KR102544234B1

KR102544234B1 - 여아의 사춘기 시작과 발달을 판단하는 방법

Info

Publication number: KR102544234B1
Application number: KR1020160072684A
Authority: KR
Inventors: 안련섭
Original assignee: 안련섭; (주) 마인즈에이아이
Priority date: 2016-06-10
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2023-06-16
Also published as: KR20170139981A

Abstract

본 발명은 여아의 사춘기 시작과 발달을 판단하는 방법으로, 특히, 진성 성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 만 9세 미만 여아의 시료로부터 디하이드로에피엔드로스테론(DHEA;dehydroepiandrosterone), 코티졸(cortisol), 에스트라디올(estradiol-17β, E2) 및 프로제스테론 (progesterone, P4)의 농도를 측정하여 이들 사이의 특정 관계 값을 확인함으로써 사춘기 발달의 진행 또는 생식 내분비선의 성숙 여부를 판단하는 방법 및 기준에 관한 것이다.

Description

여아의 사춘기 시작과 발달을 판단하는 방법 {Determination methods for the pubertal onset and pubertal stage in girls}

본 발명은 진성성조숙증 진단에 관한 것으로, 특히, 진성 성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 만 9세 미만 여아의 시료로부터 부신피질호르몬 중 디하이드로에피엔드로스테론(DHEA;dehydroepiandrosterone), 코티졸(cortisol) 및 성선 호르몬 중 에스트라디올(estradiol-17β, E2), 프로제스테론 (progesterone, P4)의 농도를 측정하여 이들 사이의 몰 농도 비율, 총 분비량, 순수증가 총량 등 특정 관계 값을 확인함으로써 사춘기 발달의 진행 또는 생식 내분비선이 성숙 여부를 진단하는 방법 및 기준에 관한 것이다.

사춘기는 생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 다양한 영역에 걸쳐서 발생하는 변화를 통합적으로 이해해야 하는 시기로 성장 발달상 가장 극적인 변화를 나타내는 시기이기도 하다. 빠르게 성숙하는 아동은 생물학적 성숙에 정서적으로 준비도 하기 전에 또래보다 이른 나이에 생활방식과 신체 변화에 대처해야 한다. 그러므로 신체 변화를 수용하고 이해할 시간이 제한되어 빠른 발달에 대한 두려움과 혼돈스러운 감정을 느낄 수 있으며(Mendle 등, 2007), 예상치 않았던 빠른 사춘기를 경험하는 아동과 그 부모는 불안을 경험하게 된다(Pinyerd 와 Zipf,2008). 사춘기가 빠른 여아가 또래보다 가족과의 관계에서 어려움이 더 많고 외현화된 행동문제를 나타낸다는 연구결과는 성조숙증이 아동 자신뿐 아니라 그들을 둘러싼 가족환경과도 관련이 있음을 시사하고 있다(Tremblay와 Frigon, 2005).

최근 생활수준이 향상됨에 따라 사춘기가 빨리 시작되는 경향을 보이고 있으며, 성조숙증이 있는 소아의 수도 증가하는 추세에 있다. 건강보험심사평가원(Health Insurance Review & Assessment Service [HIRA], 2011)에 따르면 성조숙증 진료인원은 2006년 6천 4백명에서 2010년 2만 8천명으로 5년간 약 4.4배 증가하였고 이에 따라 진료비도 2006년 23억원에서 2010년 179억원으로 5년간 7.8배 증가하였다.

실제로 유방발육이 시작되면서 사춘기가 시작되는 연령이 여아는 11.3세, 남아는 12.1세로 최근 급속히 사춘기 시작 연령이 낮아지고 있으며, 1990년 이후에 출생한 초, 중, 고등학생인 여아의 평균 초경 연령이 12.0±1.0세로 1980년대 출생한 여아의 평균 초경 연령 12.3±0.7세에 비해 초경이 조기화 되는 경향을 보였다(Park 등, 2006).

빠른 사춘기 발달은 골격 성장을 가속화하여 성인이 되었을 때 최종신장이 작고 성인질병과 생식기계 암의 위험이 높으며 성인기에 당뇨, 비만, 심혈관계 질환 같은 대사증후군의 위험이 높은 것으로 보고되고 있고(Golub 등, 2008), 초경이 늦은 여아보다 빠른 여아가 우울수준과 자살시도가 높았고 우울과 불안이 공존하였으며(Patton 등, 1996; Graber 등, 1997) 이른 사춘기 성숙을 경험한 아동은 성인이 되어서도 불안을 나타내었다(Graber 등, 2004). 그러므로 아동의 성장 발달 문제뿐 아니라 급격한 질병발생의 증가율과 국가 경제적 차원을 고려할 때 성조숙증을 앓고 있는 아동과 그 가족에 대해 관심을 가져야 할 것으로 사료된다.

따라서, 이른 사춘기로 인해 초래될 수 있는 부정적인 결과들을 예방하기 위해서는 이러한 성조숙증을 정확하게 진단할 수 있는 기준이 마련되어야 할 필요성이 있다.

이에 본 발명자는, 만 9세 미만 여아를 대상으로 시료를 채취하여 부신피질호르몬 중 디하이드로에피엔드로스테론(DHEA;dehydroepiandrosterone)및 코티졸(cortisol), 성선호르몬 중 에스트라디올(estradiol-17β, E2) 및 프로제스테론 (progesterone, P4)의 농도를 측정하여 이들 사이의 몰농도 비율, 총 분비량의 몰농도 비율, 순수증가 총량 및 총 분비량으로 수치화하여 특정 값의 범위에 속하는 여부에 따라 사춘기 발달의 초기 단계 또는 생식내분비선의 성숙 여부를 판단하는 방법을 고안하여 본 발명을 완성하였다.

박미정, 이인숙, 신은경, 정효지, 조성일. 한국청소년의 성성숙 시기 및장기간의 초경 연령 추세 분석. Korean Journal of Pediatrics 2006; 49:610-616. Ahn RS, Choi JH, Choi BC, Kim JH, Lee SH, Sung SS. Cortisol, estradiol-17β, and progesterone secretion within the first hour after awakening in women with regular menstrual cycles. J Endocrinol. 2011; 211:285-295. Styne DM: HormRes1994;41:3-6. Wildt L, Marshall G, Knobil E: Experimental induction of puberty in the infantile female rhesus monkey. Science 1980; 207:1373-1375. Vining RF, McGinley RA, Symons RG. Hormones in saliva: mode of entry and consequent implications for clinical interpretation. Clin Chem. 1983; 29: 1752-1756. Kirschbaum, C. amp; Hellhammer, D.H., 'SalivaryCortisol in Psychoendocrine Research: Recent Devel opments and Applications. Psychoendocrinology 1994; 19: 313-333. Ahn RS, Lee YJ, Choi JY, Kwon HB, Chun SI. Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population: age-related differences, diurnal rhythm, and correlations with serum levels. Yonsei Med. 2007;48: 379-388. 8. Kunz-Ebrecht SR, Kirschbaum C, Marmot M, Steptoe A. 2004. Differences in cortisol awakening response on work days and weekends in women and men from the Whitehall II cohort. Psychoneuroendocrinology 29: 516-528. Stalder T, Baumler D, Miller R, Alexander N, Kliegel M, Kirschbaum C.The cortisol awakening response in infants: ontogeny and associations with development-related variables. Psychoneuroendocrinology. 2013; 38: 552-559. Chida Y1, Steptoe A. Cortisol awakening response and psychosocial factors: a systematic review and meta-analysis. Biol Psychol. 2009; 80: 265-278. Kudielka BM, Broderick JE, Kirschbaum C. 2003. Compliance with saliva sampling protocols: electronic monitoring reveals invalid cortisol daytime profiles in noncompliant subjects. Psychosom Med 65: 313-319. Hucklebridge F, Hussain T, Evans P, Clow A.The diurnal patterns of the adrenal steroids cortisol and dehydroepiandrosterone (DHEA) in relation to awakening. Psychoneuroendocrinology. 2005; 30: 51-57. Shealy CN. A review of dehydroepiandrosterone(DHEA). Integr Physiol Behav Sci. 1995 ; 30: 308-313. Marshall WA, Tanner JM. Variations in pattern of pubertal changes in girls. Arch Dis Child. 1969; 44: 291-303. Pruessner JC, Wolf OT, Hellhammer DH, Buske-Kirschbaum A, von Auer K, Jobst S, Kaspers F, Kirschbaum C. 1997. Free cortisol levels after awakening: a reliable biological marker for the assessment of adrenocortical activity. Life Sci 61: 2539-2549. Wust S, Wolf J, Hellhammer DH, Federenko I, Schommer N, Kirschbaum C. 2000. The cortisol awakening response-normal values and confounds. Noise Health 7: 79-88. Kudielka BM, Broderick JE, Kirschbaum C. 2003. Compliance with saliva sampling protocols: electronic monitoring reveals invalid cortisol daytime profiles in noncompliant subjects. Psychosom Med 65: 313-9. Styne DM. 1994. Puberty physiology. Horm Res 41:3-6. Taylor SJ, Whincup PH, Hindmarsh PC, Lampe F, Odoki K, Cook DG: Performance of a new pubertal self-assessment questionnaire: a preliminary study. Paediatr Perinat Epidemiol 2001; 15: 88--94. Buijs RM, van Eden CG, Goncharuk VD, Kalsbeek A: The biological clock tunes the organs of the body: timing by hormones and the autonomic nervous system. J Endocrinol 2003; 177: 17-26.

건강보험심사평가원 및 대한소아내분비학회에서 제시한 성조숙증 판단의 기준 연령인 만 9세에 의거하여,

본 발명의 목적은 만 9세 미만 여아를 대상으로 시료 내 디하이드로에피엔드로스테론(DHEA;dehydroepiandrosterone), 코티졸(cortisol), 에스트라디올(estradiol-17β, E2) 및 프로제스테론 (progesterone, P4)을 채취하여 몰 농도 비율, 총 분비량의 몰 농도 비율, 순수증가 총량 및 총 분비량으로 수치화하는 것을 특징으로 하는 진성성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 특징이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용한 사춘기 발달의 진행 여부 또는 생식내분비선의 성숙도 판단을 위한 정보를 제공하는 데에 있다.

상기과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

다음의 단계를 포함하는 진성성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

1) 만 9세 미만의 여아로부터 채취한 시료로부터 코티졸, DHEA, E2 및 P4 농도를 시간별로 측정하는 단계;

2) 상기 측정된 농도로부터 다음 중 어느 2 이상의 값을 구하는 단계; 및

a) 시간별 코티졸/DHEA (몰 농도 비율),

b) CARauc/Dauc (몰 농도 비율), 이때, CARauc 및 Dauc는 각각 기상 후 한 시간 동안의 코티졸 총 분비량 및 DHEA 총 분비량을 의미함,

c) E2auci 값: 이때, E2auci는 기상 후 한 시간 동안의 E2 증가량의 총량

d) P4auc 값; 이때, P4auc는 기상 후 한 시간 동안의 프로제스테론 총 분비량을 의미함,

3) 상기 2)단계의 값이 다음에 포함되는 경우, 해당정보를 제공하는 단계.

