KR102367260B1

KR102367260B1 - 진성성조숙증 의증 여아의 GnRH 자극 반응 결과의 사전예측 방법

Info

Publication number: KR102367260B1
Application number: KR1020170066079A
Authority: KR
Inventors: 안련섭; 김태정; 김창현
Original assignee: 안련섭; (주) 마인즈에이아이
Priority date: 2017-05-29
Filing date: 2017-05-29
Publication date: 2022-02-24
Also published as: KR20180130231A

Abstract

본 발명은 진성성조숙증의 여아의 진성성조숙증 확진검사 (GnRH자극반응검사)의 결과를 미리 판단하기 위한 정보를 제공하는 방법으로, 특히, 진성성조숙증 확진검사에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 만 9세 미만 여아로부터 진성조숙증 확진 검사(GnRH 자극 반응 검사)를 실시하기 이전에 채취한 타액시료에서 코티졸 (cortisol), 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2) 농도를 측정하고 이들 사이의 특정 관계 값을 확인함으로써, 진성성조숙증 확진 검사 (GnRH 자극 반응 검사)에서 의증 여아가 양성 혹은 음성반응 결과를 수득할 것인지를 미리 판단하는 방법 및 기준에 관한 것이다.

Description

진성성조숙증 의증 여아의 GnRH 자극 반응 결과의 사전예측 방법 {Prediction method for responsiveness of GnRH stimulation in girls with suspected central precocious puberty}

본 발명은 여아의 진성성조숙증(central precocious puberty, CPP)의 확진을 위해 수행되는 GnRH 자극반응 검사의 결과를 GnRH 자극반응 검사 시행 이전에 채취한 시료를 통해 그 결과를 사전에 미리 예측할 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 부신피질호르몬 중 코티졸(cortisol) 및 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 성선호르몬 중 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 기반으로 한 부신내분비계 및 생식내분비계의 활성 정도를 파악할 수 있는 지표를 이용하여 성조숙증 판단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 기준에 관한 것이다.

성조숙증(precocious puberty)이란 평균치보다 2 표준편차 이상 2차 성지의 출현이 빠른 경우로서, 일반적으로 여아에서 8세 이전 유방 발달, 9세 이전 음모 발달, 9.5세 이전 초경이 생기는 경우를 말하며, 남아에서는 9세 이전에 고환의 용적이 4 mL 이상 또는 직경이 2.5 cm 이상으로 증가하는 경우를 일컫는다.

시상하부-뇌하수체-생식소 축 활성화의 유무에 따라서 중추성 또는 진성성조숙증(central precocious puberty, CPP)과 말초성 또는 가성성조숙증(peripheral or pseudoprecocious puberty)으로 나눌 수 있다.

진성성조숙증의 확인은 생식선자극호르몬 방출 호르몬(gonadotropin releasing hormone, GnRH) 자극반응 검사를 통해서만 이뤄진다.

진성성조숙증 확진검사를 위해서는 진성성조숙증의증 여아로 부터 GnRH주사 후, 일정 시간간격으로, 반복적으로 (일반적으로 0, 30, 45, 60, 90, 120분) 혈액을 채취하고, 채취한 혈액에서 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH) 및 여포자극호르몬 (follicle stimulating hormone, FSH)의 농도를 측정하여, LH 최고농도가 5 IU/L 이상으로 나타나거나, LH 농도가 기저에서 최소 2-3배 증가되어 나타나거나, LH/FSH 비율이 이상으로 나타나면 사춘기 반응 (pubertal response), 즉, 진성성조숙증으로 판단한다 (성조숙증 진료지침, 대한소아내분비학회, 2011).

국내에서 발표된 연구결과에 의하면, 확진 검사에서 의증 여아의 양성반응(진성성조숙증 확진) 수득률은 33-77%로 제시되어 있다(Kim et al., 2011, Nam et al., 2012, Suh et al., 2013).

진성성조숙증 확진 검사를 위한 장시간(최소 2시간)에 걸친 다회(5-6회)의, 다량의 혈액채취 (총 25-30 mL)는 의증 여아에게 정신적 부담감으로, 의증환자의 높은 음성반응율은 의료진에게 심리적 압박감으로 작용하며(Kim et al., 2011, Nam et al., 2012), 복수의 혈액 시료에서 고가의 LH 및 FSH의 분석비용은 환아 부모에게 경제적 부담으로 이어지게 된다.

확진 검사에서 양성반응을 수득한 여아에게는 성조숙증 치료제를 통해 또래 나이로의 초경지연과 최종 키 손실억제를 목적으로 한 의료적 처치가 이뤄지지만, 음성반응을 수득한 여아는 상기의 확진 검사를 2-3개월 후에 반복해야 하기때문에 여아, 의료진, 환아의 부모의 부담을 배가될 것으로 사료된다.

진성성조숙증 확진 검사에서 높은 음성반응율은 확진 검사를 수행하기 이전에 그 결과를 예비적 판단을 할 수 있는 생화학적 검사 등 객관적인 방법이 제시되어 있지 않기 때문이며 그 결과로 보수적으로 확진검사가 이뤄질 수 있고(성조숙증 진료지침, 대한소아내분비학회, 2011), 이로 인하여 진성성조숙증 최선의 치료방법인 조기의료개입이 지연되어 성조숙증 치료효과, 즉 최종 키 손실의 억제가 유의미하게 나타나지 않을 수도 있다(Bouvattier et al., 1999, Willemsen et al., 2014).

한편, 사춘기 개시는 시상하부-뇌하수체-부신으로 이어지는 부신내분비계(hypothalamus-piyuitary-adrenal axis, HPA axis)의 활성화에 의존하며, 특히 부신내분비계의 DHEA 생성, 분비의 증가가 사춘기 개시에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다(Pinyerd et al., 2005).

사춘기 발달과정에 나타나는 2차 성징발달은 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어지는 생식내분비계 (hypothalamus-pituitary-gonad axis, HPG axis)의 활성화에 의존하며, 특히 생식내분비계의 에스트라디올 (estradiol-17β, E2) 농도 증가가 여아의 유방 등 2차 성징발달 및 장골(long bone)의 길이성장과 성장판 닫힘에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Juul, 2001).

즉, 진성성조숙증은 평균 나이보다 이른 나이에 생식내분비계가 활성화되어 나타나는 현상이며, 생식내분비계와 별개로 생성 혹은 유입된 에스트로겐(지방조직 혹은 환경호르몬)에 의해 유도되는 말초성성조숙증(peripheral precocious puberty)과 구별된다 (Mul et al., 2002).

따라서 GnRH를 주사를 통한 진성성조숙증 확진 검사는 사춘기 개시 이후 나타나는 HPG axis의 활성화 정도를 파악하는 검사방법으로서, 여아에서 GnRH에 반응할 수 있을 정도로 뇌하수체에 GnRH 수용체가 충분히 발현되었을 때 확진반응검사에서 양성반응 (LH, 5IU/L 이상)의 결과가 나오는 것으로 추정할 수 있다.

뇌하수체의 GnRH 수용체의 유전자 발현은 난소에서 주로 생성, 분비되는 E2에 의하여 조절되는바 (Turzillo et al., 1998), 여아의 난소 성숙 즉, 난소의 E2 생성능력 (competence)이 확진 반응 검사에서 양성반응에 직접적으로 영향을 주는 것을 짐작할 수 있다.

여아에서는 사춘기 발달 과정에 성인과 동일한 생식내분비계가 완성되며, 비록 E2의 생성량을 성인여성에 비해 유의하게 낮지만 사춘기 중기에 이르러서는 성인과 동일한 형태의 생식내분비계가 완성된다는 사실을 본 발명자는 앞선 연구를 통해 학계에 보고한바 있다(Kang et al., 2014).

이에 본 발명자는, 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성과 진성성조숙증 확인 반응 검사(GnRH 자극반응)를 실시하기 이전에 진성성조숙증 의증 여아로부터 아침기산 후 일정시간 간격으로 타액을 채취하여, 진성성조숙증 확진 반응 검사(GnRH 자극반응)의 결과에 따라 여아의 시료를 양성반응 및 음성반응자로 구분하고, 각 집단의 참가자(성인 여성, 진성성조숙증 확진 반응 검사에서 양성반응 여아 및 음성반응 여아)의 타액시료에서 부신내분비계의 호르몬 중 코티졸(cortisol), 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 생식내분비계의 호르몬 중 에스트라디올(estradiol-17β, E2)을 측정한 후, 이들 호르몬의 농도를 기반으로 부신내분비계 및 생식내분비계의 활성화 정도를 판단할 수 있는 지표 (코티졸과 DHEA의 몰농도 비율, 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량, E2의 총 분비량, E2의 순수증가 총량)를 각 집단(성인 여성, 진성 성조숙증 확진 검사에서 양성반응 및 음성반응을 나타내는 여아)간 상호 비교를 통하여 진성성조숙증 의증 여아가 진성성조숙증 확진 검사에서 수득할 수 있는 결과 (양성 및 음성 반응)를 진성성조숙증 확진 검사 실시 전에 미리 확인할 수 있는 방법 및 기준을 고안하여 본 발명을 완성하였다.

