WO2015190792A1 - 타액을 이용한 성조숙증 진단 방법 - Google Patents

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WO2015190792A1
WO2015190792A1 PCT/KR2015/005752 KR2015005752W WO2015190792A1 WO 2015190792 A1 WO2015190792 A1 WO 2015190792A1 KR 2015005752 W KR2015005752 W KR 2015005752W WO 2015190792 A1 WO2015190792 A1 WO 2015190792A1
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dhea
saliva
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PCT/KR2015/005752
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Inventor
안련섭
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안련섭
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors

Definitions

  • the present invention relates to the diagnosis of precocious puberty, in particular, in order to provide information necessary for diagnosing precocious puberty, such as a variety of information on the reproductive endocrine environment in the body of the girl and the start time of menarche, measuring a specific hormone in saliva It is about the method of analyzing the concentration change pattern and the criteria for judging.
  • puberty tends to begin early, and the number of children with precocious puberty is on the rise.
  • puberty begins at the age of 11.3 and girls are 12.1 years, and the age of puberty is rapidly declining recently.
  • the average menarche age of girls born after 1990 is 12.0.
  • the average menarge age of girls born in the 1980s at ⁇ 1.0 years tended to be earlier than that at 12.3 ⁇ 0.7 years (Park et al., 2006).
  • Puberty is the time to develop a comprehensive understanding of changes occurring across a range of biological, mental, cognitive, and social areas. Rapidly maturing children must cope with lifestyle and physical changes at an earlier age than their peers before they can be emotionally prepared for biological maturity. Thus, there is limited time to accept and understand physical changes, which may result in fear of rapid development and confused feelings (Mendle et al., 2007), and children and parents experiencing unexpected fast puberty experience anxiety (Pinyerd). And Zipf, 2008). Studies show that girls with early puberty have more difficulty in their relationships with their families and have externalized behavioral problems than their peers, suggesting that precocious puberty is associated with not only the child but also the family environment surrounding them (Tremblay and Frigon). , 2005).
  • Rapid pubertal development has been reported to accelerate skeletal growth, resulting in smaller final kidneys in adults, higher risk of adult disease and genital cancer, and higher risk of metabolic syndromes such as diabetes, obesity, and cardiovascular disease in adults (Golub et al. 2008).
  • girls who had early menarche had higher depression levels and suicide attempts, and depression and anxiety coexisted (Patton et al., 1996; Graber et al., 1997).
  • Children who experienced early pubertal maturity showed anxiety even as adults (Graber). Et al., 2004).
  • the inventors determined that hormone production and secretion of the gonads and adrenal glands are increased according to the pubertal development stage, and that the same neuroendocrine system as the adult female having a normal menstrual cycle is completed before puberty and menarche is started. Determination of pubertal developmental stage and slope of increase of E2 concentration according to total DHEA secretion by analyzing the concentration of dehydroepiandrosterone (DHEA; dehydroepiandrosterone) and estradiol-17 ⁇ (E2) in saliva collected within the first hour after It was confirmed that the degree of maturation of the neuroendocrine system according to the value can be evaluated, and completed the present invention.
  • DHEA dehydroepiandrosterone
  • E2 estradiol-17 ⁇
  • An object of the present invention is to provide a method for diagnosing precocious puberty using the concentration of dehydroepiandrosterone (DHEA; dehydroepiandrosterone) and estradiol (estradiol-17 ⁇ , E2) in saliva and necessary information.
  • DHEA dehydroepiandrosterone
  • estradiol estradiol-17 ⁇ , E2
  • Another object of the present invention is to provide a method for determining whether pubertal development is started by analyzing the secretion amount of DHEA in saliva.
  • Another object of the present invention to provide a method for determining the maturity of the endocrine axis by analyzing the concentration gradient of E2.
  • the present invention provides a method for diagnosing precocious puberty using the concentration of DHEA and E2 measured from saliva collected within the first hour after waking up of the subject girl or a method for providing information necessary for such diagnosis do.
  • the saliva sample suitable for the diagnosis target may be determined by checking the concentration change amount of cortisol.
  • the concentration of cortisol in the saliva when the concentration of cortisol in the saliva is at least 2.5 nmol for the first hour immediately after the weather, it may be an indicator that the saliva was collected immediately after the weather, 30 minutes after the weather, and 60 minutes after the weather.
  • information necessary for diagnosing precocious puberty includes whether the girl is in the early stages of pubertal development, whether the reproductive endocrine gland of the girl is mature or the start of menarche.
  • the total DHEA secretion for the first hour after the gas phase can be obtained by integrating the concentration values measured from the saliva collected immediately after the gas phase, 30 minutes after the gas phase, and 60 minutes after the gas phase.