ⅰ) a)의 값이 1 내지 80인 경우 사춘기발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

ⅱ) b)의 값이 1 내지 55인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

ⅲ) c)의 값이 120 내지 1500인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙 되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

ⅳ) d)의 값이 8 내지 30인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙 되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

일 구체예로서, 본 발명은

상기 2)단계에서, a)값을 기상 직후, 기상 30분 후, 및 기상 60분 후의 값으로 수득하고;

상기 3)단계에서, 대응되는 a)값이 기상 직후 값이 1 내지 40, 기상 30분 후 값이 1 내지 80, 기상 60분 후 값이 1 내지 59인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.

이 때, 상기 시료는 타액, 혈액 또는 소변일 수 있고, 구체적인 예로서, 타액일 수 있다.

또한, 상기 시료는 기상 후 일정 시간 이내에서 일정 간격을 두고 채취한 것을 이용할 수 있고, 예를 들어, 기상 후 1시간 이내에 채취하여 이용할 수 있다. 일 실시예에서는 상기 시료 채취는 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간 때 이루어졌다

상기 시료 내 코티졸, DHEA, E2 및 P4의 농도는 방사선 면역측정법으로 측정될 수 있다.

또한, 상기 CARauc 및 Dauc는 각 시간별 측정된 농도 값을 적분함으로써 수득할 수 있고, 상기 CARauc/Dauc 몰 농도 비율은 수득한 CARauc 몰 농도를 수득한 Dauc 몰 농도로 나누어 수득할 수 있으며, E2auci값은 기상 직후 E2농도를 기준으로 한 시간동안 증가 된 농도 값을 적분함으로써 수득할 수 있다.

P4auc값은 각 시간별 측정된 농도 값을 적분함으로써 수득할 수 있다.

한편, 성조숙증 진단의 정확성을 높이기 위해, 기상 직후부터 최초 한 시간동안 시료 내 코티졸의 농도 증가량이 2.5 nmol/L 미만인 경우에 해당하는 시료를 배제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

즉, 아침 기상 후 최초 1시간 동안의 코티졸의 농도 변화량 확인을 통해 진단 대상에 적합한 시료를 결정할 수 있다.

본 발명에서 유용하게 수득할 수 있는 정보는 건강보험심사평가원 및 대한소아내분비학회에서 제시한 연령기준 (만 9세)에 의하여 만 9세 미만의 여아가 정상적인 나이에 사춘기가 시작되었는지 여부, 여아의 생식내분비축의 성숙 여부 또는 가슴발달 정도의 예측을 포함한다.

또한, 본 발명은 만 9세 미만의 대상 여아의 체내 부신, 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보를 제공할 수 있고, 이러한 정보를 이용하는 모든 용도를 포함한다. 예를 들어, 성조숙증 진단 및 치료에 이용될 수 있다.

본 발명은 시료에 포함되어 있는 코티졸, 디하이드로에피엔드로스테론 (dehydroepiandrosterone, DHEA)의 농도 및 이들의 변화를 이용하여 특정 값의 범위 기준을 확인함으로써 부신 내분비축의 활성 정도를 파악하고, 에스트라디올(estradiol, E2)의 증가된 총량의 분석 및 프로제스테론 (progesterone, P4)의 총분비량의 분석하고 이를 수치화하여 생식내분비축의 성숙 여부를 파악할 수 있다.

따라서, 시진(視診), 촉진 (觸診)등의 신체검사를 통해서 알 수 없었던 만 9세미만의 대상 여아의 체내 부신, 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보를 제공할 수 있고 성조숙증 확진 검사 (GnRH 자극반응 검사)를 위한 사전검사로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1 은 본 발명 실시에 참가한 초경 전 여아들의 나이에 따른 각 가슴발달을 기준으로 한 사춘기 단계의 도수분포(Frequency distribution) 이다.
도 2 은 만 9세 미만 사춘기 시작 전 여아집단, 만 9세 이상 초경 전 가슴발달 2 및 3단계 (여아 집단 및 정상적 생리 주기를 가지고있는 성인여성에서 기상 직후, 기상 30분 및 60분 후의 molar 코티졸/DHEA ratio를 분석한 결과이다.
도 3은 만 9세 미만 사춘기 시작 전 여아집단, 만 9세 이상, 초경 전, 가슴발달 2 및 3단계 여아 집단 및 정상적 생리 주기를 가지고 있는 성인여성에서 기상 직후, 기상 30분 및 60분 후의 molar CARauc/Dauc ratio를 비교한 결과이다.
도 4는 만 9세 미만 사춘기 전 여아집단, 만 9세 이상(초경 전, 가슴발달 2 및 3단계)여아 집단 및 정상적 생리 주기를 가지고 있는 성인여성에서 기상 직후, 기상 30분 및 60분 후의 E2 농도를 분석한 결과와 이들 세 집단의 E2auci를 비교한 결과이다.
도 5는 만 9세 미만 사춘기 전 여아집단, 만 9세 이상(초경 전, 가슴발달 2단계 및 3단계)여아 집단 및 정상적 생리주기를 가지고 있는 성인여성에서 기상 직후, 기상 30분 및 60분 후의 P4 농도를 분석한 결과와 이들 세 집단의 P4auc를 비교한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"성조숙증(Precocious puberty)"은 2차 성징이 여아에서 8세 미만, 남아에서 9세 미만에 나타나면 성조숙증이라 한다. 2차 성징은 여아에서는 유방이 발달하며, 남아에서는 고환의 용적이 4 mL 이상 또는 장경이 2.5 cm 이상으로 커지며, 음모 발달을 포함한다.

진성성조숙증(Central Precocious Puberty, CPP)은 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어진 생식내분비축의 활성화로 인하여 나타나는 성조숙증을 의미한다. 이에 반해 시상하부-뇌하수체-생식소축의 활성화가 동반되지 않는 경우를 가성 성조숙증이라 하고 2차 성징은 나타나지만 부분적으로 나타나며, 일반적으로 진행하지 않거나 증상이 소실되는 경우로 조기 유방 발육증, 조기 음모 발생증, 조기 초경 발생증이 나타난 경우에는 불완전형 성조숙증이라한다.

"진단"은 특정 병리 또는 생리 상태의 존재 또는 활성 등을 확인하는 것을 의미한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명에서는 인간을 대상으로 하였다.

"시료" 또는 "샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 액형 조직일 수 있다. 본 발명에서는 타액(saliva), 혈액(blood) 또는 소변 (urine)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 타액을 이용한다.

"스테로이드호르몬(steroid hormone)"이란 4원자고리 탄화수소인 스테로이드 고리(사이클로펜타노하이드로페난트렌 고리)를 기본 구조로 가진 호르몬으로, 고등동물이나 사람에게서 볼 수 있는 웅성, 자성의 생식선 호르몬(성선 호르몬)이나 부신피질 호르몬 등이 포함된다.

"생식선 호르몬 또는 성선 호르몬"이란 척추동물의 암컷, 수컷의 생식소에서 분비되는 호르몬으로 생식기의 발육을 촉진 시키고 그 기능을 유지시키는 역할을 한다. 웅성의 경우는 정소 중의 간세포(間細胞)이고 자성은 주로 난소(卵巢)의 여포를 구성하고 있는 난구세포 및 협막세포이다.

"생리 또는 월경"은 인간의 성인 여성이 주기적으로 난소에서 난자를 만들어 내고 수정되었을 경우 수정란이 자궁에 착상하게 하기 위한 자궁 점막이 수정란의 착상이 없을 때 비후된 자궁내막이 출혈과 함께 질을 통해 배출되는 생리 현상을 말한다. 보통 28일 정도의 주기를 가지며 3~5일 정도 지속 된다. 대개 12~15세 정도로 성장하게 되면 처음 월경을 시작하게 되며, 여성은 일생동안 약 400회의 월경을 하게 되고 이후 45~55세가 되면 폐경기가 되어 월경을 멈추게 된다. 월경으로 흘리는 피는 약 35 ml이며 10~80 ml 이내는 정상이다.

"생리주기(menstrual cycle)"란 내분비계통 호르몬의 영향에 의해 생식기관에 나타나는 규칙적인 변화로 21~35일 사이로 일정치는 않으나 대개 약 28일을 주기로 반복되며 월경이 시작되는 날부터 다음 월경이 나타날 때까지의 기간을 말한다. 자궁내막과 난소는 여성 호르몬의 분비 정도에 의해 주기성을 나타내는데, 자궁내막이 허물어지면서 출혈을 하는 경우를 월경이라 하고, 난소 내의 난포가 성숙하여 난자를 방출할 때를 배란일이라 한다.

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산프로브 (probe) 또는 항체에 컨쥬게이팅 (conjugating) 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 성조숙증의 진단 및 이에 필요한 정보제공, 및 이를 이용하는 것에 관한 것이다.

본 발명에서 "성조숙증"은 2차 성징이 평균치의 표준편차보다 빨리 나타나는 증상으로, 성적 성숙 및 수정 능력을 갖추기 위해 성선 및 시상하부-뇌하수체-성선 축의 기능이 활성화되는 사춘기의 시작을 포함한다. 상기 성조숙증은, 진성성조숙증, 가성 성조숙증 및 불완전형 성조숙증 등의 다양한 유형의 성조숙증을 포함한다. 바람직한 구체예로서는 진성 성조숙증의 진단 및 이에 대한 정보제공에 관한 것이다.

상기 진성성조숙증(Central Precocious Puberty, CPP)은 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어진 생식내분비축의 활성화로 인하여 나타나는 성조숙증을 의미한다. 이에 반해 시상하부-뇌하수체-생식소축의 활성화가 동반되지 않는 경우를 가성 성조숙증이라하고 2차 성징은 나타나지만 부분적으로 나타나며, 일반적으로 진행하지 않거나 증상이 소실되는 경우로 조기 유방 발육증, 조기 음모 발생증, 조기 초경 발생증이 나타난 경우에는 불완전형 성조숙증이라한다.

사춘기는 어린이에서 어른이 되는 전이 (transition) 시기이다. 이 시기에는 2차 성징의 발달 및 성장이 동반된다. 여아에서는 가슴 및 음모 (pubic hair)의 발달 남아에서는 고환 및 생식기의 크기 발달 및 음모의 발달이 2차 성징의 외현지표로 이용된다

여아의 경우 가슴 및 음모의 발달 단계를 각각 5단계로 나눌 수 있고 넓게는 사춘기 이전단계, 초기, 중기, 말기, 성인단계로 나눌 수 있으며 한국인 여아의 경우 가슴발달이 11.3 ± 1.3세, 음모발달이 12.3 ± 1.2세에 시작되고, 초경은 12.0 ± 1.0세에 시작되는 것으로 보고되어 있다. 성 성숙 특히, 초경율은 유방발달 2단계에서 18.2%, 3단계에서 66.1%, 4단계에서 91.7%, 5단계에서 100%로 알려져있고, 음모발달 2단계에서 52%, 음모발달 3단계에서 93.8%로 보고되어있다. 이러한 결과는 가슴발달 및 음모 발달이 초경의 시작과 밀접히 연관은 되어있으나 2차 성징의 발달만으로는 초경의 시작을 쉽게 예측할 수 없다는 것을 시사한다.

초경은 정상적인 성인여성에서 나타나는 생리현상이며 여아에서 성인 여성과 동일한 체내의 신경 내분계가 완성되었고 정상적인 생식활동을 할 수 있는 체내환경이 조성되었다는 것을 의미한다.