1. Bouvattier C, Coste J, Rodrigue D, Teinturier C, Carel JC, Chaussain JL, BougnePF. Lack of effect of GnRH agonists on final height in girls with advanced puberty: a randomized long-term pilot study.J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3575-8. 2. Han Kyul Kim, Seung Jung Kee, Ji Yeon Seo, Eun Mi Yang, Hong Jae Chae, Chan Jong Kim. Gonadotropin-releasing Hormone Stimulation Test for Precocious Puberty.Korean J Lab Med 2011;31:244-249. 3. Hyo-Kyoung Nam, Young Jun Rhie, Chang Sung Son, Sang Hee Park, Kee-Hyoung Lee. Factors to Predict Positive Results of Gonadotropin Releasing Hormone Stimulation Test in Girls with Suspected Precocious Puberty. J Korean Med Sci 2012; 27: 194-199. 4. Juul A.The effects of oestrogens on linear bone growth. Hum Reprod Update. 2001; 7: 303-13. 5. Kang JY, Park JY, Chun SI, Suh HS, Lee K, Ahn RS. Puberty-related changes in cortisol, dehydroepiandrosterone, and estradiol-17β secretions within the first hour after waking in premenarcheal girls. Neuroendocrinology. 2014; 99:168-77. 6. Mul D, Oostdijk W, Drop SL. Early puberty in girls. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2002; 16:153-63. 7. Pinyerd B, Zipf WB. Puberty-timing is everything! J Pediatr Nurs. 2005; 20:75-82. 8. Suh J, Choi MH, Kwon AR, Kim YJ, Jeong JW, Ahn JM, Chae HW, Kim DH, Kim HS. Factors that predict a positive response on gonadotropin-releasing hormone stimulation test for diagnosing central precocious puberty in girls. Ann Pediatr Endocrinol Metab. 2013;18:202-7. 9. Turzillo AM, Clapper JA, Moss GE, Nett TM. Regulation of ovine GnRH receptor gene expression by progesterone and oestradiol. J Reprod Fertil. 1998;113: 251-6. 10. Willemsen RH, Elleri D, Williams RM, Ong KK, Dunger DB. Pros and cons of GnRHa treatment for early puberty in girls. Nat Rev Endocrinol. 2014 ;10:352-63. 11. 성조숙증 진료지침 (The Korean Society of Pediatric Endocrinology Clinical Guidelines), 2011.

본 발명의 목적은 만 9세 이하의 여아에서 채취한 타액으로부터 측정한 코티졸(cortisol), 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 기반으로 한 부신내분비계 및/또는 생식내분비계의 활성화 판단지표를 이용한 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 부신내분비계 및/또는 생식내분비계의 활성화 판단지표를 이용하여 수득한 정보를 바탕으로 성조숙증 예측 방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 만 9세 이하의 여아에서 채취한 타액으로부터 측정한 코티졸(cortisol), 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 기반으로 한 부신내분비계 및/또는 생식내분비계의 활성화 판단지표를 이용한 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 성조숙증 예측 방법을 제공한다.

이때, 상기 부신내분비계 활성화 판단지표가 코티졸/DHEA 몰 (mole) 농도 비율(molar F/D ratio) 및/또는 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D ratio-auc (molar F/D-auc))이며, 상기 생식내분비계 활성화 판단지표가 E2의 총 분비량(E2auci) 및/또는 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)인 것을 특징으로 한다.

이 때, 상기 부신내분비계 활성화 판단지표로서

상기 코티졸/DHEA 몰 (mole) 농도 비율(molar F/D ratio)의 기상 25 ~ 35분 후 값이 69 이하인 경우; 및 상기 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D-auc)의 값이 3500 이하인 경우 중 1이상의 경우에

부신내분비계 활성화로 인해 사춘기 발달이 시작되었고, 그 활성화의 정도가 성인의 수준에 이른 것으로 판단하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 생식내분비계 활성화 판단지표로서

상기 E2의 총 분비량(E2auci)의 값이 350 이상인 경우; 및 상기 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)의 값이 100 이상인 경우중 1이상의 경우에

생식내분비계의 활성화로 인해 외현한 가슴발달이 시작되었고, 그 활성화 정도가 성조숙증 확진반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는 수준에 이른 것으로 판단하는 것을 특징으로 한다.

상기 타액은 만 9세 이하의 여아의 기상 후 1시간 이내에 채취한 것이 바람직하고, 특히, 기상 후 5분 미만, 기상 후 25 ~ 35분 및 기상 후 55 ~ 65분에 채취한 것이 더욱 바람직하다.

상기 성조숙증은 중추성조숙증, 진성성조숙증, 말초성성조숙증 또는 가성성조숙증을 포함하고, 바람직하게는 진성성조숙증 또는 중추성조숙증일 수 있다.

본 발명의 방법은 바람직한 일 구체예로서,

a) 만 9세 이하의 여아의 기상 후 1시간 이내에 채취한 타액으로부터 코티졸, DHEA 및 E2의 농도를 측정하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 측정된 농도를 이용해 부신내분비계 활성화 판단지표 값을 구하는 단계로, 이때 상기 부신내분비계 활성화 판단지표가 코티졸/DHEA 몰 (mole) 농도 비율(molar F/D ratio) 및/또는 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D ratio-auc (molar F/D-auc))이며;

c) 상기 a) 단계에서 측정된 농도를 이용해 생식내분비계 활성화 판단지표 값을 구하는 단계로, 이때 생식내분비계 활성화 판단지표가 E2의 총 분비량(E2auci) 및/또는 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)인 것을 포함한다.

한편 상기 b) 단계에서, 상기 코티졸/DHEA 몰 (mole) 농도 비율(molar F/D ratio)의 기상 25 ~ 35분 후 값이 69 이하인 경우에 부신내분비계 활성화로 인해 사춘기 발달이 시작되었고, 그 활성화의 정도가 성인의 수준에 이른 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 b) 단계에서, 상기 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D-auc)의 값이 3500 이하인 경우에 부신내분비계 활성화로 인해 사춘기 발달이 시작되었고, 그 활성화의 정도가 성인의 수준에 이른 것으로 판단할 수 있으며, 이때 상기 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D-auc)은 기상 후 최초 1시간 동안의 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량을 의미한다.

상기 c) 단계에서, 상기 E2의 총 분비량(E2auci)의 값이 350 이상인 경우에 생식내분비계의 활성화로 인해 외현한 가슴발달이 시작되었고, 그 활성화 정도가 성조숙증 확진 반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는 수준에 이른 것으로 판단할 수 있으며, 이때 상기 E2의 총 분비량(E2auci)은 기저 E2 농도로부터 기상 후 최초 1시간 동안 증가 된 E2의 총량을 의미하고, 상기 기저 E2 농도는 기상 직후 또는 기상 직후 5분 미만에 측정된 E2의 농도를 의미한다.

또한, 상기 c) 단계에서, 상기 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)의 값이 100 이상인 경우에 생식내분비계의 활성화로 인해 외현한 가슴발달이 시작되었고, 그 활성화 정도가 성조숙증 확진반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는 수준에 이른 것으로 판단할 수 있으며, 이때 상기 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)은 기저 E2 농도를 기준으로 기상 후 최초 1시간 안에 증가한 최고치 E2 농도에 대한 백분율을 의미한다.

이때, 상기 활성화 판단지표는 GnRH 자극 반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는지를 판단하기 위한 정보로 이용될 수 있다.

특히, 상기 성조숙증 진단을 위한 정보를 이용하여, 진성 성조숙증 확진 검사 (GnRH 자극반응 검사)에서 수득할 수 있는 결과를 예측하는 방법을 제공할 수 있다.

이와 더불어, 본 발명의 상기 방법은 예측의 정확성을 높이기 위해, 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내 코티졸의 농도 증가량이 2.5 nmol/L 미만인 타액을 배제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

즉, 아침 기상 후 최초 1시간 동안의 코티졸의 농도 변화량 확인을 통해 진단 대상에 적합한 시료를 결정할 수 있다.

본 발명에서 유용하게 수득할 수 있는 정보는 건강보험심사평가원 및 대한소아내분비학회에서 제시한 연령기준 (만 9세)에 의하여 만 9세 미만의 여아가 정상적인 나이에 사춘기가 시작되었는지 여부, 여아의 생식내분비축의 성숙 여부 또는 가슴발달 정도의 예측을 포함한다.

또한, 본 발명은 만 9세 미만의 대상 여아의 체내 부신, 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보를 제공할 수 있고, 이러한 정보를 이용하는 모든 용도를 포함한다. 예를 들어, 성조숙증 진단 및 치료에 이용될 수 있다.

본 발명은 진성성조숙증 의증 여아로부터 아침기상 후 최초 1시간 동안 일정시간 간격으로 채취한 타액시료에 포함되어 있는 코티졸, 디하이드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA)의 농도 및 이들의 변화를 이용하여 부신내분비계의 활성 정도를 파악하고, 에스트라디올(estradiol, E2)의 증가율과 분비총량을 분석하고 이를 수치화하여 생식내분비축의 성숙 여부를 파악할 수 있다.