  • the slope of the concentration increase of E2 is 0.32 or more during the first hour after the wake-up of step (c)
  • the subject girl determines that the reproductive endocrine gland is mature.
  • the E2 concentration increase slope value means the increase rate between immediately after the weather and 30 minutes after the weather.
  • the method may further include the step of obtaining the total amount of E2 during the first 1 hour after waking up in step (c), which can be compared with the case of adult women to predict the start of menarche.
  • (c) information for diagnosing precocious puberty comprising determining that the subject girl is in early stages of puberty development when the total DHEA secretion is greater than 13.63 nmol / L, providing whether the subject girl is in early stages of puberty development Provide a way to.
  • the present invention can provide a variety of information about the reproductive endocrine environment of the girl through the analysis of the concentration of dehydroepiandrosterone (DHEA) and estradiol (E2), the early stage of puberty development of the girl Is useful for diagnosing and utilizing precocious puberty by gathering information about the onset of gestation, the maturity of reproductive endocrine glands, and the timing of menarche.
  • DHEA dehydroepiandrosterone
  • E2 estradiol
  • 1 is a frequency distribution (Frequency distribution) of each puberty stage according to the age of pre-menstrual girls participating in the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of cortisol concentrations analyzed in saliva samples taken 30 minutes and 60 minutes after waking up and saliva samples whose first collection was delayed by 10 minutes or more.
  • FIG. 3 shows the results of analyzing the DHEA concentrations immediately after waking up, 30 minutes after waking up and 60 minutes after waking up for pre-pubertal girls, pre-menstrual girls, and adult women with normal menstrual cycles.
  • Figure 4 is the result of analyzing the E2 concentration immediately after waking up, 30 minutes after and 60 minutes after the pre-pubertal girl, pre-menopausal girls, adult women with normal menstrual cycle.
  • Precocious puberty is the emergence of secondary sexual features more than two standard deviations above the mean, generally in girls with breast development before age 8, pubic development before age 9, and menarche before age 9.5. Refers to cases in which the volume of the testicles increases by more than 4 mL or more than 2.5 cm in diameter before the age of 9. Depending on whether the hypothalamus-pituitary-gonadal axis is activated or not, the central or true precocious puberty and It may be divided into peripheral or pseudoprecocious puberty The present invention is preferably useful for diagnosing true precocious puberty in women.
  • Diagnostic means identifying the presence or activity of a particular pathology or physiological condition, and the like.
  • Subject or “patient” means any single individual in need of treatment, including humans, cattle, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, insects, and the like. Also included are any subjects who participated in clinical research trials showing no disease clinical findings or subjects who participated in epidemiologic studies or who used as controls. In the present invention, humans were targeted.
  • sample or “sample” means a collection of similar cells obtained from a tissue of a subject or patient.
  • Sources of tissue or cell samples may include solid tissue from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue samples or biopsies or aspirates; Blood or any liquid tissue.
  • saliva is used.
  • a steroid hormone is a hormone that has a steroid ring (cyclopentanohydrophenanthrene ring), a 4-membered ring hydrocarbon, as a basic structure. It is a male and female gonad hormone (sex hormone) found in higher animals and humans. ) And corticosteroids.
  • Gonadotropin or sex hormone is a hormone secreted from the gonads of females and males of vertebrates serves to promote the development of the genitals and maintain its function.
  • the gonads that secrete hormones are hepatocytes in the testes in males and the females are mainly follicles or corpus luteum in the ovaries.
  • the adrenal cortex secrete substances with the action of sex hormones.
  • sex hormones are also released from the placenta, contributing to the maintenance of pregnancy. All sex hormones are steroidal substances
  • Physiological or menstrual refers to a physiological phenomenon in which an adult uterine mucosa is released through the vagina with the subsequent bleeding to allow fertilized eggs to implant in the uterus when adult females periodically produce eggs and fertilize them. It usually has a 28-day cycle and lasts 3 to 5 days. However, the frequency can vary between individuals and depending on their health. Most men grow up to about 12 to 15 years of age and begin menstruation for the first time. Women have about 400 menstruation cycles in their lifetimes, and when they are 45 or 55 years old, they become menopause and stop menstruation. Blood flow to menstruation is about 35 ml, within 10 to 80 ml is normal.
  • the "menstrual cycle” refers to the phenomenon in which the uterine mucosa thickened to implant the fertilized egg is discharged through the vagina with bleeding in the absence of the fertilized egg, commonly referred to as "mensturation.” This phenomenon is characterized by a certain period of time (21-35 days), usually about 28 days apart. For 28 days, the ovarian cycle in which the egg grows, ovulates, and corpus luteum is formed, and the uterine mucosa is thickened, the uterine mucosa is maintained, and the uterine cycle is discharged. This phenomenon is continually cycled. For this reason, the term “physiological cycle” is commonly referred to as "a period from the start of physiology to the start of the next period.”
