比活性激素CNP更稳定，然而，所有CNP前体及其片段(如果原则上在患者中可检测到)原则上均可以用于根据本发明的评估，但使用稳定且易于检测的形式对于在临床实践中的使用来说当然是优选的)。就其NT-proCNP特性谱来评估通过计算机体层摄影术验证的具有或不具有TBI的受到多重创伤的患者(multiply traumatisedpatient，MTP)。令人惊讶地，在具有或不具有TBI的患者中发现了不同的NT-proCNP特性谱。NT-proCNP水平在不具有TBI的形成脓毒性并发症的MTP中显著更高，而NT-proCNP水平在具有TBI的形成脓毒性并发症的MTP中更低。在非存活者中，在死亡前NT-proCNP水平急剧增加。值得注意的是，NT-proCNP血浆特性谱在具有TBI的形成脓毒性并发症的MTP和不具有TBI的形成脓毒性并发症的MTP之间明显不同。

术语“脓毒症”或“脓毒性并发症”在本申请中同义地使用，并且被理解为包括“脓毒症”、“脓毒性并发症”、“严重脓毒症”、“败血性休克”、“全身性炎症应答综合征”(或“SIRS”)以及甚至其早期阶段，所有症状与伴随有感染的炎症的全身表现相关。

当然，本诊断应用于被怀疑具有脓毒性并发症的受到多发性创伤的患者和/或处于形成脓毒性并发症的危险中的患者。根据本发明的诊断始终着眼于脓毒性并发症来进行。这是考虑到CNP(其已知作为慢性心力衰竭的标志物)的诊断历史而作出的自我理解。此外，在那种联系中，已经以心脏功能为目的分析了CNP水平，以将这个CNP标志物与其他诊断标志物相关联。因此，使用CNP作为标志物的本脓毒症诊断不一定适合作为“绝对的”标志物，但对于用于诊断在患者中是否存在脓毒症或者是否预期出现脓毒症来说是有用的。然而，只有当在给定患者中怀疑有脓毒性并发症或者存在有出现脓毒症的危险时，才询问这个诊断问题。

优选地，患者中的CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的水平通过测定所述患者的血液、血清或血浆样品中的CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的量来进行测定。尽管根据本发明的该水平的测定在患者的其他组织或体液中(例如，在脑脊液(liquor)、淋巴液、尿等中)也是可能的，但源自患者血液的样品是优选的，因为此类样品无论如何都是存在的，并且根据本发明的标志物的水平是可容易检测的。鉴于重症监护患者的一般状况，组织样品通常是不实际的。

在根据本发明的方法中，通常通过常规方法将测得的CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的水平与“正常”水平进行比较(例如，通过关于正常水平的了解，或者通过将测得的水平与在不具有脓毒症或不具有形成脓毒症的危险的患者中测量出的水平直接比较)。还可以进行这种比较，以比较显示出“正常”水平的同一患者的先前测定结果。另一方面，所述诊断也可以基于(例如，已形成了脓毒症的患者的)CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的“脓毒症”水平的了解或平行测定结果。因此，根据本发明的优选方法的特征在于，所述正常水平是不具有脓毒性并发症或者不处于形成脓毒性并发症的危险中的受到多发性创伤的患者的水平。

还可以将CNP测定的结果与绝对值相比较，如果用于测定的方法适合于提供此类绝对值的话。同样地，在此处，NT-proCNP的使用是优选的，因为对于pre-proCNP的该片段(CNP的前体和NT-proCNP)可以容易地提供此类绝对值(或：临界值，超过该临界值可能指示存在有脓毒症)。例如对于欧亚人，NT-proCNP的“正常”范围为2-2.5皮摩尔/l。对于本发明的方法来说，增加的水平(例如，优选地超过正常水平至少50％，更优选地超过正常水平至少70％，尤其是超过正常水平至少100％(在医学诊断学中通常使用的给定组的人的正常水平(例如，种族、危险因素(营养行为，等)))表明诊断出脓毒性并发症。因此，优选的是，如果NT-proCNP的水平高于4pM(皮摩尔/1)，那么将该患者诊断为具有脓毒性并发症或者处于形成脓毒性并发症的危险中。