따라서, 성조숙증 확진 검사(GnRH 자극반응 검사)를 실행하기 이전에 진성성조숙증 의증 여아로부터 비침습적으로 채취한 생체시료(타액)를 이용하여 부신 내분비계 및 생식내분비계의 활성 정도를 미리 파악하고 GnRH 자극반응 검사에서 양성반응이 수득 되는 특정 값의 범위 기준을 제공함으로써 확진 검사의 효율성을 제고할 수 있는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아에서 아침 기상 후 최초 1시간 동안의 F/D ratio의 변화를 나타내는 결과이다.
도 2는 성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아 간의 F/D ratio-auc의 차이를 비교한 결과이다.
도 3은 성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아에서 아침기상 후 최초 1시간 동안의 E2의 변화를 나타내는 결과이다.
도 4는 성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아 간의 E2Inc%의 차이를 나타내는 결과이다.
도 5는 성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아 간의 E2auci의 차이를 나타내는 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"성조숙증(Precocious puberty)"은 2차 성징이 평균보다 이른 나이에 나타나는 질환으로서, 현행 우리나라의 기준은 여아에서 8세 미만, 남아에서 9세 미만에 2차 성징의 발달이 나타나면 성조숙증이라 한다. 2차 성징은 여아에서는 유방이 발달하며, 남아에서는 고환의 용적이 4 mL 이상 또는 장경이 2.5 cm 이상으로 커지며, 음모 발달을 포함한다. 본 발명에서 성조숙증은 중추성조숙증, 진성성조숙증, 말초성성조숙증 또는 가성성조숙증을 포함하고, 바람직하게는 진성성조숙증 또는 중추성조숙증일 수 있다.

"진성성조숙증(Central Precocious Puberty, CPP)"은 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어진 생식내분비계가 이른 나이에 활성화되어 나타나는 성조숙증을 의미한다. 이에 반해 시상하부-뇌하수체-생식소의 활성화가 동반되지 않는 경우를 "말초성성조숙증(Peripheral Precocious Puberty, PPP)" 혹은 "가성성조숙증(Pseudo-Precocious Puberty)"이라 하고, 2차 성징은 나타나지만 부분적으로 나타나며, 일반적으로 진행하지 않거나 증상이 소실되는 경우로 조기 유방 발육증(Permature thelarche), 조기 음모 발생증(Premature adrenarche), 조기 초경 발생증(Premature menarche)이 나타난 경우에는 불완전 성조숙증이라고 한다.

"진단"은 특정 병리 또는 생리 상태의 존재 또는 활성 등을 확인하는 것을 의미한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명에서는 인간을 대상으로 하였다.

"확진"은 병을 확실하게 진단하는 것을 의미하며 이를 위해 병의 존재 유무를 판단할 수 있고 객관적으로 증거가 될 수 있는 생리, 생화학적 검사가 수행된다.

"시료" 또는 "샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 액형 조직일 수 있다. 본 발명에서는 타액(saliva), 혈액(blood) 또는 소변(urine)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 타액을 이용한다.

"스테로이드호르몬(steroid hormone)"이란 4원자고리 탄화수소인 스테로이드 고리(사이클로펜타노하이드로페난트렌 고리)를 기본 구조로 가진 호르몬으로, 고등동물이나 사람에게서 볼 수 있는 웅성, 자성의 생식선 호르몬(성선 호르몬)이나 부신피질 호르몬 등이 포함된다.

"생식선 호르몬" 또는 "성선 호르몬"이란 척추동물의 암컷, 수컷의 생식소에서 분비되는 호르몬으로 생식기의 발육을 촉진 시키고 그 기능을 유지시키는 역할을 한다. 웅성의 경우는 정소 중의 간세포(間細胞)이고 자성은 주로 난소(卵巢)의 여포를 구성하고 있는 난구세포 및 협막세포이다.

"생리" 또는 "월경"은 인간의 성인 여성이 주기적으로 난소에서 난자를 만들어 내고 수정되었을 경우 수정란이 자궁에 착상하게 하기 위한 자궁 점막이 수정란의 착상이 없을 때 비후된 자궁내막이 출혈과 함께 질을 통해 배출되는 생리 현상을 말한다. 보통 28일 정도의 주기를 가지며 3~5일 정도 지속 된다. 대개 12~15세 정도로 성장하게 되면 처음 월경을 시작하게 되며, 여성은 일생동안 약 400회의 월경을 하게 되고 이후 45~55세가 되면 폐경기가 되어 월경을 멈추게 된다. 월경으로 흘리는 피는 약 35 mL이며 10~80 mL 이내는 정상이다.

"생리주기(menstrual cycle)"란 내분비계통 호르몬의 영향에 의해 생식기관에 나타나는 규칙적인 변화로 21~35일 사이로 일정치는 않으나, 대개 약 28일을 주기로 반복되며 월경이 시작되는 날부터 다음 월경이 나타날 때까지의 기간을 말한다. 자궁내막과 난소는 여성 호르몬의 분비 정도에 의해 주기성을 나타내는데, 자궁내막이 허물어지면서 출혈을 하는 경우를 월경이라 하고, 난소 내의 난포가 성숙하여 난자를 방출할 때를 배란일이라 한다.

"표지" 또는 "라벨"은 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브(probe) 또는 항체에 컨쥬게이팅(conjugating) 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 일 태양으로 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 특히, 진성성조숙증의 확진 검사의 효율성 제고를 위해 부신내분비계 및/또는 생식내분비계의 활성화 판단지표에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 태양으로 성조숙증 예측 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 수득한 내분비계의 활성화 판단지표 정보를 이용하여 진성성조숙증을 사전에 미리 예측하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "성조숙증"은 2차 성징이 평균치의 표준편차보다 빨리 나타나는 증상으로, 성적 성숙 및 수정 능력을 갖추기 위해 시상하부-뇌하수체-부신으로 이어지는 부신내분비계 및 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어지는 생식내분비계의 기능이 활성화되는 사춘기의 시작을 포함한다. 상기 성조숙증은, 진성성조숙증, 가성 성조숙증 및 불완전형 성조숙증 등의 다양한 유형의 성조숙증을 포함한다. 바람직한 구체예로서는 성조숙증의 확 진검사의 효율성 제고를 위해 필요한 정보제공 및 이를 이용한 진성성조숙증 사전예측 방법에 관한 것이다.

상기한 진성성조숙증(Central Precocious Puberty, CPP)은 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어진 생식내분비축의 활성화로 인하여 나타나는 성조숙증을 의미한다. 이에 반해 생식내분비계의 활성화가 동반되지 않는 경우를 말초성 성조숙증 혹은 가성 성조숙증(peripheral precocious puberty)이라하고, 말초성 성조숙증은 2차 성징은 나타나지만 부분적으로 나타나며, 일반적으로 진행하지 않거나 증상이 소실되는 경우로 조기 유방 발육증, 조기 음모 발생증, 조기 초경 발생증이 나타난 경우에는 불완전형 성조숙증이라한다.

사춘기는 어린이에서 어른이 되는 전이(transition) 시기이다. 이 시기에는 2차 성징의 발달 및 성장이 동반된다. 여아에서는 가슴 및 음모 (pubic hair)의 발달 남아에서는 고환 및 생식기의 크기 발달 및 음모의 발달이 2차 성징의 외현 지표로 이용된다.

여아의 경우 가슴 및 음모의 발달 단계를 각각 5단계로 나눌 수 있고 넓게는 사춘기 이전단계, 초기, 중기, 말기, 성인단계로 나눌 수 있으며, 한국인 여아의 경우 가슴발달이 11.3 ±1.3세, 음모발달이 12.3 ±1.2세에 시작되고, 초경은 12.0 ±1.0세에 시작되는 것으로 보고되어 있다. 성 성숙 특히, 초경율은 유방발달 2단계에서 18.2%, 3단계에서 66.1%, 4단계에서 91.7%, 5단계에서 100%로 알려져 있고, 음모발달 2단계에서 52%, 음모발달 3단계에서 93.8%로 보고되어있다. 이러한 결과는 가슴발달 및 음모 발달이 초경의 시작과 밀접히 연관은 되어있으나 2차 성징의 발달만으로는 초경의 시작을 쉽게 예측할 수 없다는 것을 시사한다.

초경은 정상적인 성인여성에서 나타나는 생리현상이며, 여아에서 성인 여성과 동일한 체내의 신경내분계(생식내분비계)가 완성되었고 정상적인 생식활동을 할 수 있는 체내환경이 조성되었다는 것을 의미한다.

여아의 가슴 및 음모발달은 생식소 및 부신의 호르몬 생성증가와 연관되어 있다. 사춘기의 시작과 함께 생식소 (난소)의 성호르몬 생성증가가 나타나는 현상을 "gonadarche" 부신에서 DHEA 생성이 증가하는 현상을 "adrenarche"라 부르며, "adrenarche"는 "gonadarche" 보다 앞서 나타난다.

성호르몬의 생성증가는 여아의 경우 가슴발달(thelache)을 유도하며 DHEA의 증가는 음모의 발달 (pubarache)을 유도하는 것으로 알려져 있다.

그러나 어느 요인에 의하여 gonadarche 및 adrenarche가 시작되는지에 대해서는 알려져 있지 않다. 1980년 Wildt등은 GnRH 유도체를 어린 원숭이에 간헐적으로 주사할 경우 성조숙을 유도할 수 있고 사춘기의 시작이 뇌하수체 및 난소발달에 의존하기보다는 시상하부의 신경세포에서 GnRH가 방출에 의존한다는 사실을 Science에 발표하였다. 이는 시상하부의 GnRH 신경세포에 저해요인들이 작용하여 GnRH의 방출을 억제하고 있으며 그 억제요인이 제거되면서 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어지는 생식내분비축이 활성화되고 그 축에서 생성, 분비되는 성 호르몬에 의하여 2차성징 (유방)의 발달 및 초경이 유도되는 것으로 해석되어 진다.