  • label or “label” is meant a compound or composition that directly or indirectly facilitates the detection of a reagent conjugated to, fused, conjugated or fused to a reagent, eg, a nucleic acid probe or antibody.
  • the labeled material can itself be detected (eg, radioisotope labels or fluorescent labels) or, in the case of enzyme labels, can catalyze the chemical modification of the detectable substrate compound or composition.
  • “About” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention relates to a method for diagnosing precocious puberty or to provide information necessary for the same.
  • precocious puberty is defined as a symptom that secondary sexual characteristics appear earlier than the standard deviation of the mean, and includes the onset of puberty in which the functions of the gonadotropia and the hypothalamus-pituitary-gonadal axis are activated to have sexual maturity and fertility. do.
  • Puberty is a transitional period from child to adult. This period is accompanied by the development and growth of secondary sexual characteristics.
  • girls the development of the chest and pubic hair
  • boys the development of the size of the testicles and genitals and the development of the pubic hair are used as external markers of secondary sexual characteristics.
  • Carbide is a physiological phenomenon that occurs in normal adult women, which means that the girl has completed the same neuroendocrine system as the adult woman and has created a system for normal reproductive activity.
  • Diagnosis and / or information necessary for the precocious puberty of the present invention in particular, the early stages of puberty of girls, information about whether the maturation of the reproductive endocrine gland of the girl according to the start of menarche and the like, preferably the start of the menarche, etc. It can be used for prediction.
  • the present invention utilizes certain hormones present in the "saliva".
  • blood is not a hormone's target organ, but a simple hormone carrier.
  • Most blood protein hormones growth hormones, insulin, etc.
  • steroids produced in the adrenal cortex and gonads are insoluble in water and therefore combined with other media (carrier proteins).
  • Is present in the blood When steroids are combined with the carrier, they do not act on the hormone receptors in the target organs, so they are called 'inactive' and cannot induce physiological mechanisms.
  • Most of the steroids in the blood (95-99%) are present in this inactive state and only a fraction (1-4%) are known to be in an unbound state (active state). Therefore, the concentration of steroids in the blood can be said to be the concentration of most inactive rather than the concentration of the hormone in the active state.
  • steroids contained in saliva unlike blood, are not all bound to the carrier medium, and active steroids contained in the extracelluar fluid are salivary glands by passive diffusion. Will be moved to. Therefore, the steroid concentration contained in saliva is recognized as an active steroid contained in the tissue.
  • saliva unlike blood, can be easily collected by the general public in accordance with the individual's sleep cycle without the help of medical personnel, so it has the advantage of easily conducting research on the hormonal circadian rhythm of the individual. In other words, using saliva has the advantage of easy access to the concentration of active steroids and the hormonal circadian rhythms, which were difficult to access to blood.
  • the present invention can measure the concentration of the hormones present in saliva, can exert the above advantages as an effect.
  • the saliva used in the present invention is preferably collected at least three times over 30 minutes after the gas phase and 60 minutes after the gas phase.
  • the present invention is characterized by using the concentration of dehydroepiandrosterone (DHEA) and "estraiol-17 ⁇ , E2" present in the saliva for the diagnosis of precocious puberty.
  • DHEA dehydroepiandrosterone
  • E2 estraiol-17 ⁇ , E2
  • DHEA is a relatively weak androgen steroid that is an intermediate step in the synthesis of male and female hormones. DHEA is primarily secreted in the adrenal cortex but is known to synthesize small amounts in the gonad, adipose tissue and brain. In humans, about 4 mg of DHEA per day and about 25 mg of DHEA-s, the sulfated form, are the most steroids in the blood.
  • DHEA The function of DHEA is not yet fully understood, but it can be divided into several mechanisms of action. First, it functions as a precursor of sex hormones and is converted into male or female hormones in necessary tissues (Labrie et al., 1998). Second, the central nervous system acts as a neuroactivating steroid to regulate nerve stimulation through interaction with several neurotransmitters (Park-Chung et al., 1999), and third, to buffer the role of cortisol in stress (Kimonides). Et al., 1999), and fourth, to activate the calcium gated potassium channel (Farrukh et al., 1998).
  • E2 is a hormone produced and secreted by the gonads (ovaries). In particular, it is known as a hormone involved in the development of the mammary gland, thickening of the endometrium and inducing the growth of ovarian eggs. In particular, E2 is the final product of the steroid production of ovaries and serves as a regulator of egg growth and uterine thickening.