优选地，通过使用抗NT-proCNP抗体来测定NT-proCNP。当然，任何其他CNP、其前体或其片段也优选地使用针对它们的特异性抗体来测定。

脓毒症也是兽医学中的问题，即对于作为患者的非人动物(“动物患者”)来说。在兽医学中，存在着对于与人类医学中所使用的参数基本上相同的参数的研究。例如，在Pusterla等人的研究(Am.J.Vet.Res.67(6)(2006)，1045-1049)中，已经通过PCR方法研究了TNF-α、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、降钙素原(PCT)和转化生长因子(TGF)-β。然而，仍然缺乏对于在各种动物物种中循环的类似分子具有足够的交叉反应性或者特异的已为大家认可的免疫测定法。缺乏合适的测定法是非常令人惊讶的，因为存在着急迫需要此类测试的大市场，尤其是对于伴侣动物例如犬、猫和马。人们愿意大量花费在动物护理上，这是由于与宠物的情感关系或者由于动物的价值(竞赛运动用动物、贵重的育种动物)；例如，在2006年，美国公民花费了385亿美元用于他们的宠物。这个总数的大约四分之一用于兽医学服务。由此得出结论，在兽医学领域中，脓毒症的合适诊断也是高度需要的。

因此，本发明提供了用于在受到多发性创伤的动物患者中诊断脓毒性并发症的方法，所述患者无外伤性脑损伤，该方法通过下列方式来进行：测定这个患者中的C型钠尿肽(CNP)或其前体或其片段，尤其是C型钠尿肽的前体的N-末端片段(NT-proCNP)的水平；并且如果与正常水平相比较，NT-proCNP的水平增加，那么将所述患者诊断为具有脓毒性并发症或者处于形成脓毒性并发症的危险中。

待根据本发明进行诊断的优选的动物患者是具有高度科学或个体价值的哺乳动物，特别是牛、鹿、动物园动物、宠物、实验室动物或工作动物。当然，本发明限于具有CNP(尤其是以与人相当的功能)的动物。在本发明中特别优选的动物患者是牛、绵羊、山羊、马、驴、牦牛、猪、大鼠、小鼠、猫、犬、仓鼠、鱼、蛙、爬行动物、豚鼠、象、熊或猴患者。事实上，尽管与犬类动物/猫类动物的NT-proCNP或者与其他动物的NT-proCNP的序列差异，人抗体仍然具有令人惊讶地良好的反应性(反之亦然)，这表明根据本发明的测定法可以对其中已知存在CNP的所有动物发挥作用(即使使用来自不同物种的交叉反应性抗体)。

在临床实践中，尤其是在重症监护医学中，NT-proCNP优选地通过使用用于人或动物NT-proCNP的免疫测定法试剂盒来进行测定。为了这个目的，根据本发明可以使用用于人或动物NT-proCNP或其抗原性片段或者甚至缺乏CNP活性的其多肽延伸(polypeptide extension)的免疫测定法，其中因此初级结合伙伴是针对这些分子的单克隆或多克隆抗体。免疫测定法的方法当然是本领域众所周知的，例如，RIA、ELISA、荧光免疫测定法(FIA)或干的化学测试条免疫测定法。一般地，在根据本发明的方法中，此类免疫测定法将会使用固定化形式的(例如，在微量滴定板、膜或珠上的)针对CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的单克隆或多克隆抗体，以分离例如靶NT-proCNP化合物。在夹心式测定法(sandwich assay)中，可以使用根据本发明的另外的可溶性抗体来标记所结合的抗原，所述另外的可溶性抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以携带标记，或者更方便地其自身可以随后通过与携带标记的二抗反应而被标记。