여아의 가슴 및 음모발달은 생식소 및 부신의 호르몬 생성증가와 연관되어 있다. 사춘기의 시작과 함께 생식소 (난소)의 성호르몬 생성증가가 나타나는 현상을 "gonadarche" 부신에서 DHEA 생성이 증가하는 현상을 "adrenarche"라 불리우며 성호르몬의 생성증가는 여아의 경우 가슴발달 (thelache)을 유도하며 DHEA의 증가는 음모의 발달 (pubarache)을 유도하는 것으로 알려져있다.

그러나 어느 요인에 의하여 gonadarche 및 adrenarche가 시작되는지에 대해서는 알려져 있지 않다. 1980년 Wildt등은 GnRH 유도체를 어린 원숭이에 간헐적으로 주사할 경우 성조숙을 유도할 수 있고 사춘기의 시작이 뇌하수체 및 난소발달에 의존하기보다는 시상하부의 신경세포에서 GnRH가 방출에 의존한다는 사실을 Science에 발표하였다. 이는 시상하부의 GnRH 신경세포에 저해요인들이 작용하여 GnRH의 방출을 억제하고 있으며 그 억제요인이 제거되면서 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어지는 생식내분비축이 활성화되고 그 축에서 생성, 분비되는 성 호르몬에 의하여 2차성징 (유방)의 발달 및 초경이 유도되는 것으로 해석 되어진다.

본 발명의 일 양태에서는 역령 나이 8세 364일 미만(만 9세 미만)을 기준으로 삼아서 성조숙증 여부를 판단할 수 있다.

진성 성조숙증 진단 및 이에 필요한 정보는, 본 발명에서 일 구체예로 제공할 수 있는 부신, 생식 내분비 정보; 사춘기의 발달의 시작 및 가슴발달을 판단하는데 필요한 정보를 포함하고, 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식내분비선이 성숙되었음을 판단하는데에 필요한 정보를 포함하여 여아의 초경 시작 시기 등의 예측에 활용 역시 포함할 수 있다.

대상 시료

진성 성조숙증 진단 및 이에 필요한 정보를 제공하기 위해 사용하는 시료는 혈액, 소변, 대변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭액, 복수, 흉막, 삼출액 등 일 수 있다.

바람직하게는 타액, 혈액, 소변일 수 있다. 본 발명의 바람직한 예 중 하나로 "타액(saliva)"을 이용한다.

예를 들어, 호르몬의 농도는 혈액에서 측정할 수 있다. 내분비학 관점에서 보면 혈액은 호르몬의 이동매체로서, 대부분의 혈중 단백질계열 호르몬 (성장 호르몬, 인슐린 등)은 물에 잘 용해되며 (친수성, hydrophilic) 혈중에서는 활성화된 형태로 존재하지만 부신피질, 성선에서 생성되는 스테로이드는 물에 잘 녹지 않기 (소수성, hydrophobic) 때문에 다른 매체 (운반단백질)와 결합하여 혈중에 존재한다.

혈액의 경우는 팔의 정맥에서 채취하며 혈액 검사는 코티솔이 정점에 이른 오전이나 농도가 떨어진 오후 경에 다시 채혈할 수 있다. 2개 이상의 검체를 채취하면 코티솔 분비의 하루 패턴(일중변동)을 평가할 수 있기 때문이다. 다만, 본 발명에서 바람직하게는 기상 후 1시간 내에 이루어지는 것을 특징으로 한다. DHEA는 주로 아침시간에 만들어져 빠른 속도로 신장에 의해 제거되어 감소 된다. 그러나 DHEAS는 매우 천천히 제거됨으로써 DHEA의 약 90%는 DHEAS로 존재하기 때문에 혈액중의 DHEA양을 측정할 때에는 DHEAS을 측정할 수도 있다.

다른 예로, 소변에서 시료를 채취할 경우 낮과 밤 동안에 생성된 모든 소변(24-시간 소변)을 모으는 것이 필요한 경우도 있지만, 본 발명의 경우에는 아침에 모은 소변 시료를 대상으로 한다. DHEA의 측정의 경우에는 주로 아침시간에 만들어져 빠른 속도로 신장에 의해 제거되어 감소 되므로 DHEAS를 측정할 수도 있다.

바람직한 일 예로, 호르몬의 농도는 타액에서 측정할 수 있다. 타액에 포함되어 있는 스테로이드는 혈액과 달리 모두 운반매체와 결합 되어 있지 않은 활성 상태이며 조직외액(extracelluar fluid)에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드가 단순 확산방식(passive diffusion)에 의해 타액샘 (salivary gland)으로 이동한 것이다. 따라서 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 조직 안에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드로 인식되고 있다.

또한, 타액은 혈액과 달리 의료진의 도움 없이도 개인의 수면주기에 맞추어 일반인이 쉽게 채취할 수 있기 때문에 개인의 호르몬 하루 주기 리듬에 대한연구를 쉽게 진행할 수 있는 장점을 가지고 있다. 즉, 타액을 이용할 경우 혈액으로 접근이 어려웠던 활성상태의 스테로이드의 농도와 개인의 호르몬 하루 주기 리듬에 대한 접근이 용이하다는 장점이 있다.

본 발명은 바람직한 일 예로써 타액 내 존재하는 호르몬들의 농도를 측정하는 바, 상기와 같은 장점을 효과로 발휘할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 시료는 기상 후 일정 시간 이내에서 일정 간격을 두고채취한 것을 이용할 수 있다. 예를 들어, 1시간 이내에 채취한 것을 이용할 수 있고, 구체예로서, 타액 등의 시료는 적어도 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분의 3번에 걸쳐서 채취하여 사용하는 것이 바람직하다.

대상 호르몬

본 발명은 생체지표를 활용하여 사춘기가 시작되었는지 여부 및 유방발달 정도를 판단하기 위하여, 상기 시료, 예를 들어, 타액 내 존재하는 코티졸 (cortisol) 디하이드로에피엔드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), "에스트라디올 (estraiol-17β, E2)" 및 "프로제스테론( progesterone, P4)"의 농도를 이용하는 것을 특징으로 한다.

"DHEA"는 비교적 약한 안드로겐 스테로이드로 남성호르몬과 여성호르몬 합성에 필요한 중간단계 물질이다. DHEA는 주로 부신 피질에서 분비되지만 성선(gonad), 지방조직 그리고 뇌에서도 소량이 합성되는 것으로 알려져 있다. 사람의 경우 하루에 DHEA가 약 4 mg 그리고 황산화 형태인 DHEA-s는 약 25 mg 분비되어 혈액 내에서 가장 많은 스테로이드이다.

DHEA의 기능은 아직도 완전히 밝혀지지는 않았지만 작용 기전을 몇 가지로 나누어 생각할 수 있는데 첫째, 성호르몬의 전구물질로서의 기능이 있어 필요한 조직에서 남성 혹은 여성 호르몬으로 변환되어 사용되고, 둘째, 중추신경계에서는 신경활성화 스테로이드로 작용하여 여러 신경 전달물질들과의 상호 작용을 통하여 신경 자극을 조절하며, 셋째, 스트레스 상태에서 코티졸의 역할을 완충해 주고, 넷째, 칼슘 관문 칼륨 통로(calcium gated potassium channel)를 활성화하는 역할을 한다.

"에스트라디올(E)"은 생식소(난소)에서 생성, 분비되는 호르몬이다. 특히 여성에서 유선의 발달, 자궁내막의 비후에 관여하고 난소의 난자의 성장을 유도하는 호르몬으로 알려져있다. 특히, E2은 난소의 스테로이드 생성과정 중 최종산물이며 난자의 성장과 자궁비후의 조절자 역할을 한다.

본 발명의 일 구체예에서 에스트라디올 (estradiol)로서 17번 탄소의 하이드록실 그룹 (OH) 위치가 베타형의 에스트라디올(β-estradiol)을 사용할 수 있다. 베타 에스트라디올은 축약하여 E2로 표시하며, 척추동물의 암컷의 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬인 에스트로젠(estrogen)의 한 종류로써, 난소, 태반 등에서 추출, 결정화되는 여포호르몬의 하나이다. 암컷의 생식선을 발달시켜 2차, 3차 성징을 나타내는데, 특히 포유류에서 발정을 일으킨다. 또한, 세포핵에 들어가 새로운 단백질의 합성을 촉진하고, 세포의 증식을 일으키는 작용이 있다. 특히, 베타 에스트라디올은 여성의 몸 안에서 심하게 변동하는 생식호르몬으로, 카페인과 비슷한 작용, 즉 아데노신이 원래부터 가지고 있는 억제효과를 상쇄함으로써, 여성들이 월경 주기 중 여포기 후기, 곧 배란 직전에 경험한다는 가벼운 흥분을 일으키는 물질로 알려져있다.

정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성에서는 E2의 생성, 분비 또한 일정한 일주기리듬을 나타내며 아침기상 후 최초 한 시간 안에 약 150-200%의 상승이 나타나는 것으로 보고되어 있다. 아침기상 후 E2 농도의 변화는 생리기, 여포기, 배란기에 따라 증가폭 및 분비량이 달라지며 폐경기 여성에서는 아침기상 후 E2 농도 증가가 나타나지 않은 것으로 보고되어 있다.

“프로제스테론 (Progesterone, P4)”은 생식소(난소)에서 생성, 분비되는 21개 탄소골격을 갖는 스테로이드 호르몬이다. 특히 여성에서 난자의 성숙, 배란을 유도하고 E2에 의해 비후된 자궁내막의 비후도를 유지하여 수정란의 착상을 유도하는 호르몬으로 알려져있다. 특히, 수정란의 착상 후 태반에서 다량의 P4가 생성, 분비되며 수정란의 착상유지를 돕는 것으로 알려져있다.

정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성에서 P4의 생성, 분비 또한 일정한 일주기리듬을 나타내며 아침기상 후 최초 한 시간 안에 약 150-200%의 상승이 나타나는 것으로 보고되어 있다. 아침기상 후 P4 농도의 변화는 생리기, 여포기, 배란기에 따라 증가폭 및 분비량이 달라지며 폐경기 여성에서는 아침기상 후 P4 농도 증가가 나타나지 않은 것으로 보고되어 있다.

P4는 난소의 E2 생성과정 중 중간단계에 생성되는 호르몬이고, E2 생성이 충분히 완료될 때 비로소 P4의 생성, 분비증가가 나타나며 P4는 난자성숙, 배란, 유선발달, 자궁비후도 유지 등과 관련이 있는바, 여아에서 성인여성 수준의 P4 분비의 증가는 성숙된 난자의 배란, 자궁비후와 관련되어 있어 사춘기의 최종단계, 즉 생리 (초경)와 연관되어 있음을 시사한다.

또한, 본 발명에서 사용하는 또 다른 호르몬은 코티졸(cortisol)이다.

"코티졸(cortisol)"은 부신피질에서 분비되는 스테로이드 호르몬이다.

부신의 하루주기 리듬은 뇌신경, 시상하부(hypothalamus), 뇌하수체(pituitary)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있으며 근본적으로는 개인의 수면주기에 의하여 결정 되어진다. 정상적으로 밤에 수면을 취한 후, 아침에 일어나면 뇌신경에서는 기상(wake up)을 인지하며, 이 신호는 시상하부의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에 도달하게 되고 시교차상핵에서는 생체시계 유전자(clock gene)가 활성화되며, 이 신호는 다시 뇌실옆핵(paraventricularnucleus, PVN)에 전달된다. 뇌실옆핵에서는 이 자극에 반응하여 부신피질자극호르몬 분비호르몬(corticotropin releasing hormone, CRH)을 분비하며, 분비된 분비호르몬은 뇌하수체를 자극하여 부신피질자극호르몬(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)을 생성, 분비하게 된다. 뇌하수체에서 생성, 분비되는 ACTH 농도는 기상 후 15분에 정점(peak)에 이른다. 혈액에 분비된ACTH는 부신에 작용하여 부신피질에서의 코티졸, DHEA 등 스테로이드 생성, 분비를 증가시키게 된다.