  • E2 In women with normal menstrual cycles, the production and secretion of E2 also has a regular circadian rhythm, with an increase of about 150-200% in the first hour after morning. Changes in E2 concentration after morning phases vary according to period, follicle, and ovulatory phase, and postmenopausal women have not been shown to increase E2 levels after morning phase (Ahn et al., 2012).
  • estradiol is beta-estradiol.
  • Beta estradiol abbreviated as E2
  • E2 is a type of estrogen, a steroid hormone secreted from the ovaries of females of vertebrates, and is one of the follicle hormones extracted and crystallized from the ovary and placenta.
  • Female gonads develop to show secondary and tertiary features, especially in mammals, causing estrus.
  • beta estradiol is a highly variable reproductive hormone in a woman's body that counteracts the caffeine-like action, adenosine's original inhibitory effect, that women experience during the menstrual cycle, just before ovulation, shortly before ovulation. It is known to cause a mild excitement.
  • Cortisol is a steroid hormone secreted by the adrenal cortex.
  • the daily rhythm of the adrenal glands is known to be controlled by the cranial nerves, hypothalamus, and pituitary and is essentially determined by the individual sleep cycles. After a normal night's sleep, waking up in the morning, the brain's nerves wake up, and this signal reaches the hypothalamus of the suprachiasmatic nucleus (SCN), and in the intersecting nucleus, the bioclock gene (bioclock). The gene is activated and this signal is transmitted back to the paraventricular nucleus (PVN).
  • SCN suprachiasmatic nucleus
  • bioclock bioclock gene
  • corticotropin releasing hormone CH
  • secreted secretory hormone stimulates the pituitary gland to produce and secrete adrenocorticotrophic hormone (ACTH) do.
  • the levels of corticosteroids produced and secreted by the pituitary gland peak at 15 minutes after waking up.
  • Corticosteroids secreted in the blood act on the adrenal glands and increase the production of cortisol in the adrenal cortex.
  • the peak cortisol concentration is about 30 minutes after waking up and the cortisol concentration is the highest during the day.
  • a phenomenon in which cortisol concentration reaches a normal level in about 30 minutes after waking up in the morning is called a cortisol awakening response (hereinafter referred to as CAR).
  • CAR is not affected by the general sleeping environment, light, the phenomenon of waking during sleep time, and is known to be affected by health conditions. However, if the saliva sampling was delayed more than 10 minutes immediately after the weather, the CAR phenomenon did not appear.
  • DHEA and E2 concentrations in saliva when the change in the concentration of cortisol in saliva is more than 2.5 nmol for the first hour immediately after morning waking up.
  • the change in the concentration of cortisol in the saliva for the first hour immediately after the morning wake-up may be performed on saliva collected at 30 minutes and 60 minutes after the wake-up phase, respectively.
  • the present invention relates to a method of diagnosing precocious puberty in a girl using dehydroepiandrosterone (DHEA) and estradiol (estradiol-17 ⁇ , E2) in saliva, and to provide the necessary information.
  • DHEA dehydroepiandrosterone
  • estradiol estradiol-17 ⁇ , E2
  • the sample used for diagnosing precocious puberty of the present invention is the saliva collected at the prescribed time, and it is most preferable to use the saliva collected immediately after the morning phase (right after waking up), 30 minutes in the gas phase, and 60 minutes in the gas phase.
  • saliva in which the concentration of cortisol increases by at least 2.5 nmol or more during the first hour immediately after the morning weather.
  • Cortisol concentrations have been reported to increase by 50-150% after breakfast in normal adult men and women, and are known to increase at least 2.5 nmol from 30 minutes after wake up. However, it is reported that this cortisol increase cannot be observed when the first saliva sample is delayed for more than 10 minutes immediately after the morning weather in normal men and women.
  • the present invention is characterized by quantitative analysis of DHEA and E2 using saliva collected 30, 60 minutes after the gas phase immediately after the morning.
  • Saliva collected after a delay of more than 10 minutes after waking up can not see the increase in cortisol concentration, and in addition, the quantitative analysis of other steroid hormones DHEA or E2 is not meaningful in these samples, these samples should be excluded from the test of the present invention do.
  • the method of the present invention may further comprise measuring the change in concentration of cortisol to confirm whether the prepared saliva is suitable for analysis. This is to check whether saliva was collected at the correct time by changing the concentration of cortisol after the morning phase, and it is recommended to use saliva when the concentration increase of cortisol is at least 2.5 nmol for the first hour immediately after morning weather. desirable.
  • the concentration of DHEA and E2 is measured in each saliva collected immediately after the morning phase, 30, 60 minutes after the gas phase, and the concentration change is observed.