본 발명의 코티졸, 디하이드로에피엔드로스테론 (dehydroepiandrosterone, DHEA)의 농도 및 이들의 변화를 이용하여 부신내분비계 및 생식내분비계의 활성화 정도를 판단할 수 있는 지표 (cortisol/DHEA 몰 (mole) 농도 비율, 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량, E2의 총 분비량, E2의 순수증가 총량)로 수치화를 통해, 성조숙증 확진 검사 (GnRH 자극반응 검사)를 실행하기 이전에 진성성조숙증 의증 여아의 부신 내분비계 및 생식내분비계의 활성 정도를 미리 파악하고 GnRH 자극반응 검사에서 양성반응이 수득되는 특정 값의 범위 기준을 제공함으로서 확진검사의 효율성을 제고할 수 있는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.

대상시료

본 발명의 진성 성조숙증 진단검사의 효율성 제고하기 위해 사용하는 시료는 혈액, 소변, 대변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭액, 복수, 흉막, 삼출액 등 일 수 있다.

바람직하게는 타액, 혈액, 소변일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 "타액(saliva)"일 수 있다.

지금까지 호르몬의 농도는 혈액에서 주로 측정하였다. 내분비학 관점에서 보면 혈액은 호르몬의 이동매체로서, 대부분의 혈중 단백질계열 호르몬 (성장 호르몬, 인슐린 등)은 물에 잘 용해되며 (친수성, hydrophilic) 혈중에서는 활성화된 형태로 존재하지만 부신피질, 생식소에서 생성되는 스테로이드는 물에 잘 녹지 않기 (소수성, hydrophobic) 때문에 다른 매체 (운반 단백질)와 결합하여 혈중에 존재한다. 스테로이드가 운반매체와 결합되어 있을 때는 표적기관의 호르몬 수용체에 작용하지 못하기 때문에 '불활성 상태'라 하며 생리적인 기작을 유도할 수 없다. 혈중 스테로이드 대부분(95-99%)은 이러한 불활성 상태로 존재하며 극히 일부 (1-4%)만 운반매체와 결합되어 있지 않은 상태(활성상태)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈중 스테로이드의 농도는 활성 상태의 호르몬의 농도라기보다는 대부분 불활성 상태의 농도라 할 수 있다.

이에 반하여, 타액에 포함되어 있는 스테로이드는 혈액과 달리 모두 운반매체와 결합되어 있지 않은 활성 상태이며 조직외액(extracelluar fluid)에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드가 단순 확산방식(passive diffusion)에 의해 타액샘으로 이동한 것이다. 따라서 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 조직 안에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드로 인식되고 있다.

또한, 타액은 혈액과 달리 의료진의 도움 없이도 개인의 수면주기에 맞추어 일반인이 쉽게 채취할 수 있기 때문에 개인의 호르몬 하루 주기 리듬에 대한 연구를 쉽게 진행할 수 있는 장점을 가지고 있다. 즉, 타액을 이용할 경우 혈액으로 접근이 어려웠던 활성상태의 스테로이드의 농도와 개인의 호르몬 하루 주기 리듬에 대한 접근이 용이하다는 장점이 있다.

본 발명은 타액 내 존재하는 호르몬들의 농도를 측정하는바, 상기와 같은 장점을 효과로 발휘할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 타액은 기상 후 일정 시간 이내에서 일정한 시간 간격을 두고 채취한 것을 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 기상 후 1시간 이내에 채취한 것을 이용할 수 있고, 구체예로서, 타액 등의 시료는 적어도 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분의 3번에 걸쳐서 채취하여 사용하는 것이 바람직하다.

대상 호르몬

본 발명은 생체지표를 활용하여 사춘기가 시작되었는지 여부 및 유방발달 정도를 판단하기 위하여, 상기 시료, 예를 들어, 타액 내 존재하는 "코티졸(cortisol)", "디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA)" 및 "에스트라디올(estraiol-17β, E2)"의 농도를 이용하는 것을 특징으로 한다.

"DHEA"는 비교적 약한 안드로겐 스테로이드로 남성호르몬과 여성호르몬 합성에 필요한 중간단계 물질이다. DHEA는 주로 부신 피질에서 분비되지만 성선(gonad), 지방조직 그리고 뇌에서도 소량이 합성되는 것으로 알려져 있다. 사람의 경우 하루에 DHEA가 약 4 mg 그리고 황산화 형태인 DHEA-s는 약 25 mg 분비되어 혈액 내에서 가장 많은 스테로이드이다.

DHEA의 기능은 아직도 완전히 밝혀지지는 않았지만 작용 기전을 몇 가지로 나누어 생각할 수 있는데 첫째, 성호르몬의 전구물질로서의 기능이 있어 필요한 조직에서 남성 혹은 여성 호르몬으로 변환되어 사용되고, 둘째, 중추신경계에서는 신경활성화 스테로이드로 작용하여 여러 신경 전달물질들과의 상호 작용을 통하여 신경 자극을 조절하며, 셋째, 스트레스 상태에서 코티졸의 역할을 완충해 주고, 넷째, 칼슘 관문 칼륨 통로(calcium gated potassium channel)를 활성화하는 역할을 한다.

"에스트라디올(E2)"은 생식소(난소)에서 생성, 분비되는 호르몬이다. 특히 여성에서 유선의 발달, 자궁내막의 비후에 관여하고 난소의 난자의 성장을 유도하는 호르몬으로 알려져 있다. 특히, E2는 난소의 스테로이드 생성과정 중 최종산물이며 난자의 성장과 자궁비후의 조절자 역할을 한다.

특히, 본 발명에서 에스트라디올 (estradiol)로서 17번 탄소의 하이드록실 그룹 (OH) 위치가 베타형의 에스트라디올(β-estradiol)인 것이 바람직하다. 베타 에스트라디올은 축약하여 E2로 표시하며, 척추동물의 암컷의 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬인 에스트로젠(estrogen)의 한 종류로써, 난소, 태반 등에서 추출, 결정화되는 여포호르몬의 하나이다. 암컷의 생식선을 발달시켜 2차, 3차 성징을 나타내는데, 특히 포유류에서 발정을 일으킨다. 또한, 세포핵에 들어가 새로운 단백질의 합성을 촉진하고, 세포의 증식을 일으키는 작용이 있다. 특히, 베타 에스트라디올은 여성의 몸 안에서 심하게 변동하는 생식호르몬으로, 카페인과 비슷한 작용, 즉 아데노신이 원래부터 가지고 있는 억제효과를 상쇄함으로써, 여성들이 월경 주기 중 여포기 후기, 곧 배란 직전에 경험한다는 가벼운 흥분을 일으키는 물질로 알려져 있다.

정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성에서는 E2의 생성, 분비 또한 일정한 일주기리듬을 나타내며 아침기상 후 최초 한 시간 안에 약 150-200%의 상승이 나타나는 것으로 보고되어 있다. 아침기상 후 E2 농도의 변화는 생리기, 여포기, 배란기에 따라 증가폭 및 분비량이 달라지며 폐경기 여성에서는 아침기상 후 E2 농도 증가가 나타나지 않은 것으로 보고되어 있다.

"코티졸(cortisol)"은 부신피질에서 분비되는 스테로이드 호르몬이다. 부신의 코티졸 생성, 분비는 일중 뚜렷한 리듬으로 나타나며, 코티졸의 하루 주기 리듬(circadian rhythm, 一日週期)은 뇌신경, 시상하부(hypothalamus), 뇌하수체(pituitary)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있고 근본적으로는 개인의 수면주기에 의하여 결정되어 진다. 정상적으로 밤에 수면을 취한 후, 아침기상 후 눈을 뜨면 빛의 신호는 시상하부의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에 도달하게 되고 시교차상핵에서는 생체시계 유전자(clock gene)가 활성화되며 clock gene의 활성화로 인해 SCN에서는 vasoactive intestinal peptide (VIP)와 arginine-vasopressin(AVP)가 생성, 분비된다. AVP는 다시 뇌실옆핵(paraventricularnucleus, PVN)에 전달된다. 뇌실옆핵에서는 이 자극에 반응하여 부신피질자극호르몬 분비호르몬(corticotropin releasing hormone, CRH)을 분비하며, 분비된 분비호르몬은 뇌하수체를 자극하여 부신피질자극호르몬(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)을 생성, 분비하게 된다. 뇌하수체에서 생성, 분비되는 ACTH 농도는 기상 후 15분에 정점(peak)에 이른다. 혈액에 분비된 ACTH는 부신에 작용하여 부신피질에서의 코티졸, DHEA 등 스테로이드 생성, 분비를 증가시키게 된다.

따라서, 최정상 코티졸 농도는 기상 후 30분 정도에 나타나며 이때의 코티졸 농도가 하루 중 가장 높다. 이와 같이 아침에 잠에서 깨어난 후 30분 정도에 코티졸 농도가 정상에 이르는 현상을 기상에 따른 코티졸 반응(cortisol awakening response, 이하 CAR)이라 한다. CAR은 일반적인 수면 환경, 빛, 수면시간 동안 깨는 현상 등에 영향을 받지 않으며, 건강상태에 의하여 많은 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 그러나 기상 직후 첫 번째 타액 시료채취가 10분 이상 지연된다면 CAR 현상을 관찰할 수 없는 것으로 보고되어 있다.