따라서, 최정상 코티졸 농도는 기상 후 30분 정도에 나타나며 이때의 코티졸 농도가 하루 중 가장 높다. 이와 같이 아침에 잠에서 깨어난 후 30분 정도에 코티졸 농도가 정상에 이르는 현상을 기상에 따른 코티졸 반응(cortisol awakening response, 이하 CAR)이라 한다.

CAR은 일반적인 수면 환경, 빛, 수면시간 동안 깨는 현상 등에 영향을 받지 않으며, 건강상태에 의하여 많은 영향을 받는 것으로 알려져있다. 그러나 기상 직후 타액 시료채취가 10분 이상 지연되면 CAR현상은 나타나지 않은 것으로 보고되어 있다

그러므로, 본 발명의 다른 구체예로서, 성조숙증 진단을 위한 정확한 정보를 수득하기 위해서 아침 기상 직후부터 최초 한 시간동안 타액 내의 코티졸 농도 변화가 2.5 nmol/L 이상인 경우의 타액을 대상으로 DHEA, E2 및 P4농도를 측정할 수 있다. 즉, DHEA, E2 및 P4농도 측정 전에 적합한 타액 시료의 결정을 위해 코티졸의 농도 변화를 추가로 확인할 수 있다.

이 때, 아침 기상 직후부터 최초 한 시간동안 타액 내의 코티졸 농도변화 확인은 아침기상 직후, 기상 30분, 기상 60분에 각각 채취한 타액을 대상으로 할 수 있다.

이하, 상기 4가지 호르몬의 농도를 이용하여 진성성조숙증 진단 및 이를 위한 정보제공법에 대한 구체적인 단계를 예를 들어 설명한다. 이러한 설명은 본 발명의 일 실시예에 관한 것으로, 본 발명을 제한하지 않는다.

진단 및 이에 필요한 정보 제공방법

일 양태로서, 본 발명은 생체지표 (부신,생식내분비축의 활성)를 활용하여 사춘기가 진행되었는지 여부 및 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식내분비선이 성숙되었는지를 판단하는 기준에 대한 것이며 이를 근거로 만 9세 미만에서 부신, 생식내분비축의 활성이 나타나면 진성성조숙증을 예측하는 기준에 관한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 시료에 포함되어 있는 부신피질호르몬 중 코티졸, 디하이드로에피엔드로스테론 (dehydroepiandrosterone, DHEA)의 농도 변화를 수치화하여 부신내분비축의 활성 정도를 파악하고, 성선호르몬 중 에스트라디올(estradiol, E2) 및 프로제스테론 (Progesterone, P4)의 증가된 총량의 분석을 통해 수치화하여 생식내분비축의 성숙여부를 파악하여 진성성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 양태로서, 본 발명은 다음과 같은 진성성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

1) 만 9세 미만의 여아로부터 채취한 시료로부터 코티졸, DHEA, E2 및 P4농도를 시간별로 측정하는 단계;

a) 시간별 코티졸/DHEA (몰 농도 비율),

3) 상기 2)단계의 값이 다음에 포함되는 경우 해당 정보를 제공하는 단계;

ⅰ) a)의 값이 1 내지 80인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

이하는 위의 정보제공방법에 관한 각 단계에 대한 설명이다.

(1) 대상 여아의 분류

본 발명에서는 성조숙증의 기준 나이로서 2차 성징의 발달이 역령 8세 354일 이전으로 한다. 즉, 만 9세를 기준으로 하여 만 9세 미만의 여아를 대상으로 삼는다.

(2) 시료의 준비

본 발명의 시료는 대상 여아의 혈액, 소변, 대변, 타액, 림프액, 뇌척수액, 활액, 낭액, 복수, 흉막 삼출액일 수 있으며 바람직하게는 타액, 혈액, 소변 일 수 있다. 또한 바람직한 일 예로 시료는 타액일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 시료는 기상 후 일정 시간 이내에서 일정 간격을 두고채취한 것을 이용할 수 있다. 예를 들어, 1시간 이내에 채취한 것을 이용할 수 있다.

일 예로 상기 시료는 규정된 정확한 시간에 채취된 타액으로, 아침기상 직후(눈을 뜬 후 바로), 기상 30분, 기상 60분에 채취한 타액을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 바람직한 예로서, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안에 코티졸의 농도가 최소 2.5 nmol/L 이상 증가하는 타액을 사용할 수 있다.

정상적인 성인 남, 여에서 아침기상 후 코티졸의 농도는 50-150% 증가하는 것으로 보고되어 있고, 기상 직후부터 기상 30분 후까지 최소 2.5 nmol/L이 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러나 정상적인 남, 여에서 아침 기상 직후 첫 타액시료의 채취가 10분 이상 지연되었을 경우에는 이러한 코티졸 증가 현상을 관찰할 수 없는 것으로 아울러 보고되어 있다. 기상 후 10분 이상 지연되어 채취된 시료에서는 코티졸 농도 증가현상을 볼 수 없고, 이러한 시료들은 본 발명의 검사에서 제외되는 것이 바람직하다.

타액 등의 시료는 적어도 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분의 3번에 걸쳐서 채취하여 사용할 수 있는데, 검사 대상자가 기상 직후에 바로 시료를 채취했다고 표시하더라도 기상이라는 의미가 개인별 차이가 있기 때문에 아침기상 직후 첫 시료의 채취가 지연되었는지, 규정된 시간에 정확히 채취되었는지 등을 확인하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 방법은 준비된 시료가 분석에 적합한지 여부를 확인하기 위하여 코티졸의 농도 변화를 확인하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

이는 아침기상 후 코티졸의 농도 변화를 통하여 정확한 시간에 시료가 채취되었는지 확인하기 위한 것으로서, 아침 기상 직후부터 최초 한 시간 동안에 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 경우의 시료로 결정하여 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 기상 직후부터 최초 한 시간 동안 시료 내 코티졸의 농도 증가량이 2.5 nmol 미만인 경우 해당 시료를 배제할 수 있다.

(3) 시료 내 코티졸 , DHEA, E2 및 P4 농도 측정

본 발명은 일 예로서, 상기 채취한 시료를 이용하여 코티졸, DHEA, E2 및 P4의 농도변화를 수치화하여, 이들 사이의 특정 관계 값을 확인함으로써 사춘기 발달의 초기단계 또는 생식내분비선이 성숙 되었다고 판단하여 진성성조숙증 판단에 필요한 정보를 수득할 수 있다.

상기 만 9세 미만 대상 여아에서 일정한 시간의 간격을 기준으로 채취한 시료를 통하여 코티졸, DHEA, E2 및 P4 농도를 측정하여 그 농도 변화를 관찰한다.

바람직하게는 기상 후 1시간 내에 일정한 시간 간격으로, 예를 들어 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 1시간 때 채취한 시료가 포함하고 있는 코티졸, DHEA, E2 및 P4 농도를 각 해당 시간별로 측정하고, 그 변화를 관찰한다.

그리고, 아침 기상 직후부터 최초 한 시간 동안에 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 경우의 타액을 시료로 한 경우에 대하여 DHEA, E2 및 P4를 추가로 분석한다.

상기 코티졸, DHEA, E2 및 P4 농도 측정은 다양한 공지의 방법을 사용할 수 있으며 이는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

혈액, 소변 또는 타액을 시료로 채취한 경우 정확한 농도를 측정하기 위한 시료의 전처리 과정을 거칠 수 있다.

비제한적으로, 방사선 면역 측정법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 효소를 표지자로 이용한 효소면역측정법(EIA), 루미놀(luminol)이나 그 유도체 또는 ABEI(aminobutyl-ethylisoluminol)로 감도를 증가시킨 화학섬광면역측정법(chemiluminescence immunoassay; CIA), 또는 형광물질표지자(fluorescent label)를 이용한 형광면역측정법(fluorescence immunoassay; FIA) 등이 사용될 수 있다.

방사면역측정법은 높은 감도(sensitivity)와 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 나타내며, 반응 후의 분명하고 명백한 검출을 가능케 해주는 등 여러 이점을 가지고 있는바, 가장 바람직하게는 방사선 면역 측정법을 사용할 수 있고, 이를 위해 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법을 이용할 수 있다.

혈액, 소변 또는 타액을 시료로 채취한 경우 방사선 면역측정법을 사용하기 위한 시료의 전처리 과정을 거칠 수 있다.

타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 혈액의 1/100-1/1000 정도로 매우 낮은 문제점이 있으므로, 타액에 포함되어 있는 소량의 호르몬 농도를 측정하기 위하여 고도로 민감한 분석 시스템이 요구되는데, 이러한 액상-이중항체(liquidphased-double antibody)방법이 유용하게 활용될 수 있다. 보다 상세한 측정과정은 액상-이중항체 방법을 이용한 호르몬 측정에 관한 논문(Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population; age-related differences, diurnal, and correlations with serum levels . Yonsei Med J. 2007;48 :379- 88)을 참조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 요오드 125 (¹²⁵I)로 표지된 항원과 2차 항체를 이용한 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)을 이용하였다.

(4) a) 시간 별 코티졸 /DHEA 값( 몰농도 비율) 도출 : 사춘기 발달의 시작여부 정보 수득

상기 각 시간별로 측정된 코티졸 및 DHEA 농도 값을 이용하여, 각 시간의 코티졸 대비 DHEA의 몰 농도 비율 (molar F/D ratio)를 구함으로써, 부신 내분비축의 활성도를 판단할 수 있다. 그리고 이를 통하여 대상 여아에서 사춘기의 초기단계에 있는지에 대한 정보를 수득할 수 있다.

호르몬의 몰 비율(molar ratio)은 동일한 호르몬 생성기관에서 호르몬 (A)와 호르몬 (B)가 생성, 분비되고 두 호르몬의 생성이 상호 연관을 가지거나 호르몬이 상호 반대적인 역할을 수행할 때, 두 호르몬 간의 비율은 호르몬 생성기관의 생성양상의 균형도(balance)를 의미하고 혹은 두 호르몬이 상호반대 작용을 할 경우, 두 호르몬간의 비율은 호르몬 작용 간의 균형도를 의미 한다.

상기 코티졸과 DHEA는 모두 부신피질호르몬으로 두 호르몬 간의 비율을 통해 부신피질의 활성도를 알 수 있다.

(3) 단계에서 측정한 코티졸 및 DHEA의 농도는 몰 농도(mol/L)로 나타내며 시간 별로 DHEA의 몰 농도에 대한 코티졸의 몰 농도를 구하여 (molar 코티졸/DHEA ratio)비율을 구한다.

코티졸과 DHEA 두 호르몬의 각 시간별 몰 농도 비율을 통해 부신내분비축의 활성도를 판단할 수 있다.

대상여아에서 시간별 코티졸/DHEA (몰 농도 비율) 의 값이 1 내지 80인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단할 수 있다.