  • various methods may be used to measure cortisol, DHEA, and E2 concentrations.
  • radioimmunoassay there is no limitation, but preferably, radioimmunoassay can be used.
  • enzyme immunoassay EIA
  • CIA chemiluminescence immunoassay
  • ABEI aminobutyl-ethylisoluminol
  • FIA fluorescent label Fluorescence immunoassay
  • Radioimmunoassays have many advantages, such as high sensitivity, precision, and accuracy, and allow for clear and clear detection after the reaction. Most preferably, radioimmunoassays can be used.
  • a liquid-phased-double antibody method can be used. Since steroid concentrations in saliva are very low, such as 1 / 100-1 / 1000 of blood, highly sensitive assay systems are required to measure the small amount of hormones in saliva. These liquid-dual antibodies (liquid-phased-double antibody) method may be useful. More detailed measurement procedure is available in the paper on the measurement of hormones using the liquid-dual antibody method.
  • iodine 125 ( 125 A liquid-phased-double antibody using an antigen labeled with I) and a secondary antibody was used.
  • the concentration of cortisol, DHEA, and E2 was measured in each saliva collected immediately after the morning, 30 minutes after the gas phase, and 60 minutes, and the increase in the concentration of cortisol was at least 2.5 nmol for the first hour immediately after the morning weather.
  • change in concentrations of DHEA and E2 is analyzed.
  • the total amount of DHEA secreted during the first hour after the morning phase by integrating the DHEA concentration measured in each saliva taken immediately after the morning phase, 30 minutes after the gas phase, and 60 minutes is preferably at least about 13.63 nmol / L, preferably In the range of 13.63 to 41.34 nmol / L, the subject is considered to be in the early stages of puberty development.
  • the increase rate between the E2 concentration increase slope value immediately after the gas phase and 30 minutes after the gas phase it is preferable to use the increase rate between the E2 concentration increase slope value immediately after the gas phase and 30 minutes after the gas phase.
  • the slope of the increase in E2 concentration measured in saliva collected immediately after the morning phase is 0.32 or more, preferably in the range of 0.32 to 0.47, it is determined that the reproductive endocrine axis of the subject girl is mature like an adult.
  • the method may further include obtaining a total secretion amount of E2 during the first hour after waking, which may be compared to that of adult women to predict when to begin menarche.
  • the slope of the menarche by indicating whether the reproductive endocrine axis leading to the hypothalamus-pituitary-ovary in adolescent girls who have not started menstruation is mature, like adult women, using the gradient of increasing concentration of E2 and the total amount of secretion. make it predictable.
  • the present invention is a preferred embodiment
  • (c) diagnosing precocious puberty, or the information required for the maturation of the reproductive endocrine gland comprising the step of determining that the female endocrine gland is mature when the gradient of increasing concentration of E2 is greater than or equal to 0.32. to provide.
  • the present invention analyzes the increase in DHEA concentration and the change in E2 secretion using DHEA and E2, thereby providing a variety of information on the reproductive endocrine environment of the girl and thus the information necessary for diagnosing precocious puberty.
  • it will be very useful for collecting and using information on the prediction of the early stages of puberty development, the maturity of reproductive endocrine glands and the beginning of menarche.
  • the present invention can facilitate the medical access to premature premature ejaculation or full premature ejaculation, and may be sufficiently used for preliminary examination and prognosis for premature ejaculation and premature ejaculation that may appear.
  • BMI abnormal body mass index
  • the selected subjects were distributed or delivered a pack containing three saliva collection tubes, a description of saliva collection, a self-assessment question, a description of determining the Tanner stage, and a consent form.
  • 233 female parents and 136 adult females each sent informed assent and consen. All participating girls were born in Korea and raised at home with their birth parents. This study was approved by the Institutional Review Board of CHA University Gangnam Hospital and was conducted in accordance with the ethical recommendations.
  • Cortisol ratios for DHEA at 30 minutes after waking show daily changes with stabilization times in the working subjects from Thursday to Saturday, so participants are given immediate time on Thursday or Friday and at 30 and 60 minutes after wake up. They were required to take their saliva samples with a minimum volume of 1.5 mL of saliva provided by. They were asked not to change their sleep-wake cycles. Participants were to collect saliva samples at scheduled times (less than 5 minutes after waking up, 25 to 35 minutes and 55 to 65 minutes after waking up) and placed in the marking area of the collection tube (Simport Inc., QC, Canada), respectively. Instructed to take note of the collection time. Saliva was sampled simply by spitting saliva into the muscle movement and collection tubes without external stimulation. Adult women were not required to drink alcohol the night before.