그러므로, 본 발명의 성조숙증 진단을 위한 정확한 정보를 수득하기 위해서 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내의 코티졸 농도 변화가 2.5 nmol/L 이상인 경우의 타액을 대상으로 DHEA 및 E2농도를 측정할 수 있다. 즉, DHEA 및 E2 농도 측정 전에 적합한 타액 시료의 결정을 위해 코티졸의 농도 변화를 추가로 확인할 수 있다. 이때, 아침기상 직후부터 최초 1시간동안 타액 내의 코티졸 농도변화 확인은 아침기상 직후, 기상 30분, 기상 60분에 각각 채취한 타액을 대상으로 할 수 있다.

이처럼, 본 발명은 진성성조숙증 의증으로 내원하는 여아로부터 GnRH 자극반응 검사를 수행하기 이전에 채취한 타액시료에서 부신피질호르몬 중 코티졸(cortisol) 및 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 성선호르몬 중 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 측정하고, 이들 호르몬 농도를 기반으로 한 부신내분비계 및 생식내분비계의 활성 정도를 파악할 수 있는 지표 (코티졸과 DHEA의 몰농도 비율, 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량, 아침기상 후 E2의 증가비, 아침기상 후 최초 1시간 동안 순수하게 증가한 E2의 총량)를 활용하여, 진성성조숙증 진단을 위해 필요한 정보를 제공한다.

또한, 상기 정보를 이용하여, 진성성조숙증 의증 여아가 진성 성조숙증 확진 검사 (GnRH 자극반응 검사)에서 수득할 수 있는 결과를 미리 예측할 수 있는 방법 및 기준을 제공한다.

성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 이를 이용한 성조숙증 예측 방법

본 발명은 만 9세 이하의 여아에서 채취한 타액으로부터 측정한 코티졸(cortisol), 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 기반으로 한 부신내분비계 및/또는 생식내분비계의 활성화 판단지표를 이용한, 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 성조숙증 예측 방법을 제공할 수 있다.

이 때, 상기 부신내분비계 활성화 판단지표로서

또한, 상기 생식내분비계 활성화 판단지표로서

본 발명은 일 실시예로서

c) 상기 a) 단계에서 측정된 농도를 이용해 생식내분비계 활성화 판단지표 값을 구하는 단계로, 이때 생식내분비계 활성화 판단지표가 E2의 총 분비량(E2auci) 및/또는 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)인 것

의 단계를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 방법에 대하여 구체적으로 기술한다.

(1) 대상 여아의 분류

본 발명을 위한 대상 여아의 분류는 보건심사평가원에서 제시한 기준안에 의거하여 2차 성징의 발달이 역령 8세 354일 이전에 나타나는 경우에 성조숙증으로 판단하므로, 성조숙증의 기준 나이를 만 9세로 기준으로 하여 만 9세 미만의 진성성조숙증 의증으로 내원하는 여아를 대상으로 삼는다.

(2) 시료의 준비

본 발명의 시료는 대상 여아의 혈액, 소변, 대변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭액, 복수, 흉막 삼출액일 수 있으며, 바람직하게는 타액, 혈액, 소변 일 수 있고, 가장 바람직하게는 타액일 수 있다.

본 발명의 성조숙증 진단에 사용하는 시료는 규정된 정확한 시간에 채취된 타액으로, 아침 기상 후 5분 미만, 기상 후 25 ~ 35분 및 기상 후 55 ~ 65분에 채취한 타액을 사용하는 것이 바람직하다.

특히, 아침 기상 직후부터 최초 1 시간 동안에 코티졸의 농도가 최소 2.5 nmol/L 이상 증가하는 타액을 사용하는 것이 바람직하다.

정상적인 성인 남, 녀에서 아침기상 후 코티졸의 농도는 50-150% 증가하는 것으로 보고되어 있고, 기상 직후부터 기상 30분 후까지 최소 2.5 nmol/L이 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러나 정상적인 남, 여에서 아침 기상 직후 첫 타액시료의 채취가 10분 이상 지연되었을 경우에는 이러한 코티졸 증가 현상을 관찰할 수 없는 것으로 아울러 보고되어 있다. 기상 후 10분 이상 지연되어 채취된 시료에서는 코티졸 농도 증가현상을 볼 수 없고, 이러한 시료들은 본 발명의 검사에서 제외되는 것이 바람직하다.

타액 등의 시료는 적어도 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분의 3번에 걸쳐서 채취하여 사용할 수 있는데, 검사 대상자가 기상 직후에 바로 시료를 채취했다고 표시하더라도 기상이라는 의미가 개인별 차이가 있기 때문에 아침기상 직후 첫 시료의 채취가 지연되었는지, 규정된 시간에 정확히 채취되었는지 등을 확인하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 방법은 준비된 시료가 분석에 적합한지 여부를 확인하기 위하여 코티졸의 농도 변화를 확인하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

이는 아침기상 후 코티졸의 농도 변화를 통하여 정확한 시간에 시료가 채취되었는지 확인하기 위한 것으로서, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안에 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 경우의 시료로 결정하여 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 기상 직후부터 최초 1시간 동안 시료 내 코티졸의 농도 증가량이 2.5 nmol 미만인 경우 해당 시료를 배제할 수 있다.

(3) 시료 내 코티졸 , DHEA 및 E2의 농도 측정

본 발명에서는 상기 채취한 시료를 이용하여 코티졸, DHEA 및 E2의 농도변화를 수치화하여, 이들 사이의 특정 관계 값을 확인함으로써 사춘기 발달과 관련되어 있는 부신 및 생식내분비선이 성숙되었다고 판단하여 진성성조숙증 판단에 필요한 정보를 수득할 수 있다.

본 발명에서는 대상 여아에서 일정한 시간의 간격을 기준으로 채취한 시료를 통하여 코티졸, DHEA 및 E2 농도를 측정하여 그 농도 변화를 관찰할 수 있으며, 바람직하게는 기상 후 1시간 내에 일정한 시간 간격으로, 예를 들어 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 1시간 때 채취한 시료가 포함하고 있는 코티졸, DHEA 및 E2 농도를 각 해당 시간별로 측정하고, 그 변화를 관찰 할 수 있다.

또한, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안에 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 경우의 타액을 시료로 한 경우에 대하여 DHEA 및 E2 농도를 추가로 분석할 수 있다.

상기 코티졸, DHEA 및 E2 농도 측정은 다양한 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 특정한 방법으로 제한하지 않는다.

즉, 제한은 없으나, 바람직하게는, 방사선 면역 측정법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 효소를 표지자로 이용한 효소면역측정법(EIA), 루미놀(luminol)이나 그 유도체 또는 ABEI(aminobutyl-ethylisoluminol)로 감도를 증가시킨 화학섬광면역측정법(chemiluminescence immunoassay; CIA), 또는 형광물질표지자(fluorescent label)를 이용한 형광면역측정법(fluorescence immunoassay; FIA) 등이 사용될 수 있다.

방사면역측정법은 높은 감도(sensitivity)와 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 나타내며, 반응 후의 분명하고 명백한 검출을 가능케 해주는 등 여러 이점을 가지고 있는바, 가장 바람직하게는 방사선 면역 측정법을 사용할 수 있고, 이를 위해 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법을 이용할 수 있다.

혈액, 소변 또는 타액을 시료로 채취한 경우 방사선 면역측정법을 사용하기 위한 시료의 전처리 과정을 거칠 수 있다.

타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 혈액의 1/100-1/1000 정도로 매우 낮은 문제점이 있으므로, 타액에 포함되어 있는 소량의 호르몬 농도를 측정하기 위하여 고도로 민감한 분석 시스템이 요구되는데, 이러한 액상-이중항체(liquidphased-double antibody)방법이 유용하게 활용될 수 있다. 보다 상세한 측정과정은 액상-이중항체 방법을 이용한 호르몬 측정에 관한 논문(Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population; age-related differences, diurnal, and correlations with serum levels. Yonsei Med J. 2007;48:379-88)을 참조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 요오드 125 (¹²⁵I)로 표지된 항원과 2차 항체를 이용한 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)을 이용하였다.

(4) 시간 별 코티졸 /DHEA 값( 몰농도 비율) 도출 : 부신내분비계의 활성화에 의한 사춘기 발달의 진행여부 정보 수득

상기 a) 단계에서 각 시간별로 측정된 코티졸 및 DHEA 농도 값을 이용하여, 각 시간의 코티졸 대비 DHEA의 몰 농도 비율 (molar F/D ratio)를 구함으로써, 부신 내분비축의 활성도를 판단할 수 있다. 그리고 이를 통하여 대상 의증 여아에서 사춘기의 발달이 부신내분비계의 활성화에 의해 기인한 결과인지를 대한 정보를 수득할 수 있다.

호르몬의 몰 비율(molar ratio)은 동일한 호르몬 생성기관에서 호르몬 (A)와 호르몬 (B)가 생성, 분비되고 두 호르몬의 생성이 상호 연관을 가지거나 호르몬이 상호 반대적인 역할을 수행할 때, 두 호르몬 간의 비율은 호르몬 생성기관의 생성양상의 균형도(balance)를 의미하고 혹은 두 호르몬이 상호반대 작용을 할 경우, 두 호르몬 간의 비율은 호르몬 작용 간의 균형도를 의미 한다.

상기 코티졸과 DHEA는 모두 부신피질호르몬으로서, 사춘기의 시작에 반드시 DHEA의 생성증가 현상이 나타나며 이를 "adrenarche" 함. 따라서 사춘기 시작과 발달과정에 코티졸과 DHEA 간의 비율 (molar F/D ratio)가 감소되어 나타나면 "adrenarche" 를 통해 사춘기 시작과 발달이 이뤄짐을 알 수 있다.