特别优选的免疫测定法是由Biomedica Gruppe(AT)开发的NT-proCNP测定法，其基于用多克隆的抗NT-proCNP抗体预包被的微量滴定装置。

因此，如果根据本发明的一抗在小鼠或兔中产生，那么经标记的二抗可以是抗小鼠或抗兔抗体。

合适的标记包括放射性核素、荧光物质(例如基于铕的荧光团)、酶(例如在采用自动化杂合方法(automated hybrid methods)的ELISA系统中所使用的酶)或者染料或有色颗粒(例如胶体金)。

备选地，可以使用竞争性结合测定法，其中将已知量的例如经标记的人NT-proCNP或者其抗原性片段或无活性的延伸(extension)加入到分析物溶液中，并且与有限量的固定化的单克隆或多克隆抗体接触，由此被固定化的经标记的抗原的量与分析物中存在的靶抗原的量成反比。

本发明还包括将用于人或动物CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的免疫测定法的试剂盒用于根据本发明的诊断方法，所述试剂盒包含：

(a)固定化形式的针对CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的单克隆或多克隆抗体，

以及选自下列的至少一种另外的组分：

(b)经标记的CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的样品；

(c)非固定化形式的所述单克隆或多克隆抗体；

(d)对于所述抗体(c)特异的经标记的二抗。

因此，本发明尤其在医院重症监护背景中具有重要用途，在所述医院重症监护背景中监控这个参数是有利的。

如上所述，对于其来施行所述免疫测定法的体液可以是人或动物NT-proCNP位于其中的任何体液，但方便地是血浆或血清。在某些情况下，在进行测定法之前提取所述肽或者处理样品可能是方便的。

对于在根据本发明的用于诊断动物患者的试剂盒中的CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP，以及针对其的抗体，必须配备同源蛋白质(包括所述前体或片段)和针对其的抗体，或者配备异源蛋白质(即，来自另一物种的CNP、其前体或片段)，其使得交叉反应性抗体成为可能。因此，根据本发明的试剂盒(尤其是对于动物患者)可以包含同源CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP，以及针对此类同源CNP、其前体或其片段的单克隆和/或多克隆抗体，或者包含异源CNP标准和交叉反应性抗体。特别令人惊讶的是，例如犬或猫CNP蛋白或肽可以被例如针对CNP的人抗体识别，这是因为对于例如proANP来说，1或2个氨基酸交换已显示足够达到完全消除免疫反应性，尽管在来自各种动物和人的CNP之间存在有相对较高的同源性。

通过下列实施例和附图来进一步描述本发明，但并不局限于此。

图1显示了在不具有TBI的具有/不具有脓毒性并发症的MT患者中的CNP特性谱(图1A)，在具有孤立性TBI(isolated TBI)的具有/不具有脓毒性并发症的MT患者中的CNP特性谱(图1B)，和在具有TBI的具有/不具有脓毒性并发症的MT患者中的CNP特性谱(图1C)。

图2显示了在不具有TBI的MT患者中的CNP特性谱(存活者/非存活者(survivors/non-survivors)；图2A)，在TBI患者中的CNP特性谱(存活者/非存活者；图2B)，和在TBI+MT患者中的CNP特性谱(存活者/非存活者；图2C)。

图3显示了ISS≤25对ISS≥25(脓毒症/非脓毒症(sepsis/non-sepsis)；图3A)，ISS≤25对ISS≥25(存活者/非存活者；图3B)，和通过ISS≤25对ISS≥25的相关的CNP特性谱(图3C)。

实施例：

实施例1：在受到多发性创伤的患者中的临床研究

通过使用根据本发明的方法来施行临床研究。在本研究中，就脓毒性并发症和后果来测定在具有和不具有外伤性脑损伤(TBI)的受到多重创伤的患者中NT-proCNP(CNP前体的N-末端片段)的长期特性谱(如上所述，选择NT-proCNP是因为它以更高的量进行循环并且比CNP更稳定)。