  • a typical CAR is defined as an at least 2.5 nmol / L increase in cortisol level above the individual's baseline in the compliant subject.
  • withdrawal of the first sample after a delay of at least 10 minutes following the onset showed no increase in cortisol after which, in some subjects, no typical CAR was observed.
  • the collected sample was stored at -70 ° C after the debris was removed.
  • samples were thawed and centrifuged (10,000 g, 15 min, 4 ° C). Supernatants were harvested and stored at -70 ° C until the test was performed. All saliva samples were analyzed at the Hormone Research Center at Chonnam National University.
  • Iodide cortisol and E2 were obtained from the organ (Budapest, Hungary).
  • Iodine-125-labeled DHEA DHEA-7- (O-carboxymethyl) oximino- (2- [ 125 I] iodohistamine) was prepared by modifying the protocol for radiosteroids described previously. (NY, USA) and E2 antiserum were from Meridian Life Science, Inc. (ME, USA).
  • Cortisol antiserum may be cortisone, 11-deoxycortisol, prednisolone, cortisol-21-glucosiduronate, cortisol-21-sulfate. -sulphate), and cross-react with other steroids at cross-reaction levels of 1.0%, 8.9%, 31.6%, 1.3%, less than 0.01%, and less than 0.01%, respectively.
  • DHEA antiserum cross reacts with androstenedione, epiandrosterone, dihydrotestosterone, and other steroids at cross-reactivity levels of less than 0.4%, 0.2%, 1.3%, and 0.01%, respectively do.
  • E2 antiserum cross reacts with estriol, estrone, dihydrotestosterone, and other steroids at cross reaction levels of less than 0.09%, 0.5%, and 0.01%, respectively.
  • the inter-assay coefficients of variation (CV) evaluated from quality control using mean cortisol concentrations of 3.6 and 10.9 nmol / L were 7.4% and 8.5%, respectively (n 26).
  • the detection sensitivity for cortisol was 0.4 nmol / L.
  • the sensitivity of detection for DHEA was 0.7 pmol / L.
  • Inter-assay CVs assessed from quality control using mean E2 concentrations of 18.4 and 183.6 pmol / L were 11.5% and 13.2%, respectively (n 26).
  • the detection sensitivity for E2 was 3.7 pmol / L.
  • Saliva samples from 14 girls corresponding to B1PH1 contained an E2 concentration below the detection limit (1.8 pmol / L).
  • Auxiliary indices were applied to analyze steroid secretion activity during post-awakening.
  • Total cortisol, DHEA, and E2 secretions during the post-wake phase after determination of cortisol, DHEA, and E2 concentrations were grounded using GraphPad Prism version 5.00 for Windows (GraphPad Software, CA, USA) from the immediate point in time until 60 minutes after Area under the curve (AUC) (Carauc. DHEAauc, and E2auc, respectively).
  • cortisol level CARi
  • beta E2Inc slope
  • Reference Example 1 pubertal development stage of girls who have not started menarche
  • Example 1 Change in the concentration of cortisol as the saliva collection time standard
  • cortisol concentrations have been reported to increase by 50-150% after morning, which is known to increase by at least 2.5 nmol from just after the wake up to 30 minutes after the wake up.
  • cortisol increase after waking cannot be observed.
  • Quantitative analysis of additional steroids, such as DHEA or E2 in these samples is meaningless and must be excluded from the hormonal response test in the morning.
  • Example 2 secreted for the first hour after morning weather DHEA Identify the stage of puberty development by total amount
  • the total amount of DHEA secreted during the first hour after the morning phase of stage B1PH1, B2PH1 and adult women (area under the curve, AUC) is shown in FIG. 3B and Table 1 below.
  • Example 3 secreted for the first hour after morning weather E2 Confirm maturity of reproductive endocrine with increasing slope
  • the present invention measures the concentrations of cortisol, DHEA, and E2 from saliva and quantifies the percentage of total morning secretion of DHEA and the percentage of the gradient of E2 increase, thereby simplifying and objectively initiating the onset of puberty and reproductive endocrine axis in girls. As a result, it can be very useful for diagnosing precocious puberty and predicting the beginning of menarche in girls.
  • the present invention can provide a variety of information on the reproductive endocrine environment of the girl through the analysis of the concentration of dehydroepiandrosterone (DHEA) and estradiol (E2), the early stages of puberty development Is useful for diagnosing and utilizing precocious puberty by gathering information about the onset of gestation, the maturity of reproductive endocrine glands, and the timing of menarche.