또한, 대상 여아에서 시간별 코티졸/DHEA (몰 농도 비율) 의 값이 기상 직후 값이 1 내지 40, 4 내지 37 또는 4.7 내지 33; 기상 30분 후 값이 1 내지 80, 8 내지 78 또는 9.2 내지 76; 기상 60분 후 값이 1 내지 59, 5 내지 59 또는 7.2 내지 58.7인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단할 수 있다.

사춘기 발달이 시작되었다는 것은 사춘기 발달의 초기단계에 있는 것을 포함하는 것으로써 2차 성징 특성에 기초를 둔 성성숙 단계(Tanner stage)의 2단계 내지 3단계를 포함한다. 이러한 사춘기 발달이 시작되면 유방과 유두의 융기가 있으며 유방과 유륜의 확대가 된다. 또한, 이와 더불어 음모의 음순 주위 간 솜털이 자라게 되며 음모가 짙어지며 곱슬이 된다. 성성숙도 2단계와 3단계 사이에 키 성장이 가장 활발히 진행되어, 여자는 평균적으로 약 8.8 cm 신장이 증가, 체중도 약 8kg 정도 증가하여 다른 단계보다 큰 변화가 관찰된다. 따라서 사춘기 발달이 시작되었음은 이와 같은 현상을 포함할 수 있다.

(5) b) CARauc / Dauc 값( 몰농도 비율) 도출: 사춘기 발달의 시작여부 정보 수득

상기 (3)에서 각 시간별로 측정된 코티졸 및 DHEA 농도 값을 이용하여 기상 후 최초 1시간 동안 분비된 코티졸 총 분비량에 대한 DHEA 총 분비량의 몰 농도 비율 (molar CARauc/Dauc ratio)을 구함으로써, 부신 내분비축의 활성도를 판단할 수 있다. 그리고 이를 통하여 대상 여아에서 사춘기가 시작되었는지 대한 정보를 수득할 수 있다.

(3) 단계에서 측정한 코티졸 및 DHEA의 농도는 몰 농도(mol/L)로 나타내며

일 예로, 아침기상 직후, 기상 30분 후, 60분 후에 채취한 각각의 타액에서 측정된 코티졸과 DHEA 농도를 각각 적분하여 CARauc 및 Dauc를 각각 구하고 이를 이용하여 molar CARauc/Dauc ratio를 구한다.

대상 여아에서 시간별 CARauc/Dauc (몰 농도 비율)의 값이 1 내지 55, 14 내지 55 또는 14.9 내지 51.6인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 볼 수 있다.

이러한 값은, 또한 아침기상 후 최초 한시간 동안 CARauc/Dauc ratio가 부신피질 기능항진(adrenarche)이 시작 되었는지에 대한 지표로 활용될 수 있다.

사춘기 발달이 시작되었다는 것은 사춘기 발달의 초기단계에 있는 것을 포함하는 것으로써 2차 성징 특성에 기초를 둔 성성숙 단계(Tanner stage)의 2단계 내지 3단계를 포함한다. 이러한 사춘기 발달이 시작되면 유방과 유두의 융기가 있으며 유방과 유륜의 확대가 된다. 또한, 이와 더불어 음모의 음순 주위 간 솜털이 자라게 되며 음모가 짙어지며 곱슬이 된다. 성성숙도(Tanner stage) 2단계와 3단계 사이에 키 성장이 가장 활발히 진행되어, 여자는 평균적으로 약 8.8 cm/yr 신장이 증가, 체중도 약 8 kg/yr 정도 증가하여 다른 단계보다 큰 변화가 관찰된다. 따라서 사춘기 발달이 시작되었음은 이와 같은 현상을 포함할 수 있다.

(6) c) E2auci 값 도출 : 사춘기발달 진행여부 , 유방발달 및 생식 내분비선의 성숙도 정보 수득

상기 (3)에서 측정된 E2 농도 값을 이용하여, E2 기저농도를 기준으로 기상 후 한 시간 동안 증가한 E2 농도에 대한 증가량의 총량을 분석함으로써, 대상 여아의 사춘기 발달 진행여부, 가슴발달 정도 및 체내 생식내분비적 환경에 대한 정보를 수득할 수 있다.

상기 (3)에서 측정된 E2 농도 값을 이용하여, E2 기상 직후 농도(기저농도)를 기준으로 기상 후 30분, 60분 동안 증가한 E2 농도에 대한 적분량 (E2 area under the curve in respect to the increase, E2auci)을 분석함으로써, 대상 여아의 사춘기 발달 진행여부, 가슴 발달 정도 및 체내 생식내분비적 환경에 대한 정보를 수득할 수 있다.

이 때, E2auci (pmol/L) 값이 120 내지 1500인 경우, 130 내지 1500인 경우 또는 138 내지 1500인 경우 대상 여아의 사춘기 발달이 진행되었으며 유방발달이 2~3단계(Tanner stage)로 진행 및 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식내분비선이 성숙된 경우로 판단할 수 있다.

또한, 추가로 대상 여아의 E2auci 값이 685 pmol/L이상 일 경우, 대상 여아의 생식내분비축이 성인여성과 같이 성숙되었다는 것을 예측할 수 있다.

사춘기 발달이 진행중 이라는 것은 사춘기 발달의 초기, 중기, 말기를 모두 포함하는 것으로써 이차 성징 특성에 기초를 둔 성성숙 단계(Tanner stage)의 2단계 내지 4단계를 포함한다. 이러한 사춘기 발달이 진행되면 유방과 유두의 융기가 있으며 유방과 유륜의 확대가 되고 그 이후 유륜이 두드러지게 변해서 유방모양보다 약간 더 튀어나오고 이후에는 유륜이 유방전체 모양과 일치하면서 성인여성의 형태와 같아진다.

또한, 이와 더불어 음모의 음순 주위 간 솜털이 자라게 되며 음모가 짙어지며 곱슬이 되고 그 이후 어른형태의 털이 되며 분포도 성인여성과 같은 분포가 된다.

성성숙도(Tanner stage) 2단계와 3단계 사이에 여자는 평균적으로 약 8.8 cm/yr 신장이 증가하여 다른 단계보다 큰 변화가 관찰되나 4단계에는 평균 약7cm/yr 정도 신장이 증가하고 5단계에는 거의 키가 자라지 않게 된다. 따라서 사춘기 발달 진행된다는 것은 이와 같은 현상을 포함할 수 있다.

초경이 시작될 수 있을 만큼 생식내분비선이 성숙되었다는 것은 여아에서 성인 여성과 동일한 체내의 신경 내분계가 완성되었고 정상적인 생식활동을 할 수 있는 체내환경이 조성되었다는 것을 의미한다. 따라서, 초경이 임박하였고 1년 이내에 초경을 할 가능성이 있다는 것을 포함할 수 있다.

(7) d) P4auc 값 도출 : 사춘기 발달 진행여부 및 생식 내분비선의 성숙도 정보 수득

상기 (3)에서 각 시간별로 측정된 P4농도 값을 이용하여, 기상 후 한 시간 동안 총 분비량을 분석함으로써, 대상 여아의 사춘기 발달 진행 여부 및 체내 생식내분비적 환경에 대한 정보를 수득할 수 있다.

상기 (3)에서 아침기상 직후, 기상 30분 후, 60분 후에 채취한 각각의 타액에서 측정된 P4 농도를 각각 적분하여 P4auc(P4area under the curve, P4auc)를 구하고, 대상 여아의 사춘기 발달 진행 여부 및 체내 생식내분비적 환경에 대한 정보를 수득할 수 있다.

이 때, P4auc (nmol/L) 값이 정상적인 생리주기를 갖는 성인여성의 평균 수치 이상인 경우, 대상 여아의 사춘기 발달이 진행중임과 더불어 생식 내분비선이 성숙되어 생리 (초경)을 준비하는 경우로 판단할 수 있다.

이 때, P4auc (nmol/L) 값이 8 내지 30인 경우, 9 내지 20인 경우 또는 9 내지 15인 경우 대상 여아의 사춘기 발달이 진행중이며, 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙되었다고 판단할 수 있다.

또한, 추가로 대상 여아의 P4auc 값이 9nmol/L 이상 일 경우, 대상 여아의 생식내분비축이 성인여성과 같이 성숙되었다는 것을 예측할 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 코티졸, 디하이드로에피엔드로스테론 (dehydroepiandrosterone, DHEA), 에스트라디올(estradiol, E2) 및 프로제스테론 (progesterone, P4)의 농도와 이들의 변화를 이용하여 특정 값의 범위 기준을 확인함으로써 부신 내분비축의 활성 정도를 파악하고, 생식내분비축의 성숙 여부에 대한 정보를 수득할 수 있다. 또한, 나아가 이러한 정보를 이용하여 성조숙증 여부를 진단할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 일 구체예로서 다음의 방법을 제공한다.

2) 상기 측정된 농도로부터 다음의 값을 모두 구하는 단계; 및

a) 시간별 코티졸/DHEA (몰농도 비율)

b) CARauc/Dauc (몰농도 비율), 이때, CARauc 및 Dauc는 각각 기상 후 한 시간동안의 코티졸 총 분비량 및 DHEA 총 분비량을 의미함

c) E2auci 값: 이때, E2auci는 기상 후 한 시간동안의 E2 증가량의 총량

ⅰ) a)의 기상 직후 값이 1 내지 40, 기상 30분 후 값이 1 내지 80, 기상 60분 후 값이 1 내지 59인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

ⅲ) c)의 값이 120 내지 1500인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식내분비선이 성숙 되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

본 발명의 다른 구체예로서, 다음의 방법을 제공한다.

1) 만 9세 미만의 여아로부터 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간 때 채취한 시료로부터 각각 코티졸, DHEA, E2 및 P4 농도를 측정하는 단계;

a) 시간별 코티졸/DHEA (몰 농도 비율),

4) 상기 3)단계의 값이 다음에 포함되는 경우, 해당정보를 제공하는 단계.

ⅰ) a)의 기상 직후 값이 4.7 내지 33, 기상 30분 후 값이 9.2 내지 76, 기상 60분 후 값이 7.2 내지 58.7인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

ⅱ) b)의 값이 14.9 내지 51.6인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

ⅲ) c)의 값이 138 내지 1500인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

ⅳ) d)의　값이　9　내지　15인　경우　사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법　

본 발명의 또 다른 구체예로서, 다음의 방법을 제공한다.

2) 기상 직후부터 최초 한 시간 동안 시료 내 코티졸의 농도 증가량이 2.5 nmol 미만인 경우 해당 시료를 배제하는 단계;

3) 상기 측정된 농도로부터 다음 중 어느 2 이상의 값을 구하는 단계; 및

a) 시간별 코티졸/DHEA (몰 농도 비율),

ⅲ) c)의 값이 120 내지 1500인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법

상기 구체예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

이처럼, 본 발명은 코티졸, DHEA 및 E2를 이용하여 기상 후 최초 1시간 동안 분비된 코티졸 총 분비량에 대한 DHEA 총 분비량의 몰 농도 비율 및 기상 후 1시간동안 기저 농도에서 증가 된 E2 총량 및 기상 후 최초 1시간 동안 분비된 P4의 총분비량을 대상 여아의 연령과 연관하여 분석함으로써, 여아의 체내 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보 및 이에 따른 성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있고, 이를 이용하는 모든 용도를 포함한다.