患者和方法

研究方案依照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的标准。在由一般事故保险机构伦理委员会(Ethics Committee of theAllgemeine Unfallversicherungsanstalt)批准后，从2002年2月到2003年9月，在入院到两个进行参与的2级创伤中心中任一个之中的所有患者中进行这个回顾性研究。对于包括而言，要求下列标准：孤立性TBI，不具有TBI的多重创伤(MT)或具有TBI的多重创伤(TBI+MT)，在创伤后8小时内入院到创伤中心之中，在创伤后12小时内抽取第一次血样，患者年龄＞17岁，损伤严重度得分(Injury SeverityScore，ISS)＞16，所需要的在重症监护病房中的治疗。TBI被定义为简略损伤得分(Abbreviated Injury Score，AIS)≥3的对脑的创伤，所述简略损伤得分在入院时通过计算机辅助体层摄影术来验证。脓毒症被定义为全身性炎症应答综合征(SIRS)的4个标准中的至少2个标准与脓毒性病灶或±3天的阳性血液培养的组合。由用于常规评估而取样的血液来进行所有回顾性NT-proCNP测量。

在入院时以及其后在下列时段期间每天测量血清NT-proCNP：创伤后＜12小时、12-24小时、以及第2-16天。所有测量都基于在每个时段处的实际样品大小，因为所有患者未存活至创伤后第16天。将全血取样到无菌试管(Vacuette，Greiner Company，Vienna，Austria)中。样品在1500xg下离心20分钟，并且将血清贮存于-70℃。测量通过Biomedica(Austria)的NT-proCNP酶免疫测定法来测量NT-proCNP。该测定法的下限检测阈值为0.55皮摩尔/1，而正常范围是0-40皮摩尔/l。

根据高级创伤生命支持(Advanced Trauma Life Support)指导方针和创伤处理方案来进行创伤处理。在通气支持过程中施行使用舒芬太尼(Janssen & Cilag Pharma，Vienna，Austria)和丙泊酚(AstraZeneca，Vienna，Austria)的镇痛(analgosedation)，并且所有患者接受联合的肠胃外和肠内营养支持。当需要处理在血液动力学方面高度不稳定的患者时，插入Swan Gantz导管(Arrow热稀释法导管(Arrow thermodilution catheter)AH-

Novomed Co，Vienna，Austria)。室的和/或实质的导管(Spiegelberg导管

Schwandtner Co.，Linz，Austria)用于测量具有TBI的患者中的颅内压。由相同的神经病学家来每天施行实验室检查以及神经病学随访，并且所有患者处于由主治麻醉学家和护理小组来进行的连续不断的临床观察之下。

统计学：

在各个时段期间比较血清NT-proCNP水平，并且关于在孤立性TBI、具有TBI的MT或不具有TBI的MT的情况下的“脓毒症”对“非脓毒症”的发生和死亡率(“非存活的”对“存活的”)，通过Mann-Whitney U检验来进行统计学评估。根据Hochberg & Benjamini(Stat Med.19909：(7)：811-8)，就多次使用来校正显著性。P＜0.05被认为是统计学上显著的。

在创伤后不同的时段(＜12小时，24小时，以及第2-16天)期间，通过在创伤后这些时段期间的最大血清水平的观测者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析(Metz，Sem.Nucl.Med.1978 8(4)：283-298)，分别地对于孤立性TBI以及对于具有多重创伤的TBI测定用于脓毒症预测的截止NT-proCNP血清水平。通过使用用于阳性预测的一系列“截止”值，所述ROC曲线将“灵敏度”对“100-特异性”进行绘图。曲线下面积(AUC)是预测精确度的量度，在完全偶然的情况下其≤0.5，并且当精确度增加到100％灵敏度和特异性时增至1。因为阳性和阴性预测值随死亡率而变化，所以加入了灵敏度和特异性以具有独立于疾病现患率(diseaseprevalence)的参数。使用Medcalc统计软件(Medcalc Software，Mariakerke，Belgium)来进行计算。