  • DHEA dehydroepiandrosterone
  • E2 estradiol

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Abstract

본 발명은 성조숙증 진단에 관한 것으로, 특히, 여아의 체내 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보 및 초경 시작 시기에 대한 정보 등의 성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 타액 내 특정 특정 호르몬인 코티졸, 디히드로안드로스테런 (dihydroandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올 (estraiol-17b, E2)의 농도를 측정하여 이들의 농도 변화 양상을 분석하는 방법 및 판단하는 기준에 대한 것이다.

Description

타액을 이용한 성조숙증 진단 방법
본 발명은 성조숙증 진단에 관한 것으로, 특히, 여아의 체내 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보 및 초경 시작 시기에 대한 정보 등의 성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 타액 내 특정 호르몬을 측정하여 이들의 농도 변화 양상을 분석하는 방법 및 판단하는 기준에 대한 것이다.
최근 생활수준이 향상됨에 따라 사춘기가 빨리 시작되는 경향을 보이고 있으며, 성조숙증이 있는 소아의 수도 증가하는 추세에 있다.
건강보험심사평가원(Health Insurance Review & Assessment Service [HIRA], 2011)에 따르면 성조숙증 진료인원은 2006년 6천 4백명에서 2010년 2만 8천명으로 5년간 약 4.4배 증가하였고 이에 따라 진료비도 2006년 23억원에서 2010년 179억원으로 5년간 7.8배 증가하였다. 그러므로 아동의 성장 발달 문제 뿐 아니라 급격한 질병발생의 증가율과 국가 경제적 차원을 고려할 때 성조숙증을 앓고 있는 아동과 그 가족에 대해 관심을 가져야 할 것으로 사료된다.
실제로 유방발육이 시작되면서 사춘기가 시작되는 연령이 여아는 11.3세, 남아는 12.1세로 최근 급속히 사춘기 시작 연령이 낮아지고 있으며, 1990년 이후에 출생한 초, 중, 고등학생인 여아의 평균 초경 연령이 12.0±1.0세로 1980년대 출생한 여아의 평균 초경연령 12.3±0.7세에 비해 초경이 조기화 되는 경향을 보였다(Park 등, 2006).
사춘기는 생물학적, 정신적, 인지적, 사회적 다양한 영역에 걸쳐서 발생하는 변화를 통합적으로 이해해야 하는 시기로 성장 발달상 가장 극적인 변화를 나타내는 시기이기도 하다. 빠르게 성숙하는 아동은 생물학적 성숙에 정서적으로 준비도 하기 전에 또래보다 이른 나이에 생활방식과 신체 변화에 대처해야 한다. 그러므로 신체 변화를 수용하고 이해할 시간이 제한되어 빠른 발달에 대한 두려움과 혼돈스러운 감정을 느낄 수 있으며(Mendle 등, 2007), 예상치 않았던 빠른 사춘기를 경험하는 아동과 그 부모는 불안을 경험하게 된다(Pinyerd 와 Zipf, 2008). 사춘기가 빠른 여아가 또래보다 가족과의 관계에서 어려움이 더 많고 외현화된 행동문제를 나타낸다는 연구결과는 성조숙증이 아동 자신 뿐 아니라 그들을 둘러싼 가족환경과도 관련이 있음을 시사하고 있다(Tremblay와 Frigon, 2005).
이로 인해 키, 외모, 사춘기 신체 변화에 예민한 부모들은 성조숙증에 대한 근심 뿐 아니라 성조숙증으로 인해 신체적, 심리적 문제가 발생할 수 있다고 생각하여 호르몬 치료를 요구하는 경우가 점차 증가하고 있다(Kim 등, 2009).
빠른 사춘기 발달은 골격 성장을 가속화하여 성인이 되었을 때 최종 신장이 작고 성인질병과 생식기계 암의 위험이 높으며 성인기에 당뇨, 비만, 심혈관계 질환 같은 대사증후군의 위험이 높은 것으로 보고되고 있다(Golub 등, 2008). 또한 초경이 늦은 여아보다 빠른 여아가 우울수준과 자살시도가 높았고 우울과 불안이 공존하였으며(Patton 등, 1996; Graber 등, 1997) 이른 사춘기 성숙을 경험한 아동은 성인이 되어서도 불안을 나타내었다(Graber 등, 2004).
게다가 빠른 사춘기 성숙은 섭식장애, 담배나 알코올 등의 물질남용, 비행, 부정적 신체상, 위험한 성 행위, 잠재적인 성적 학대 위험, 유산, 또래관계의 어려움, 학업성취 및 자존감 저하, 우울, 불안 등의 부정적인 결과들과 연관이 있었다(Tremblay와 Frigon, 2005; Mendle 등, 2007; Golub 등, 2008; Roh와 Kim, 2012).