본 발명에서, 상기 b) 단계에서 상기 a) 단계에서 측정한 코티졸 및 DHEA의 농도를 이용하여 시간 별로 DHEA의 몰 농도에 대한 코티졸의 몰 농도를 구하여 (molar 코티졸/DHEA ratio)비율을 구함으로써, 코티졸과 DHEA 두 호르몬의 각 시간별 몰 농도 비율을 통해 부신내분비축의 활성도를 판단할 수 있다.

이때, 대상 진성성조숙증 의증여아에서 시간별 코티졸/DHEA 몰 농도 비율의 값이 기상 직후 값이 2.8 내지 33, 기상 30분 후 값이 7 내지 56, 기상 60분 후 값이 3.8 내지 36 경우, 진성성조숙증 의증 여아의 사춘기 발달이 부신내분비계의 활성화로 인해 시작되었고, 그 활성화의 정도가 성인의 수준에 이른 것으로 판단할 수 있다.

(5) CARauc / Dauc 값( 몰농도 비율) 도출: 부신내분비계의 활성화에 의한 사춘기 발달의 진행여부 정보 수득

상기 a) 단계에서 각 시간별로 측정된 코티졸 및 DHEA 농도 값을 이용하여 기상 후 최초 1시간 동안 분비된 코티졸 총 분비량에 대한 DHEA 총 분비량의 몰 농도 비율 (molar CARauc/Dauc ratio)을 구함으로써, 부신내분비계의 활성도를 아울러 판단할 수 있다. 그리고 이를 통하여 대상 의증 여아에서 부신내분비계의 활성화에 의해 사춘기가 시작되었는지 대한 정보를 수득할 수 있다.

본 발명에서, 상기 b) 단계에서 상기 a) 단계에서 측정한 코티졸 및 DHEA의 농도를 이용하여 아침기상 직후, 기상 30분 후, 60분 후에 채취한 각각의 타액에서 측정된 코티졸과 DHEA 농도를 각각 적분하여 CARauc 및 Dauc를 각각 구하고 이를 이용하여 molar CARauc/Dauc ratio를 구할 수 있다.

이때, 대상 의증여아에서 CARauc/Dauc (몰 농도 비율)의 값이 3500 이하일 경우, 진성성조숙증 의증 여아의 사춘기 발달이 부신내분비계의 활성화로 인해 시작되었고, 그 활성화의 정도가 성인의 수준에 이른 것으로 판단할 수 있다. 이러한 값은, 또한 아침기상 후 최초 1시간 동안 CARauc/Dauc ratio가 부신피질 기능항진(adrenarche)이 시작 되었는지에 대한 지표로 활용될 수 있다.

(6) E2Inc% 값 도출 : 생식내분비계 활성화로 인해 사춘기발달 진행되었는지 여부 및 GnRH자극 반응 검사에서 양성반응을 수득 할 수 있는지에 대한 정보 수득

상기 a) 단계에서 측정된 E2 농도 값을 이용하여, E2 기저농도 (아침기상 직후의 농도)를 기준으로 기상 후 1시간 동안 증가한 E2 농도에 대한 백분율 (%)을 분석함으로써, 대상 의증 여아의 사춘기 발달이 생식내분비계의 활성화에 기인 된 결과인지 판단할 수 있다.

이때, E2Inc% 값이 100% 일 경우, 진성성조숙증 의증 여아의 2차 성징의 발달(유방발달의 시작 및 진행)이 생식내분비계의 활성화로 인해 시작되었고, 생식내분비계의 활성이 진성성조숙증 확진 반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는 수준, 즉 성인의 수준에 이른 것으로 판단할 수 있다.

(7) E2auci값 도출 : 생식내분비계 활성화로 인해 사춘기발달 진행되었는지 여부 및 GnRH자극 반응 검사에서 양성반응을 수득 할 수 있는지에 대한 정보 수득

상기 a) 단계에서 측정된 E2 농도 값을 이용하여, 기상 직후 대비 기상 후 최초 1시간 동안 증가 된 E2의 총량을 분석함으로써, 대상 의증 여아의 사춘기 발달이 생식내분비계 활성화로 인한 결과인지에 대한 정보를 수득할 수 있다.

이때, E2auc (pmol/L) 값이 350 이상인 경우, 진성성조숙증 의증 여아의 2차 성징의 발달(유방발달의 시작 및 진행)이 생식내분비계의 활성화로 인해 시작되었고, 생식내분비계의 활성이 진성성조숙증 확진 반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는 수준, 즉 성인의 수준에 이른 것으로 판단할 수 있다.

이처럼, 본 발명은 코티졸, 디하이드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol, E2)의 농도와 이들의 변화를 이용하여 특정 값의 범위 기준을 확인함으로써 부신 내분비계의 활성 정도를 파악하고, 생식내분비축의 성숙 여부에 대한 정보를 수득할 수 있다. 또한, 나아가 이러한 정보를 이용하여 GnRH자극 반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는지를 판단할 수 있다.

즉, 본 발명은 코티졸, DHEA 및 E2를 이용하여 기상 후 최초 1시간 동안 분비된 코티졸 총 분비량에 대한 DHEA 총 분비량의 몰 농도 비율 및 기상 후 1시간 동안 기저 농도를 기준으로 기상 후 최초 1시간 동안 순수하게 증가 된 E2의 백분율 및 E2 총량을 대상 의증 여아의 연령과 연관하여 분석함으로써, 여아의 체내 신경내분비적 환경, 부신 및 생식 내분비계에 관한 정보를 GnRH 자극 반응 검사 이전에 알 수 있고, 아울러 이 정보를 이용하여 GnRH자극 반응 검사에서의 양성반응을 수득할 수 있는지를 파악할 수 있어 GnRH자극 반응 검사(확진 검사)에 동반되는 여아, 의료인, 여아의 부모가 감수해야 할 다양한 부담을 줄일 수 있을 것으로 예상된다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.

1. 피험자

환경적인 동질성을 보장하기 위해, 본 발명의 실시는 대한민국 경기도에 위치한 대학병원의 소아청소년과에 진성성조숙증 의증으로 내원한 여아와 여아의 어머니로부터 참여에 대한 동의 및 참여자들의 건강과 사춘기 상태에 대한 정보를 받았다.

다음 기준 중 어느 하나에 해당되는 의증 여아들을 제외하였다: 1)초경을 경험함; 2) 지난달 내에 구강 성장 호르몬 치료 또는, 경구 또는 경피 글루코코르티코이드-함유 약 복용; 3) 지난 2주 내에 비행기를 이용한 장거리 여행으로 시차증 가짐; 4) 만성질환 진단.

또한, 다음 기준 중 어느 하나에 해당되는 성인 여성들도 제외하였다: 1) 직전 월경 주기는 규칙적이나 본 실험의 시작에 앞서 6개월 내에 불규칙적인 월경 주기가 2회 이상 발생; 2) 지난 6개월 내에 호르몬 대체요법 또는 경구 피임약, 타목시펜, 또는 다른 에스트로겐-, 프로게스테론- 또는 글루코코르티코이드-함유 약 복용; 3) 임신 또는 수유, 불임의 증거 또는 성병 존재, 또는 난소부전 진단; 4) 비정산적인 BMI를 나타냄(BMI 18 이하 또는 25 이상); 또는 5) 항우울제 복용 또는 흡연자. 그러나 경구 피임약 또는 스테로이드 함유 약을 마지막으로 사용한 시기가 본 실험 6개월 이상인 피험자들에 대해서는 자격을 인정하였다.

내원하여 자발적으로 참여한 피험자들에게 3개의 타액 채취 튜브가 담긴 지퍼 백(zipper bag), 타액 채취에 대한 설명서를 분배 또는 전달하였다. 의증 여아 및 여아의 어머니 각각 50명으로부터 각자 사전 동의(informed assent and consent)를 얻었으며, 참여하는 모든 의증 여아들은 한국에서 태어나 그들의 생부모(biological parent)와 함께 집에서 자랐다.

본 실험은 한림대학교 의과대학 동탄성심병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받았고 윤리 권고를 따라 실시되었다.

2. 타액 채취

아침 기상 30분 후의 F/D비율은 목요일에서 일요일까지 안정화 시기와 함께 매일 변화를 나타내므로, 참가자들에게 목요일 ~ 일요일에 기상 후 즉시 그리고 일어난 후 30분 및 60분에 각 시점에서 제공되는 타액의 최소 1.5mL 부피로 그들의 타액 샘플을 채취하도록 요구하였다.

또한, 참가자들에게 수면-기상 주기에 변화를 주지 않을 것을 요구하였다.

참가자들에게 정해진 시간에 타액 샘플을 채취하고(일어난 후 5분 미만, 일어난 후 25~35분 및 55~65분) 채취 튜브(Simport Inc., QC, Canada)의 표지 영역(marking area)에 각각의 채취 시간을 메모하도록 지시하였다. 외부자극 없이 근육 움직임과 채취 튜브에 타액을 뱉는 것만으로 타액을 채취하였다.