结果

该研究包括53位患者，他们的人口统计数据(demographic data)呈现于表2中。

表2：人口统计数据

	所有患者	脓毒症	非脓毒症
				总数(n)	53	30	23
男性(n)	47	27	20
				女性(n)	6	3	3
年龄(中值)(q1，q3)	36(32，48)	36(33，44)	38(25，58)
				TBI(n)	15	5	10
MT(n)	23	16	7
				TBI+MT(n)	15	9	6
死亡原因TBI(n)	7	1	6
				死亡原因MOF(n)	5	4	1
存活者(n)	41	25	16
				非存活者(n)	12	5	7
ISS≤25(n)	21	7	14
				ISS≤25(中值)(q1，q3)	20(15，25)	25(13，25)	19(15，25)
ISS＞25(n)	32	23	9
				ISS＞25(中值)(q1，q3)	41(34，57)	41(32，46)	50(41，57)
SIRS	39	30	9

NT-proCNP水平在不具有TBI的形成脓毒性并发症的MT患者中比在非脓毒症患者中显著更高。NT-proCNP水平在具有TBI的形成脓毒性并发症的MT患者中比在非脓毒症患者中更加低(图1A，B)。用于在不具有TBI的MT患者中预测脓毒症的NT-proCNP的ROC曲线分析和AUC计算呈现于表3中。在创伤后第2-8天时测得AUC值在0.653和0.875之间(最大可达到值为1)。

表3：根据观测者操作特征(ROC)曲线的计算

创伤后的天数	疾病现患率	AUC±SE	置信区间	截止值(pmol/L)	灵敏度	特异性
							0	71.4	0.762	0.468-0.940	0.23	90.0	75.0
1	72.7	0.755±0.108	0.527-0.910	0.21	93.8	66.7
							2	72.2	0.780±0.101	0.556-0.926	1.60	87.5	83.3
3	69.6	0.857±0.079	0.649-0.965	2.24	93.8	85.7
							4	69.6	0.866±0.076	0.660-0.969	2.20	87.5	85.7
5	69.6	0.875±0.073	0.671-0.973	2.63	93.8	85.7
							6	71.4	0.811±0.096	0.583-0.945	1.04	100	66.7
7	71.4	0.711±0.119	0.475-0.884	1.06	93.3	66.7
							1至8	71.4	0.774±0.036	0.705-0.834	2.31	81.6	76.0
2至8	71.2	0.797±0.036	0.725-0.858	2.31	89.0	75.0

当多器官衰竭是死亡原因时，NT-proCNP水平在非存活者中比在存活者中更高，但当死亡原因是TBI时不是如此(图2A，B)。在创伤后的所有时段期间，与存活者相比较，在具有TBI+MT的非存活者中的血浆NT-proCNP水平无显著不同(图2C)。

通过比较具有或不具有脓毒性并发症的患者，ISS在具有下列状况的组之间并无不同：孤立性TBI，TBI+MT，或不具有TBI的MT(图3A)。仅在不具有TBI的MT患者中，ISS在非存活者中比在存活者中显著更高(图3B)。NT-proCNP水平在具有低于或高于16的ISS的患者之间并无不同(图3C)。

讨论

几乎没有研究比较过在受到多发性创伤的患者中不同钠尿肽的相对预后价值。根据本发明的研究涉及将CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP鉴定为和用作在受到多重创伤的患者中的脓毒症危险分级之中与脓毒症相关的诊断/预后标志物。根据本发明，就脓毒性并发症和后果，在具有和不具有外伤性脑损伤(TBI)的受到多重创伤的患者中研究了CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP。选择NT-proCNP是因为它以更高的量进行循环并且比活性激素CNP更稳定。在本研究中，显示出，NT-proCNP血浆特性谱在具有和不具有TBI的形成脓毒性并发症的MT患者之间明显不同。在创伤后第2天开始，与非脓毒症患者相比较，在不具有TBI的形成脓毒性并发症的受到多重创伤的患者中，血浆NT-proCNP水平显著更高。在创伤后的所有时间点上，血浆NT-proCNP水平在具有孤立性TBI的形成脓毒症的患者中比在非脓毒症患者中更加低，这表明在具有或不具有TBI的患者中有着不同的基础性调节机制。