특히, 여아의 사춘기 발달 초기 단계의 시작 여부, 여아의 생식 내분비선의 성숙도에 대한 예측에 관한 정보 수집 및 그 활용에 매우 유용할 것이다.

또한, 본 발명은 성조숙증 혹은 성성숙지연증에 대한 의료적 접근을 보다 용이하게 할 수 있으며, 이로 인해 나타날 수 있는 성조숙증 및 성성숙지연증의 사전 검사 및 예후검사에 충분히 이용될 수 있을 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

1. 피험자

환경적인 동질성을 보장하기 위해, 대한민국 서울 강남구의 두 초등학교를 선별하였고, 학부모 위원회의 구성원들 및 학교 선생님들로부터 여아들 및 여성 가족 구성원들의 참여에 대한 동의 및 참여자들의 건강과 사춘기 상태에 대한 정보를 받았다.

다음 기준 중 어느 하나에 해당되는 여학생들을 제외하였다: 1) 초경을 경험함; 2) 지난달 내에 구강 성장 호르몬 치료 또는, 경구 또는 경피 글루코코르티코이드-함유 약 복용; 3) 지난 2주 내에 비행기를 이용한 장거리 여행으로 시차증 가짐; 4) 만성질환 진단; 5) 비정상적인 체질량지수(BMI)를 나타냄(7, 8세: BMI 13.9 이하 또는 18.4 이상; 9세: BMI 14.4 이하 또는 19.2 이상; 10세: BMI 14.9 이하 또는 19.8 이상; 11세: BMI 15.5 이하 또는 20.4 이상; 12세: BMI 16.0 이하 또는 21.0 이상).

또한, 다음 기준 중 어느 하나에 해당되는 성인 여성들도 제외하였다: 1) 직전 월경 주기는 규칙적이나 본 실험의 시작에 앞서 6개월 내에 불규칙적인 월경 주기가 2회 이상 발생; 2) 지난 6개월 내에 호르몬 대체요법 또는 경구 피임약, 타목시펜, 또는 다른 에스트로겐-, 프로게스테론- 또는 글루코코르티코이드-함유 약 복용; 3) 임신 또는 수유, 불임의 증거 또는 성병 존재, 또는 난소부전 진단, 또는 비정상적인 BMI를 나타냄(BMI 18 이하 또는 25 이상); 또는 5) 항우울제 복용 또는 흡연자. 그러나, 경구 피임약 또는 스테로이드 함유 약을 마지막으로 사용한 시기가 본 실험 6개월 이상인 피험자들에 대해서는 자격을 인정하였다.

선정된 피험자들에게 3개의 타액 채취 튜브가 담긴 팩, 타액 채취에 대한 설명, 자기 평가 문항, Tanner stage를 결정하는 설명, 및 동의서를 분배 또는 전달하였다. 여학생 부모 233명과 성인 여성 136명은 각자 사전 동의(informed assent and consent)를 보내왔다. 참여하는 모든 여아들은 한국에서 태어나 그들의 생부모 (biological parent)와 함께 집에서 자랐다. 본 실험은 CHA 대학 강남 병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받았고 윤리 권고를 따라 실시되었다.

자가보고는 의사 평가와 강한 상관관계에 있기 때문에, 사춘기 상태는 여성-특유 사춘기 발육 자기 평가 문항을 이용하여 여아들 및/또는 그들의 부모들에 의해 결정되었는데, 유방 및 음모 발육의 5단계의 단순 Tanner line 도안을 이용하여 결정되었다. Tanner의 묘사로부터 얻어진 소량의 단순 텍스트가 예시로 첨부되었고, 설문지에 여아들 및 그들의 부모들이 ‘현재 자신과 가장 가깝게 보이 는’ 예시가 있는 박스에 체크 하도록 요구했다. 사춘기 단계는 자기 평가 문항에 따라 부여되었고, 초경 전 여아들은 그들의 자가보고(여아들 및 참여한 그들의 어머니와 함께) Tanner 유방(B) 단계에 따라 분류되었다: B1, B2 및 B3.

2. 타액 채취

일어난 후 30분에 DHEA에 대한 코티졸 비는 일하는 피험자들 내에서 목요일에서 토요일까지 안정화 시기와 함께 매일 변화를 나타내므로, 참가자들에게 목요일 또는 금요일에 일어난 즉시 그리고 일어난 후 30분 및 60분에 각 시점에서 제공되는 타액의 최소 1.5 mL 부피로 그들의 타액 샘플을 채취하도록 요구하였다.

또한, 그들에게 수면-기상 주기에 변화를 주지 않을 것을 요구하였다. 참가자들에게 정해진 시간에 타액 샘플을 채취하고(일어난 후 5분 미만, 일어난 후 25~35분 및 55~65분) 채취 튜브(Simport Inc., QC, Canada)의 표지 영역(marking area)에 각각의 채취 시간을 메모하도록 지시하였다. 외부 자극 없이 근육 움직임과 채취 튜브에 타액을 뱉는 것만으로 타액을 채취하였다.

성인 여성에게는 전날 밤에 음주를 하지 않도록 요구하였다. 샘플 채취 시기 동안에, 참가자들은 음식 섭취, 음용, 또는 양치질 및 각 샘플 채취 전에 물로 입을 헹구는 것을 삼가도록 요구하였다. 타액 안에 스테로이드 농도는 -20 또는 -80에서 보관 후 1년까지 안정적이고, 분석 전에 4회까지 샘플의 냉동 및 해동은 측정된 농도에 영향을 미치지 않으므로, 참가자들에게 그들의 타액 샘플을 샘플 제출에 앞서 그들 소유의 가정용 냉동실에 보관하도록 요구하였다. 타액 샘플은 목요일 및 금요일에 수업을 시작하기 전에 제출되었다. 이때, 육안검사에 의한 결정으로, 피로 오염된 샘플들은 본 실험에서 제외되었다. 튜브의 표지 영역에 시간 또는 날짜가 없는 샘플들 또한 제외되었다.

전형적인 CAR은 정해진 채취시간을 지키는 순응 피험자 내에서 개인의 기준치를 넘어 코티졸 레벨 내 적어도 2.5 nmol/L 증가로서 정의된다. 건강한 피험자에 있어서, 일어난 다음 10분 이상 지연 후에 첫 샘플의 채취는 일어난 후 코티졸 증가가 나타나지 않는데, 일부 피험자들에 있어서, 전형적인 CAR은 관측되지 않았다. 그리고, 일어난 직후, 일어난 후 30분 및 60분의 코티졸 농도는 초경 전 여아들 일부에 있어서 (n=76), 각각 14.8±4.8, 11.0±4.6 및 7.3±3.5 nmol/L, 성인 여성들 일부에 있어서(n=32), 각각 15.3±5.3, 13.8±4.3, 9.1±4.0 nmol/L였다.

우리는 이러한 케이스들은 타액 채취 시간을 지키지 않은 불순응 피험자들이라고 생각하였다. 그들은 다음 목요일 또는 금요일에 또 다른 타액 샘플 집단을 채취하고 일어난 후 첫 타액을 제공하는데 지체하지 않도록 요구하였다. 이러한 불순응 피험자들 케이스 가운데, 많은 초경 전 여아들(n=43)및 성인여성들(n=21) 샘플의 두 번째 집단에서 전형적인 CAR이 관측되었다.

그러나 다른 초경 전 여아들(n=33) 및 성인여성들(n=11)은 두 번째 채취에 참여하지 않았거나, 그들의 타액 샘플의 두 번째 집단에서 전형적인 CAR을 관측하지 못하였다. 그들은 무응답자들 또는 불순응 피험자들로 생각되고, 차후의 분석에서 제외하였다.

제외 절차 후에, 121명의 초경 전 여아들 [39명의 만 9세 미만 (초등학교 1, 2 학년) /유방발달 1 단계 (Tanner breast stage 1), 82명의 만 9세 이상 (초등학교 4, 5, 6학년) /유방발달 2 및 3 단계 (Tanner breast stage 2 and 3)] 및 69명의 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성들로부터 채취한 타액 샘플들로 얻어진 데이터를 본 실험에 포함시켰다.

여학생들은 0.63h±15min (range: 06.05h ~ 07.12h), 성인 여성은 06.25h±29min (range:0525h ~ 0750h)에 일어났다. 한국 천문 정보학에 따르면, 타액 샘플 채취 기간 동안에 서울에서 평균 일출은 05.12 h ~ 05.13 h에서 이루어졌다.

3. 타액 정제

채취된 샘플은 찌꺼기를 제거한 후에 -70 에서 보관하였다. 뮤신을 타액에서 제거하기 위해, 샘플들을 해동하고 원심분리 하였다(10,000g, 15min, 4). 상청액을 채취하고 시험을 수행할 때까지 -70에서 보관하였다. 모든 타액 샘플들은 전남대학교의 호르몬 연구센터에서 분석되었다.

4. 타액 내 호르몬 농도 측정

타액 내 코티졸, DHEA, E2 및 P4 농도는 방사면역측정법을 이용하여 결정되었다.

코티졸, DHEA, E2 및 P4에 대한 참조 표준은 Sigma-Aldrich 화학 회사로부터 얻었다(MO, USA). 코티졸, DHEA, E2 및 P4의 표준 용액(10 mmol/L)을 에탄올에서 준비하였고, 상기 표준 용액을 50 mmol/L 인산-완충액 세라인(saline)을 함유한 0.1% 겔라틴으로 희석함으로써 상용 표준을 제조하였다(pH=7.2).

Isotope Co. Ltd. 기관(부다페스트, 헝가리)으로부터 요오드화 코티졸 및 E2를 수득하였다. 이전에 설명한 방사성 스테로이드용 프로토콜을 변형함으로써 Iodine-125-labeled DHEA(DHEA-7-(O-carboxymethyl) oximino-(2-[125 I]iodohistamine) 및 프로제스테론 (progesterone-11a-hemisuccinyl- (2-125I)-iodotyrosine methylester)를 준비하였다. 코티졸 항혈청을 Accurate Chemical & Scientific Co.(NY, USA)로부터 구입하였고, DHEA 항혈청은 United States Biological (Salem, Mass., USA)에서 구입하였으며, E2 항혈청을 Meridian Life Science, Inc.(ME,USA)에서, P4 항혈청은 Abcam (MA, USA)로부터 구입하였다. 코티졸 항혈청을 Accurate Chemical & Scientific Co.(NY, USA)로부터 구입하였고, E2 항혈청을 Meridian Life Science, Inc.(ME,USA)로부터 구입하였다.

코티졸 항혈청은 코티손(cortisone), 11-데옥시코티졸(11-deoxycortisol),프레드니솔론(prednisolone), 코티졸-21-글루코시듀로네이트(cortisol-21-glucosiduronate), 티졸-21-설페이트(cortisol-21-sulphate), 및 다른 스테로이드와 각각 1.0%, 8.9%, 31.6%, 1.3%, 0.01% 미만, 및 0.01% 미만의교차 반응 레벨로 교차 반응한다. DHEA 항혈청은 안드로스테네디온(androstenedione), 에피안드로스테론(epiandrosterone), 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone), 및 다른 스테로이드와 각각 0.4%, 0.2%, 1.3%, 및 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다. E2 항혈청은 에스트리올(estriol), 에스트론(estrone) 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone), 및 다른 스테로이드와 각각 0.09%, 0.5%, 및 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다. P4 항혈청은 17a-hydroxyprogesterone, E2, corticosterone, 11ahydroxyprogesterone 및 기타 다른 스테로이드와 각각 2.7, !0.1, !0.1, 15.9, and 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다.