성인 여성에게는 전날 밤에 음주를 하지 않도록 요구하였다. 샘플 채취 시기동안에, 참가자들은 음식 섬취, 음용, 또는 양치질 및 각 샘플 채취 전에 물로 입을 헹구는 것을 삼가도록 요구하였다. 타액 안에 스테로이드 농도는 -20℃ 또는 -80℃에서 보관 후 최소 1년 동안은 안정적이고, 분석 전에 4회까지 샘플의 냉동 및 해동은 측정된 농도에 영향을 미치지 않으므로, GnRH 자극반응 검사를 실시하는 날까지(최대 1주일) 참가자들에게 그들의 타액 샘플을 그들 소유의 가정용 냉동실에 보관하도록 요구하였다. 타액 샘플은 GnRH 자극반응 검사가 예정되어 있는 날에 소아청소년과 접수대에 제출되었다. 이때, 육안 검사에 의한 결정으로, 피로 오염된 샘플들은 본 실험에서 제외되었다. 튜브의 표지 영역에 시간 또는 날짜가 없는 샘플들 또한 제외되었다.

전형적인 CAR은 정해진 채취시간을 지키는 순응 피험자 내에서 개인의 기준치를 넘어 코티졸 레벨 내 적어도 2.5 nmol/L 증가로서 정의된다. 건강한 피험자에 있어서, 아침기상 후 10분 이상 지연 후에 첫 타액시료가 채취되면 전형적인 CAR를 관찰할 수 없다.

이러한 경우, 타액 채취 시간을 지키지 않은 불순응 피험자들이라고 생각하였고 불순응 피험자들의 타액 시료는 차후의 분석에서 제외하였다.

제외 절차 후에, 38명의 2차 성장 발달이 뚜렷한 만 9세 이하의 진성성조숙증 의증 여아와 42명의 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성들로부터 채취한 타액 샘플들로 얻어진 데이터를 본 실험에 포함시켰다.

3. 타액 정제

채취된 샘플은 찌꺼기를 제거한 후에 -70℃에서 보관하였다. 뮤신을 타액에서 제거하기 위해, 샘들들을 해동하고 원심분리(10,000g, 15min, 4) 하였다. 상층액을 채취하고 시험을 수행할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 모든 타액 샘플들은 전남대학교의 호르몬 연구센터에서 분석되었다.

4. 타액 내 호르몬 농도 측정

타액 내 코티졸, DHEA 및 E2 농도는 방사면역측정법을 이용하여 결정되었다.

코티졸, DHEA 및 E2에 대한 표준시료는 Sigma-Aldrich 화학 회사(MO, USA)로부터 얻었다. 이들 표준시료로부터 코티졸, DHEA 및 E2의 표준용액(10 mmol/L)을 준비하였고, 상기 표준용액을 50 mmol/L 인산-완충액 세라인(saline)을 함유한 0.1% 겔라틴으로 희석함으로써 상용 표준시료를 제조하였다(pH=7.2).

요오드 125 (¹²⁵I)는 PerkinElmer사 (마사스체스, 미국)에서 구입하여 사용하였다. 이전에 논문에서 제시한 방사성 스테로이드용 프로토콜을 변형함으로써 Iodine-125-labeled 코티졸 (cortisol -3-(O-carboxymethyl) oximino-(2-[125 I]iodohistamine), DHEA(DHEA-7-(O-carboxymethyl) oximino-(2-[125 I]iodohistamine) 및 에스트라디올 (estradiol-3--(O-carboxymethyl) oximino-(2-[125 I]iodohistamine)를 준비하였다. 코티졸 항혈청을 Accurate Chemical & Scientific Co.(NY, USA)로부터 구입하였고, DHEA 항혈청은 United States Biological (Salem, Mass., USA)에서 구입하였으며, E2 항혈청을 Meridian Life Science, Inc.(ME,USA)에서 구입하였다.

코티졸 항혈청은 코티손(cortisone), 11-데옥시코티졸(11-deoxycortisol),프레드니솔론(prednisolone), 코티졸-21-글루코시듀로네이트(cortisol-21-glucosiduronate), 티졸-21-설페이트(cortisol-21-sulphate), 및 다른 스테로이드와 각각 1.0%, 8.9%, 31.6%, 1.3%, 0.01% 미만, 및 0.01% 미만의교차 반응 레벨로 교차 반응한다. DHEA 항혈청은 안드로스테네디온(androstenedione), 에피안드로스테론(epiandrosterone), 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone), 및 다른 스테로이드와 각각 0.4%, 0.2%, 1.3%, 및 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다. E2 항혈청은 에스트리올(estriol), 에스트론(estrone)디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone), 및 다른 스테로이드와 각각 0.09%, 0.5%, 및 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다. 3.6 및 10.9 nmol/L의 평균 코티졸 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay 변동계수(CV)는 각각 7.4% 및 8.5% 였다(n=26). 코티졸에 대한 검출 예민도는 0.4 nmol/L 였다. 159.0 및 795.0 pmol/L의 평균 DHEA 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay CV는 각각 12.5% 및 10.1% 였다(n=26). DHEA에 대한 검출 예민도는 0.7 pmol/L였다. 18.4 및 183.6 pmol/L의 평균 E2 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay CV는 각각 11.5% 및 13.2% 였다(n=26). E2에 대한 검출예민도는 3.7 pmol/L였다.

5. 데이터 분석

기상 후(post-awakening) 최초 1시간 동안에 스테로이드 분비 양상을 분석하기 위해 보조 지표(auxiliary indices)을 적용하였다. 방사면역측정법을 이용하여 각 시료에 포함되어 있는 코티졸, DHEA 및 E2 농도를 결정한 후, 기상 후 1시간 동안에 코티졸, DHEA 및 E2의 총 분비량은 기상 직후부터 기상 후 60분까지 윈도우용 GraphPad Prism 버전 5.00(GraphPad Software,CA, USA)을 사용하여 기저(基底, ground)에 대한 곡선 아래의 면적(area under the curve, AUC)으로 계산되었다(각각 CARauc, Dauc 및 E2auc). 계산된 CARauc 및 Dauc를 이용하여 기상 후 1시간 동안에 코티졸 총 분비량에 대한 DHEA 총 분비량의 비율 (molar CARauc/Dauc ratio)을 구하였다.

각 시료에 포함되어 있는 E2 농도를 결정 한 후, 기상 직후의 E2 농도 (기저농도, basal concentration)를 기준으로 기상 후 순수하게 증가 된 최고치 E2 농도의 백분율 [(30분(혹은 60분) 후의 E2 농도-기상 직후 E2 농도)/기상 직후 E2 농도]*100을 계산하였다(percent of the net increased E2 concentration after awakening period, E2Inc%).

6. 통계분석

Shapiro-Wilk 정규성 검증은 변수들, 즉, 각 검사 시점에 스테로이드 노도 및 보조 지표(auxiliary indices)가 정상적으로 분포되지 않음을 드러냈다. 따라서 모수치 통계 검증을 위한 샘플 분포를 정규화하기 위해 상기 값들을 로그-전환하였다. 그러나 각 수치에 대한 이해도를 높이기 위하여 그림과 표에는 자연수를 사용하여 표시하였고, 로그 전환값들은 통계분석에만 이용하였다. 평균 스테로이드 레벨 및 보조지표에서 집단차이는 5% 유의수준에서 일방향 또는 양방향 ANOVA 검증 또는 양방향 t 검증을 이용하여 분석하였다. 일방향 ANOVA 검증이 현저한 차이를 나타낼 때(p < 0.05), 특정 집단차이를 발견하기 위해 Tukey's post-hoc test를 수행하였다. SAS 버전 9.1(SAS Institute Inc., NC, USA)을 이용하여 통계적 계산을 수행하였다. 0.05 미만의 p값을 유의미한 것으로 간주하였다.

실시예 1: molar F/D ratio(molar 코티졸 / DHEA ratio ) 차이 확인

정상적인 성인 남녀에서 아침기상 후 코티졸의 농도는 50~150% 증가하는 것으로 보고되어 있고(Pressner 등 1997), 이는 기상 직후부터 기상 30분 후까지 최소 2.5 nmol/L이 증가하는 것으로 알려져 있다(Wust 등 2000). 특히, 정상적인 남녀에서 기상 직후 첫 타액시료의 채취가 10분 이상 지연되었을 경우 기상 후 코티졸 증가 현상을 관찰할 수 없다(Okun 등 2002). 이러한 시료에서 추가적으로 다른 스테로이드 즉, DHEA나 E2의 정량분석은 의미가 없는 바, 아침 기상 후 호르몬 반응 검사에서 제외되어야 한다.

GnRH 자극반응 검사를 실시하기 전에 참여자들로부터 제출받은 타액시료는 GnRH 자극반응 검사를 수득할 때까지 -70℃ 냉동고에 보관하였으며, GnRH 자극반응 검사결과에 따라 보관한 타액시료를 성인 여성(n=42), GnRH 자극반응 검사 후 양성반응(n=16) 혹은 음성반응(n=22) 수득 여아로 구분하여 타액에 포함되어 있는 호르몬을 분석하였고, 상기한 바와 같이, 기상 직후부터 기상 30분 후까지 전형적인 코티졸의 농도의 증가가 없는(최소 2.5 nmol/L) 시료를 제외하였다.

각각의 집단, 성인 여성(n=42), GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아(n=16) 및 GnRH 자극반응 검사에서 음성반응 여아(n=22)의 타액 시료에서 아침기상 후 최초 1시간 동안 molar F/D ratio를 도 1에 도시하였다.

Two-way ANOVA를 이용하여 분석한 결과, molar F/D ratio는 3개의 집단 간에 그룹간 효과 (group effect) (F_2,231 = 29.9, p < 0.0001) 및 타액채취시간의 효과 (collection time effect)(F_{2, 231} =18.3 p < 0.0001)는 유의성을 보였으며, 그룹 × 타액 채취시간 상호작용 효과 (group × time interaction effect) (F_{4, 231} =2.6, p = 0.04) 또한 유의하였다 (도 1).