通过作为早期充血性心力衰竭指示剂来比较N-末端ANP、BNP和CNP激素原，发现ProANPs 31-67是在区分CHF受试者与健康个体中最灵敏的标志物。在充血性心力衰竭患者中，血浆CNP升高与临床和功能的疾病严重度相关。在具有各种心血管病症的患者中，发现CNP的血浆水平在具有败血性休克的患者中显著增加，而在具有充血性心力衰竭或高血压的患者中无改变，但在具有慢性肾衰竭的患者中血浆CNP水平增至2倍。在根据本发明的研究中，用于在不具有TBI的MT患者中预测脓毒症的NT-proCNP的ROC曲线分析和AUC计算揭示出，血浆NT-proCNP水平是在区分具有/不具有脓毒性并发症的患者中灵敏的标志物。

在本研究中(同时也公开在Bahrami等人，Inflamm.Res.56(Suppl2)(2007)：S104(A81)中)，在每个组(TBI，MT，TBI+MT)中的创伤后脓毒性并发症与ISS无关。类似地，血浆NT-proCNP水平不与ISS相关，并且在具有低于或超过25的ISS的患者之间并无不同。

在不具有TBI的受到多重创伤的非存活者(n＝2)中，血浆NT-proCNP水平在死亡前急剧增加。相反地，在所有时间点上，在具有孤立性TBI的患者中，血浆NT-proCNP水平在非存活者中比在存活者中更低。然而，差异未达到显著水平，这最可能是因为每个组中的患者的数目有限。

已公认CNP，而不是ANP或BNP，通过激活环GMP依赖性激酶和BKCa2+通道来松弛人阻力动脉。此外，已报道，伴随着由鸟苷酸环化酶-连接的钠尿肽受体(在犬心脏中可能是B型受体)介导的窦率(sinus rate)的增加，CNP增加心肌收缩力，这暗示对于CNP的增强收缩力的应答受到环腺苷酸(cAMP)依赖性信号转导的影响。因为CNP广泛存在于内皮中，所以它可能在生理学和病理学情况下在人中调节外周阻力之中起作用。在脓毒症背景中CNP的病理生理学重大意义仍未清楚了解。

总之，由本研究可以显示，NT-proCNP血浆特性谱在具有和不具有TBI的形成脓毒性并发症的MTP之间明显不同。根据用于在不具有TBI的受到多重创伤的患者中预测脓毒症的ROC曲线分析和AUC计算，CNP、其前体或其片段，尤其是NT-proCNP的血浆水平是在区分具有/不具有脓毒性并发症的患者中灵敏的标志物。

实施例2：在人和动物患者中的脓毒症诊断

根据从人血清/血浆样品中获得的结果(其中显示了NT-proCNP用于脓毒症的诊断和治疗监控的标志功能)(也可参见：上文的实施例1)，研究了CNP对于动物中的脓毒症的标志功能。

用于收集这些数据的抗体针对人NT-proCNP的氨基酸1-19和30-50。

某些物种的氨基酸序列可在文献中得到，已获得了关于其的同源性数据。下表概括了关于在该研究中所使用的表位的那些数据中的一些。

表4：人NT-proCNP和各种动物物种的氨基酸1-19(A)和30-50(B)

(A)

(B)

如可以看出的，与人序列存在有几个偏差(标示为红色)。尽管氨基酸序列的甚至少数几个差异也可能导致人测定法的失败，但令人惊讶地证明这不是本发明的情况。

例如，靶向人NT-proANP的AA 1-30的NT-proANP抗体不识别相应的犬类序列，尽管存在有与犬类序列的显著同源性。

令人惊讶地，当对于犬类或猫类起源的脓毒症样品进行测试时，人NT-proCNP ELISA抗体显示出极佳的性能。实验和结果在下文更详细地描述。

材料和方法

基本上如人NT-proCNP ELISA试剂盒(BI-20872)的包装说明书中所述的来进行所述测试，无进一步的改动。简要地，该方法包括下列步骤：

1.样品收集：

通过静脉穿刺从非禁食受试者中抽取样品到(GreinerBio-One)管中：EDTA管：9ml。将所述管维持于4℃直至血浆分离(离心参数：在2000xg和4℃下20分钟)。在分离后将所有样品立即置于-20℃，并且在一次测定法运行中一起进行测定。