3.6 및 10.9 nmol/L의 평균 코티졸 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay 변동계수(CV)는 각각 7.4% 및 8.5% 였다(n=26). 코티졸에 대한 검출예민도는 0.4 nmol/L 였다. 159.0 및 795.0 pmol/L의 평균 DHEA 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay CV는 각각 12.5% 및 10.1% 였다(n=26). DHEA에 대한 검출예민도는 0.7 pmol/L였다. 18.4 및 183.6 pmol/L의 평균 E2 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay CV는 각각 11.5% 및 13.2% 였다(n=26). E2에 대한 검출예민도는 3.7 pmol/L였다. B1에 해당되는 14명의 여아들로부터 채취된 타액 샘플들은 검출한계(1.8 pmol/L) 아래의 E2농도를 함유하였다.

5. 데이터 분석

기상 후(post-awakening) 동안에 스테로이드 분비 활동을 분석하기 위해 보조 색인(auxiliary indices)을 적용하였다. 코티졸, DHEA 및 P4 농도 결정 후에 기상 후 1 시간 동안에 총 코티졸, DHEA 및 P4 분비는 기상 직후부터 기상 후 60분까지 윈도우용 GraphPad Prism 버전 5.00(GraphPad Software,CA, USA)을 사용하여 기저(基底, ground)에 대한 곡선 아래의 면적(AUC)으로 계산되었다(각각 CARauc, Dauc 및 Pauc). 계산된 CARauc 및 Dauc를 이용하여 기상 후 1 시간 동안에 코티졸 총 분비량에 대한 DHEA 총 분비량의 비율 (molar CARauc/Dauc ratio)을 구하였다.

E2 농도 결정 후 기상 직후의 E2 농도를 기준으로 30, 60 분 후의 증가량을 구하고 [30분 후의 E2 증가량 = (기상 30분 후 E2 농도-기상 직후 E2 농도), 60분 후의 E2 증가량 = (기상 60분 후 E2 농도-기상 직후 E2 농도)], 윈도우용 GraphPad Prism 버전 5.00(GraphPad Software,CA, USA)을 사용하여 기상 직후 E2 농도 (0), 30분, 60분 후의 증가량에 대한 곡선 아래의 면적(AUC)으로 계산되었다 (E2 area under the curve in respect to the increase, E2auci).

6. 통계분석

Shapiro-Wilk 정규성 검증은 변수들, 즉, 각 검사 시점에 스테로이드 농도 및 보조 색인(auxiliary indices)이 정상적으로 분포되지 않음을 드러냈다. 따라서 모수치 통계 검증을 위한 샘플 분포를 정규화하기 위해 상기 값들을 로그-전환하였다. 그러나 각 수치에 대한 이해도를 높이기 위하여 그림과 표에는 자연수를 사용하여 표시하였고, 로그 전환값들은 통계분석에만 이용하였다. 평균 스테로이드 레벨 및 보조 색인(auxiliary indices)에서 집단 차이는 5% 유의수준에서 일방향 또는 양방향 ANOVA 검증 또는 양방향 t 검증을 이용하여 분석하였다. 일방향 ANOVA 검증이 현저한 차이를 나타낼 때(p<0.05), 특정 집단차이를 발견하기 위해 Tukey’s post-hoc test를 수행하였다. SAS 버전 9.1(SAS Institute Inc., NC, USA)을 이용하여 통계적 계산을 수행하였다. 0.05 미만의 p값을 유의미한 것으로 간주하였다.

참고를 위해, 참가한 초경 전 여아들의 나이에 따른 유방발달 단계의 도수분포(Frequency distribution)를 도 1에 도시하였다.

여아들은 만 9세 미만/Tanner의 유방 발달 1단계 (B1)와 만 9세 이상/Tanner의 유방 발달 2 및 3단계 B2&B3)로 구분한다.

실시예 1: molar F/D ratio ( molar 코티졸 /DHEA ratio ) 변화 확인

만 9세 미만/Tanner의 유방 발달 1단계 (B1) 여아와 만 9세 이상/Tanner의 유방 발달 2 및 3단계 (B2&B3) 여아 및 성인여성에서 molar F/D ratio(molar 코티졸/DHEA ratio) 변화를 확인하고자 하였다.

정상적인 성인 남녀에서 아침기상 후 코티졸의 농도는 50-150% 증가하는 것으로 보고되어 있고 (Pressner 등 1997), 이는 기상 직후부터 기상 30분 후까지 최소 2.5 nmol/L이 증가하는 것으로 알려져 있다 (Wust 등 2000). 특히, 정상적인 남녀에서 기상 직후 첫 타액시료의 채취가 10분 이상 지연되었을 경우 기상 후 코티졸 증가 현상을 관찰할 수 없다 (Okun 등 2002). 이러한 시료에서 추가적으로 다른 스테로이드 즉, DHEA 나 E2의 정량분석은 의미가 없는 바, 아침 기상 후 호르몬 반응 검사에서 제외되어야 한다.

참여한 여아들을 나이 및 가슴발달 단계에 따라 분류하고 (만 9세 미만/B1 및 만 9세 이상 B2 및 B3), 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성에서 아침기상 후 최초 1 시간동안 molar F/D ratio를 도 2 및 표 1에 도시하였다.

Two-way ANOVA를 이용하여 분석한 결과, molar F/D ratio는 3개의 집단간에 그룹간 효과 (group effect) (F_2,561 =120.5, p < 0.0001 및 타액채취시간의 효과 (collection time effect)(F_{2, 561} =5.8 p < 0.003)는 유의성을 보였으며, 그룹X타액 채취시간 상호작용 효과 (group X time interaction effect) (F_{4, 561} =2.5, p = 0.04) 또한 유의하였다 (도 2).

이 결과는 3개의 그룹 간에 유의미하게 molar F/D ratio의 수준 (유의한 그룹효과) 및 양상 (그룹 X 타액채취시간 상호 작용 효과)에 차이를 보인다는 것을 의미한다.

만 9세 미만/B1 단계 여아들의 molar F/D ratio 수준은 만 9세 이상/B2 및 B3단계 여아들 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성(adult females) 보다 유의성 있게 높았다(모든 통계분석에서 p < 0.05).

또한, 만 9세 이상/B2 및 B3단계 여아의 molar F/D ratio 수준은 성인여성보다 유의성 있게 높았다(group effect; F_1,447 = 107.7, p < 0.0001) (도 2).

그리고, 만 9세 미만/B1 단계 여아들의 molar F/D ratio 수준은 9세 이상/B2 및 B3단계 여아들 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성(adult females) 보다 유의성 있게 높았다(모든 통계분석에서 p < 0.05). 만 9세 이상/B2 및 B3단계 여아의 molar F/D ratio 수준은 성인여성보다 유의성 있게 높았다(group effect; F_1,447 = 107.7, p < 0.0001) (도 2).

[표 1]

표 1에 나타난 바와 같이 최초 한 시간 동안 분비된 코티졸/DHEA 몰농도 비율 사춘기 시작 전인 만 9세 미만의 여아들의 경우 만 9세 이상 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인여성보다 기상 직후, 기상 30분 후, 기상 60분 후 모두 높게 측정되었다.

이러한 결과를 통해, 사춘기가 진행될수록 코티졸/DHEA 몰농도 비율은 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이는 사춘기의 시작과 함께 부신에서 DHEA 생성이 증가하기 때문인 것으로 생각된다.

따라서, 도 2 및 표 1의 결과를 통해 만 9세 미만 대상여아에서 코티졸/DHEA 몰 농도 비율이 1 내지 80인 경우 사춘기 발달이 시작된 것으로 판단할 수 있는 기준을 마련하였다.

또한, 만 9세 미만의 대상 여아에서 코티졸/DHEA 몰 농도 비율이 기상 직후 1 내지 40, 기상 30분 후 1 내지 80, 기상 60분 후 1 내지 59인 경우 사춘기 발달이 시작된 것으로 판단할 수 있는 기준을 마련하였다.

실시예 2. 기상 후 한시간 동안 molar CARauc / Dauc ratio( 코티졸 총 분비량 /DHEA 총분비량의 몰농도비율 ) 변화측정

또한, 만 9세 미만/Tanner의 유방 발달 1 단계 (B1) 여아와 만 9세 이상/Tanner의 유방 발달 2 및 3단계 (B2&B3) 여아 및 성인여성에서 기상 후 한 시간 동안 molar CARauc/Dauc ratio(코티졸 총 분비량 /DHEA 총분비량의 몰 농도 비율) 변화를 측정하였다.

참여한 여아들을 나이 및 가슴발달 단계에 따라 분류하고 (만 9세 미만/B1 및 만 9세 이상 B2 및 B3), 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성에서 아침기상 후 최초 1 시간동안 molar CARauc/Dauc ratio 를 도 3 및 표 2에 도시하였다.

도 3은 9세 미만/B1 단계 여아, 만 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아 및 성인여성에서의 molar CARauc/Dauc ratio를 상호 비교한 것이다.

One-way ANOVA를 이용한 분석결과 상기 3 그룹간의 molar CARauc/Dauc ratio에 유의한 차이가 있었으며 (group effect; F_2,187 = 74.8, p < 0.0001), 만 9세 미만/B1 단계 여아의 molar CARauc/Dauc ratio는 세 이상/B2 및 B3 단계 여아 및 성인여성에서의 molar CARauc/Dauc ratio보다 유의하게 높았다 (모든 통계분석에서 p < 0.05) (도 3).

[표 2]

표 2를 통해 알 수 있는 바와 같이, 아침 기상 후 최초 한 시간 동안 molar CARauc/Dauc ratio를 구한 것으로 사춘기 시작 전인 만 9세 미만의 여아들의 경우 만 9세 이상 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인여성보다 높게 측정되었다.

평균값으로 보았을 때, 만 9세 미만 여아들의 경우 성인여성에 비해 10.7배 만 9세 이상 /B2 및 B3 단계 여아보다는 3.6배 정도 높은 것을 볼 수 있다.

이러한 결과는, 사춘기가 시작되고 진행될수록 DHEA 총분비량은 증가하므로 코티졸 총 분비량 /DHEA 총분비량의 몰 농도 비율이 사춘기가 시작되었는지 여부 및 부신 내분비축의 활성도를 판단할 수 있는 생체지표로서 유용하게 활용될 수 있다는 것을 의미한다.

따라서, 만 9세 미만의 대상 여아에서 CARauc/Dauc 몰 농도 비율이 1 내지 55인 경우 사춘기발달이 이미 시작되었다고 판단할 수 있는 수치적인 기준을 마련하였다.

실시예 3: E2 분비 확인

만 9세 미만/Tanner의 유방 발달 1 단계 (B1) 여아, 만 9세 이상/Tanner의 유방 발달 2 및 3단계 (B2&B3) 여아 및 성인여성에서 E2 분비의 차이를 확인하였다.

만 9세 미만/Tanner의 유방 발달 1 단계 (B1) 여아, 만 9세 이상/Tanner의 유방 발달 2 및 3단계 (B2&B3) 여아 및 정상적인 생리주기를 갖고 있는 여성에 대하여, 아침기상 후 최초 한 시간 동안에 정상적으로 채취된 타액 시료로부터 E2 농도를 분석한 결과를 도 4 및 표 3에 도시하였다.