이 결과는 3개의 그룹 간에 유의미하게 molar F/D ratio의 수준 (유의한 그룹효과) 및 양상 (그룹 × 타액채취시간 상호 작용 효과)에 차이를 보인다는 것을 의미한다.

GnRH 자극반응 검사에서 음성반응 여아집단 (negative responded girls) molar F/D ratio 수준은 GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아집단 (positive responded girls) 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성(adult females) 집단보다 유의성 있게 높았다(모든 통계분석에서 p < 0.0001) (도 1).

또한, GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아집단의 molar F/D ratio 수준은 성인 여성보다 유의성 있게 낮았다(group effect; F_1,168 = 6.4, p < 0.05) (도 1).

One-way ANOVA를 이용한 분석 결과, 각 시간별 molar F/D ratio을 적분한 molar F/D-auc는 3개의 집단간에 그룹간 유의한 효과 (group effect) (F_2,73 = 12.7, p < 0.0001) 있었으며 (도 2), 추가적인 post-hoc 분석결과, GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아집단의 molar F/D-auc는 성인여성과 유사한 수준이었으며 (p > 0.05), 음성반응 여아집단의 molar F/D-auc는 양성반응 여아집단 및 성인여성의 molar F/D-auc보다 유의하게 높았다 (모든 통계 분석에서 p < 0.001) (도 2).

각 집단의 molar F/D-auc에 대한 reference range를 표 1에 정리하였다.

성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아의 F/D ratio-auc reference range

	5% Lower Reference Limit	95% Upper Reference Limit
Adult female	390.9	3483.5
Positive responded girls	404.9	2725.0
Negative responded girls	755.0	4416.2

사춘기 개시와 발달과정에 부신내분비계의 DHEA 생성의 증가(이를 "adrenarche"라 함)가 동반되기 때문에 F/D ratio는 음성반응을 수득한 여아보다 성인 여성과 양성반응 여아에서 낮게 나타나며, molar F/D-auc의 값이 성인 여성의 상위 95 percentile 이하일 경우, 진성성조숙증 의증 여아의 사춘기 발달에 부신내분비계의 활성화가 이뤄졌음을 판단할 수 있다.

실시예 2: molar F/D ratio(molar 코티졸 /DHEA ratio) 차이 확인

각각의 집단, 성인 여성(n=42), GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아(n=16) 및 GnRH 자극반응 검사에서 음성반응 여아(n=22)의 타액 시료에서 아침기상 후 최초 1시간 동안 E2의 변화를 도 3에 도시하였다.

Two-way ANOVA를 이용하여 분석한 결과, E2는 3개의 집단 간에 그룹간 효과 (group effect) (F_2,231 = 26.4, p < 0.0001) 및 타액채취시간의 효과 (collection time effect)(F_{2, 231} =7.0 p < 0.005)는 유의성을 보였으나, 그룹 × 타액 채취시간 상호작용 효과는 통계적으로 유의하지 않았다 (group × time interaction effect) (F_{4, 231} =1.5, p = 0.2)(도 3).

이 결과는 3개의 그룹 간에 유의미하게 E2의 수준 (유의한 그룹효과)에는 차이가 있으나 E2의 분비 양상 (그룹 × 타액채취시간 상호 작용 효과)에 차이를 보이지 않는다는 것을 의미한다.

GnRH 자극반응 검사에서 음성반응 여아집단 (negative responded girls) E2 수준은 GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아집단 (positive responded girls) 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성(adult females) 집단보다 유의성 있게 낮았다(모든 통계분석에서 p < 0.0001) (도 3).

또한, GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아집단의 E2 수준은 성인여성보다 유의성 있게 높았다(group effect; F_1,168 = 4.3, p = 0.04) (도 3).

One-way ANOVA를 이용한 분석 결과, E2Inc% 는 3개의 집단 간에 그룹간 유의한 효과 (group effect) (F_2,73 = 3.6, p = 0.03) 있었으며 (도 4), 추가적인 post-hoc 분석결과, GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아집단의 E2Inc%는 성인여성과 유사한 수준이었으며 (p > 0.05), 음성반응 여아집단의 E2Inc%는 양성반응 여아집단 및 성인여성의 E2Inc% 보다 유의하게 낮았다 (모든 통계 분석에서 p < 0.01) (도 5).

One-way ANOVA를 이용한 분석 결과, E2auci 는 3개의 집단 간에 그룹간 유의한 효과 (group effect) (F_2,73 = 6.2, p = 0.005) 있었으며 (도 5), 추가적인 post-hoc 분석결과, GnRH 자극반응 검사에서 양성반응 여아집단의 E2auci는 성인여성과 유사한 수준이었으며 (p > 0.05), 음성반응 여아집단의 E2auci는 양성반응 여아집단 및 성인여성의 E2auci 보다 유의하게 낮았다 (모든 통계 분석에서 p < 0.01) (도 6).

각 집단의 E2Inc% 및 E2auci 에 대한 reference range를 표 2와 표 3에 정리하였다.

성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아의 E2Inc% reference range

	5% Lower Reference Limit	95% Upper Reference Limit
Adult female	14.1	285.7
Positive responded girls	5.5	602.6
Negative responded girls	-7.5	101.8

성인 여성, 양성반응 여아 및 음성반응 여아의 E2auci reference range

	5% Lower Reference Limit	95% Upper Reference Limit
Adult female	82.0	3344.8
Positive responded girls	66.8	4916.0
Negative responded girls	0	333.2

사춘기 발달과정에 E2 생성의 증가 (이를 "gonadarche"라 함)는 생식내분비계를 구성하는 시상하부, 뇌하수체, 난소 모두가 상호신호를 수용할 수 있고 각 기관이 호르몬 생성능력을 획득 (competence)한 결과이다. GnRH 양성반응을 수득한 여아의 아침기상 후 최초 1시간 동안의 E2의 분비수준 및 분비양상은 성인여성의 그것과 동일하기 때문에 이들의 생식내분비계의 구성요소의 호르몬 생성능력은 성인의 그것과 동일한 것으로 판단할 수 있다.

따라서 E2inc% 및 E2auci의 값이 음성반응 여아의 상위 95 percentile 이상일 경우, 진성성조숙증 의증 여아의 사춘기 발달에 생식내분비계의 활성화에 기인 된 현상으로 GnRH 자극반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있을 것으로 판단할 수 있다.

Claims

만 9세 이하의 여아에서 채취한 타액으로부터 측정한 코티졸(cortisol), 디히드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 이용하여 부신내분비계 및 생식내분비계 중 1이상의 내분비계 활성화 판단지표를 제공하는 것을 포함하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 부신내분비계 활성화 판단지표는 코티졸/DHEA 몰 (mole) 농도 비율(molar F/D ratio) 및 상기 코티졸/DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D ratio-auc (molar F/D-auc))이고;
상기 생식내분비계 활성화 판단지표는 E2의 총 분비량(E2auci) 및 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)인 것을 특징으로 하는, 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 부신내분비계 활성화 판단지표로서
상기 코티졸/DHEA 몰 (mole) 농도 비율(molar F/D ratio)의 기상 25 ~ 35분 후 값이 69 이하인 경우; 및 상기 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D-auc)의 값이 3500 이하인 경우 중 1이상의 경우에
부신내분비계 활성화로 인해 사춘기 발달이 시작되었고, 그 활성화의 정도가 성인의 수준에 이른 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생식내분비계 활성화 판단지표로서
상기 E2의 총 분비량(E2auci)의 값이 350 이상인 경우; 및 상기 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)의 값이 100 이상인 경우중 1이상의 경우에
생식내분비계의 활성화로 인해 외현한 가슴발달이 시작되었고, 그 활성화 정도가 성조숙증 확진반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는 수준에 이른 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 타액은 만 9세 이하의 여아의 기상 후 1시간 이내에 채취한 타액인 것을 특징으로 하는, 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 타액은 기상 후 5분 미만, 기상 후 25 ~ 35분 및 기상 후 55 ~ 65분에 채취한 것임을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량(molar F/D-auc)은 기상 후 최초 1시간 동안의 코티졸과 DHEA의 몰농도 비율의 적분량인 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 E2의 총 분비량(E2auci)은 기저 E2 농도로부터 기상 후 최초 1시간 동안 증가된 E2의 총량인 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 E2의 순수증가 총량(E2Inc%)은 기저 E2 농도를 기준으로 기상 후 최초 1시간 안에 증가한 최고치 E2 농도에 대한 백분율인 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 기저 E2 농도는 기상 직후 또는 기상 직후 5분 미만에 측정된 E2의 농도인 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내 코티졸의 농도 증가량이 2.5 nmol/L 미만인 타액을 배제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 성조숙증은 중추성조숙증, 진성성조숙증, 말초성성조숙증 또는 가성성조숙증인 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 성조숙증은 진성성조숙증인 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 내분비계 활성화 판단지표가 GnRH 자극 반응 검사에서 양성반응을 수득할 수 있는지를 판단하기 위한 정보로 이용되는 것을 특징으로 하는 성조숙증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항의 따라 수득한 성조숙증 진단을 위한 정보를 이용하여, 진성 성조숙증 확진 검사 (GnRH 자극반응 검사)에서 수득할 수 있는 결과를 예측하는 방법.