2.ELISA操作程序：

将50μl STD/SAMPLE/CTRL(标准/样品/对照)一式两份地加入到各自的孔中，除了空白外。

将200μl CONJ(抗NT-proCNP-HRPO)加入到每个孔中，除了空白外，并且轻轻涡旋。

紧紧盖上盖子，并且在室温(18-26℃)下于黑暗中温育4小时。

抽吸出孔中的液体，并用300μl稀释的WASHBUF(洗涤缓冲液)洗涤孔5次；在最后一次洗涤步骤后通过靠着纸巾击打平板来去除剩余的WASHBUF。

将200μl SUB(底物，四甲基联苯胺)加入到每个孔中。在室温(18-26℃)下于黑暗中温育30分钟。将50μl STOP(终止溶液，1NH₂SO₄)加入到每个孔中。如果可得，使用参照620nm，立即在450nm处测量吸光度。

结果和讨论

通过用上文描述的方法分别对13只正常和脓毒症动物进行测定，产生了下表中所描述的结果。从采用NT-proBNP测量的实验中，预期犬和猫显示出类似的免疫反应性。在那里，所述分析不与物种相匹配。

表5：来自动物试验的结果

物种

NT-proCNPpmol/L

年龄

性别

物种

NT-proCNPpmol/L

年龄

性别

nor 01

犬

0.0

1.0

m

Seps01

犬

1.1

12

m

nor 02

犬

0.0

12.0

f

Seps02

犬

6.4

14

m

nor 03

犬

0.2

4.0

m

Seps03

犬

1.1

7

f

nor 04

犬

0.0

4.0

f

Seps04

犬

5.0

11

f

nor 05

犬

0.0

6.0

f

Seps05

犬

0.3

1

m

nor 06

犬

0.0

15.0

m

Seps06

犬

16.8

10

m

nor 07

犬

0.0

1.0

f

Seps07

犬

0.0

1

f

nor 08

犬

0.0

7.0

f

Seps08

犬

0.0

6

f

nor 09

犬

0.0

4.0

f

Seps09

犬

5.2

11

m

nor10

犬

0.0

5.0

m

Seps10

犬

26.5

8

f

nor11

犬

4.0

0.6

f

Seps11

犬

22.6

0.18

f

nor12

犬

0.0

2.0

f

Seps12

犬

9.9

11

f

nor13

犬

0.9

0.5

m

Seps13

猫

8.6

12

f

表6：动物结果的概括和分析

缩写：N：正常的；S：脓毒症的；

Norxx：正常样品；Sepsxx：脓毒症样品

如从上面的数据中可以看出的，所述ELISA能够以极佳的特异性和灵敏度在那些动物中检测脓毒症。

显示出超过截止值(0.2pmol/L)的水平的那两个正常样品可能是由于动物的低年龄(0.5和0.6岁)而引起的，这在人系统中对于NT-proCNP也显示为如此。

通过这些实验，明显的是，CNP是极佳的关于脓毒症的标志物，以及CNP(尤其是NT-proCNP)的测量是用于人和动物中的脓毒症检测和治疗控制的有价值的新工具。

Claims (3)

1.针对NT-proCNP的单克隆或多克隆抗体在制备用于在受到多发性创伤的人和动物患者中诊断脓毒性并发症的诊断剂中的用途，所述患者无外伤性脑损伤。

2.根据权利要求1的用途，其特征在于，所述人或动物患者是人或哺乳动物患者。

3.根据权利要求2的用途，其特征在于，所述人或动物患者是人、牛、绵羊、山羊、马、驴、牦牛、猪、大鼠、小鼠、猫、犬、仓鼠、豚鼠、象、熊或猴患者。

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