Two-way ANOVA를 이용하여 분석한 결과, 3개의 집단 간에 그룹효과 (group effect) (F_2,561 =123.2, p < 0.0001 및 타액채취시간의 효과 (collection time effect)(F_{2, 561} =11.38 p < 0.0001)는 유의성을 보였으며, 그룹X 타액 채취시간 상호작용 효과 (group X time interaction effect) (F_{4, 561} =6.2, p = 0.0001) 또한 유의하였다 (도 4A). 이 결과는 3개의 그룹 간에 유의미하게 E2의 수준 (유의한 그룹효과) 및 양상 (그룹 X 타액채취시간 상호 작용 효과)에 차이를 보인다는 것을 의미한다.

만 9세 미만/B1 단계 여아들의 E2 수준은 만 9세 이상/B2 및 B3단계 여아들 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성(adult females) 보다 유의성 있게 낮았고 (모든 통계분석에서 p < 0.05), 만 9세 미만/B1 단계 여아들의 E2 분비의 양상도 만 9세 이상/B2 B3단계 여아들 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성(adult females)과 유의하게 차이가 있었다 (모든 통계분석에서 p < 0.05). 만 9세 이상/B2 및 B3단계 여아의 E2 수준은 성인여성보다 유의성 있게 낮았고(group effect; F_1,447 = 164.2, p < 0.0001), E2의 분비양상 또한 성인여성의 분비양상과 유의하게 차이가 있었다 (interaction effect; F2_,447 = 7.9, p < 0.0004) (도 4A).

도 4B는 만 9세 미만/B1 단계 여아, 만 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아 및 성인여성에서의 Eauci를 상호 비교한 것이다. One-way ANOVA를 이용한 분석결과 상기 3 그룹간의 E2auci에 유의한 차이가 있었으며 (group effect; F_2,187 = 50.8, p < 0.0001), 9세 미만/B1 단계 여아의 E2auci는 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아 및 성인여성의 E2auci보다 유의하게 낮았다 (모든 통계분석에서 p < 0.05) (도 4B).

9세 미만/B1 단계 여아의 평균 E2auci는 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아 및 성인여성의 평균 E2auci에 비해 1/3 및 1/16 수준이었다(도 4B).

[표 3]

상기 표 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 아침 기상 후 최초 한 시간 동안 E2auci를 구한 것으로 사춘기 시작 전인 만 9세 미만의 여아들의 경우 만 9세 이상 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인여성보다 낮게 측정되었다.

이러한 결과는, 사춘기가 시작되고 진행될수록 E2 분비 증가가 나타남을 알 수 있다.

이는 아침 기상 후 시상하부에서 GnRH의 분비가 증가 되어 뇌하수체를 자극하여 난소의 성호르몬 생성 및 분비를 유도함에 의해 나타나는 것으로 생각된다. 따라서, 이는 여아의 시상하부-뇌하수체-난소를 이어지는 생식 내분비축이 성인과 같이 완성되어 있음을 알 수 있다.

또한, 이는 기상 직후의 기저 농도를 기준으로 총 증가량을 구한 것으로 만 9세 미만, 만 9세 이상 및 성인 여성의 기상 후 1시간 동안에는 모두 E2 분비량 자체는 증가 되었음을 알 수 있다.

다만, 만 9세 미만의 여아들의 경우 그 총 증가량이 다른 실험 그룹보다 낮으므로 사춘기가 시작되고 진행될수록 E2auci(E2의 총 증가량)는 증가함을 할 수 있다.

따라서, 만 9세 미만 여아를 대상으로 E2auci의 수치를 통해 사춘기 발달이 진행 중인지 여부, 생식내분비축의 활성도를 판단할 수 있는 생체지표로 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 이는 초경이 시작될 수 있을 만큼의 생식 내분비선이 성숙되었음을 판단할 수 있는 기준을 마련하였다.

실시예 4: P4 분비 확인

만 9세 미만/Tanner의 유방 발달 1 단계 (B1) 여아, 만 9세 이상/Tanner의 유방 발달 2 및 3단계 (B2&B3) 여아 및 성인여성에서 P4 분비의 차이를 확인하였다.

만 9세 미만/Tanner의 유방 발달 1 단계 (B1) 여아, 만 9세 이상/Tanner의 유방 발달 2 및 3단계 (B2&B3) 여아 및 정상적인 생리주기를 갖고 있는 여성에 대하여, 아침기상 후 최초 한 시간 동안에 정상적으로 채취된 타액 시료로부터 P4 농도를 분석한 결과를 도 5 및 표 4에 도시하였다.

Two-way ANOVA를 이용하여 분석한 결과, 3개의 집단 간에 그룹효과 (group effect) (F_2,309=32.1,p < 0.0001 및 타액채취시간의 효과 (collection time effect)(F_2,309=3.76p < 0.02)는 유의성을 보였으나, 그룹X 타액 채취시간 상호작용 효과 (group X time interaction effect) (F_4,309=0.86,p = 0.49)는 유의하지 않았다 (도 5A).

이 결과는 3개의 그룹 간에 유의미하게 P4의 수준 (유의한 그룹효과)차이를 보이나 P4의 분비양상 (그룹 X 타액채취시간 상호 작용 효과)은 차이 없다는 것을 의미한다.

만 9세 미만/B1 단계 여아들의 P4 수준은 만 9세 이상/B2 및 B3단계 여아와 차이가 없었으며 (F₁,₁₃₅=0.00,p = 0.94), 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성(adult females)의 P4 수준은 만 9세 미만/B1 단계 여아 및 만 9세 이상/B2 및 B3단계 여아의 P4 수준보다 유의하게 높았다 (모든 통계분석에서 p < 0.05)(도 5A).

이 결과는 아침기상 이후 P4 분비의 증가 양상은 사춘기 발달과 상관없이 동일하게 나타나며, 성인여성에서 나타나는 P4 수준에 이르러야 비로소 생리 (초경)이 시작될 수 있다는 것을 의미한다.

도 5B는 만 9세 미만/B1 단계 여아, 만 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아 및 성인여성에서의 P4auc를 상호 비교한 것이다. One-way ANOVA를 이용한 분석결과 상기 3 그룹간의 P4auc에 유의한 차이가 있었으며 (group effect; F_2,87=12.1,p < 0.0001), 9세 미만/B1 단계 여아의 P4auc는 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아의 P4auc와 차이가 없었으나 (p > 0.05), 성인여성의 P4auc는 9세 미만/B1 단계 여아의 P4auc 및 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아의 P4auc보다 유의하게 높았다 (모든 통계분석에서 p < 0.0001) (도 5B).

9세 미만/B1 단계 여아 및 9세 이상/B2 및 B3 단계 여아의 평균 P4auc는 성인여성의 평균 P4auc에 비해 5.6배 낮은 수준이었다(도 5B).

[표 4]

상기 표 4 는 아침 기상 후 최초 한 시간 동안 P4auc를 구한 것으로, 상기 표 4에서 보여주는 바와 같이 만 9세 미만의 여아 및 경우 만 9세이상 여아의 P4auc는 정상적인 생리주기를 갖는 성인여성보다 낮게 측정되었다.

이러한 결과는, 사춘기가 시작과 진행에 따라 P4 분비량이 일정하게 증가되지는 않으며, 일정 사춘기 발달단계에 도달한 후에야 비로소 급격한 증가가 나타남을 알 수 있다.

P4는 난소의 E2 생성과정 중 중간단계에 생성되는 호르몬이고, E2 생성이 충분히 완료될 때 비로소 P4의 생성, 분비증가가 나타나므로 위와 같은 결과를 나타내는 것으로 보인다.

따라서, 만 9세 미만 여아를 대상으로 P4auc 수치를 통해 사춘기가 진행중인지 여부, 생식내분비축의 활성도를 판단할 수 있는 생체지표로 유용하게 활용할 수 있다.

또한, 대상 여아에서 성인여성 수준의 P4 분비의 증가는 사춘기의 최종단계인 생리(초경)와 연관되어 있음을 시사한다. 그러므로, 대상여아의 P4auc의 측정을 통해 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙되었는지 여부를 판단할 수 있는 기준을 마련하였다.

Claims

1) 만 9세 미만의 여아로부터 채취한 시료로부터 코티졸, DHEA, E2 및 P4농도를 시간별로 측정하는 단계;
2) 상기 측정된 농도로부터 다음 a), b) 및 d) 중 어느 하나는 반드시 포함하며 다음 a) 내지 d) 중 어느 2 이상의 값을 구하는 단계; 및
a) 시간별 코티졸/DHEA (몰 농도 비율),
b) CARauc/Dauc (몰 농도 비율), 이때, CARauc 및 Dauc는 각각 기상 후 한 시간 동안의 코티졸 총 분비량 및 DHEA 총 분비량을 의미함,
c) E2auci 값: 이때, E2auci는 기상 후 한 시간 동안의 E2 증가량의 총량,
d) P4auc 값; 이때, P4auc는 기상 후 한 시간 동안의 프로제스테론 총 분비량을 의미함
3) 상기 2)단계의 값이 다음에 포함되는 경우 해당 정보를 제공하는 단계;
ⅰ) a)의 값이 1 내지 80인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법
ⅱ) b)의 값이 1 내지 55인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법
ⅲ) c)의 값이 120 내지 1500인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙 되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법
ⅳ) d)의 값이 8 내지 30인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙 되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 시료는 타액, 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 하는 방법.

제2항에 있어서, 상기 시료는 타액인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 시료의 채취는 기상 후 1시간 이내에 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.

제4항에 있어서, 상기 시료의 채취는 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서,
상기 2)단계에서, a)값을 기상 직후, 기상 30분 후, 및 기상 60분 후의 값으로 수득하고;
상기 3)단계에서, 대응되는 a)값이 기상 직후 값이 1 내지 40, 기상 30분 후 값이 1 내지 80, 기상 60분 후 값이 1 내지 59인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.

제6항에 있어서, 상기 3)단계에서,
2)단계의 값이 다음에 포함되는 경우 해당 정보를 제공하는 단계;
a)의 기상 직후 값이 4.7 내지 33, 기상 30분 후 값이 9.2 내지 76, 기상 60분 후 값이 7.2 내지 58.7인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법
ⅱ) b)의 값이 14.9 내지 51.6인 경우 사춘기 발달이 시작되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법
ⅲ) c)의 값이 138 내지 1500인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙 되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법
ⅳ) d)의 값이 9 내지 15인 경우 사춘기 발달이 진행중이고 초경이 시작될 수 있을 만큼 생식 내분비선이 성숙 되었음을 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 방법은 1) 단계 이후,
기상 직후부터 최초 한 시간 동안 시료 내 코티졸의 농도 증가량이 2.5 nmol 미만인 경우 해당 시료를 배제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 시료 내 코티졸, DHEA, E2 및 P4의 농도는 방사선 면역측정법으로 측정된 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 CARauc, Dauc 및 P4auc는 각 시간별 측정된 농도 값을 적분함으로써 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 CARauc/Dauc 몰 농도 비율은 제10항에서 수득한 CARauc 몰 농도를 수득한 Dauc 몰 농도로 나누어 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 E2auci값은 기상 직후 E2 농도를 기준으로 한 시간 동안 증가 된 농도 값을 적분함으로써 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.