그러므로 이른 사춘기로 인해 초래될 수 있는 부정적인 결과들을 예방하기 위해서는 이러한 성조숙증을 정확하게 진단할 수 있는 기준이 마련되어야 할 필요성이 있다.
이에 본 발명자는, 사춘기 발달단계에 따라 생식소 및 부신의 호르몬 생성 및 분비가 증가되고, 여아에서 정상적인 생리 주기를 갖는 성인 여성과 동일한 신경 내분비계가 사춘기 이전에 완성되어 초경이 시작되는 것으로 판단하고, 기상 후 최초 1시간 이내에 채취한 타액 내의 데히드로에피안드로스테론(DHEA; dehydroepiandrosterone) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 분석함으로써, DHEA 총 분비량에 따른 사춘기 발달 단계의 평가 및 E2 농도 증가 기울기값에 따른 신경 내분비계의 성숙 정도를 평가할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 타액 내 데히드로에피안드로스테론(DHEA; dehydroepiandrosterone) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 이용하여 성조숙증을 진단하는 방법 및 이에 필요한 정보를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 타액 내 DHEA의 분비량을 분석하여 사춘기 발달 시작 여부에 대한 판단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 E2의 농도 기울기값을 분석하여 생식내분비 축의 성숙도에 대한 판단 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 대상 여아의 기상 후 최초 1시간 이내에 채취한 타액으로부터 측정한 DHEA 및 E2의 농도를 이용하여 성조숙증을 진단하는 방법 또는 이러한 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
바람직한 일 구체예로서,
(a) 대상 여아의 기상 후 최초 1시간 이내에 채취한 타액으로부터 DHEA 및 E2의 농도를 측정하는 단계
(b) 상기 측정된 DHEA 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량을 구하는 단계;
(c) 상기 측정된 E2 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값을 구하는 단계를 포함하는, 성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이 때, 진단의 정확성을 높이기 위해, 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 것을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 코티졸의 농도 변화량 확인을 통해 진단 대상에 적합한 타액 시료를 결정할 수 있다.
특히, 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 경우는 타액을 정확히 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 것임을 확인할 수 있는 지표가 될 수 있다.
한편, 본 발명에서 유용하게 수득할 수 있는 성조숙증 진단에 필요한 정보는 여아의 사춘기 발달 초기 단계인지 여부, 여아의 생식 내분비선의 성숙 여부 또는 초경 시작 시기 예측을 포함한다.
그 중에서, (b)단계의 기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량이 13.63 nmol/L 이상인 경우에 대상 여아는 사춘기 발달의 초기 단계에 있다고 판단된다. 이 때, 기상 후 최초 1시간 동안의 총 DHEA 분비량은 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 측정한 농도값을 적분함으로써 수득할 수 있다.
또한, (c) 단계의 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값이 0.32 이상인 경우에 대상 여아는 생식 내분비선이 성숙되었다고 판단한다. 이 때, 상기 E2 농도 증가 기울기값은 기상 직후 및 기상 후 30분 사이의 증가율을 의미한다.
이 때, 상기 방법은 (c) 단계에서 추가로 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 총 분비량 구하는 단계를 포함할 수 있고, 이를 성인 여성의 경우와 비교하여 초경 시작 시기를 예측할 수 있다.
본 발명은 다른 구체예로서,
(a) 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 DHEA 농도를 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 DHEA 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량을 구하는 단계; 및
(c) 상기 총 DHEA 분비량이 13.63 nmol/L 이상인 경우에 대상 여아는 사춘기 발달의 초기 단계에 있다고 판단하는 단계를 포함하는, 성조숙증 진단에 필요한 정보로서, 대상 여아가 사춘기 발달 초기 단계인지 여부를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 구체예로서,
(a) 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 E2 농도를 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 E2 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값을 구하는 단계; 및
(c) E2의 농도 증가 기울기값이 0.32 이상인 경우에 대상 여아는 생식 내분비선이 성숙되었다고 판단하는 단계를 포함하는, 성조숙증 진단에 필요한 정보로서, 대상 여아의 생식 내분비선의 성숙 여부를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 데히드로에피안드로스테론(DHEA; dehydroepiandrosterone) 및 에스트라디올(estradiol, E2)의 농도 분석을 통하여 여아의 체내 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보를 제공할 수 있는 바, 여아의 사춘기 발달 초기 단계의 시작 여부, 여아의 생식 내분비선의 성숙도 및 초경 시작 시기에 대한 예측에 관한 정보 수집에 따른 성조숙증 진단 및 활용에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명 실시에 참가한 초경 전 여아들의 나이에 따른 각 사춘기 단계의 도수분포(Frequency distribution)이다.
도 2는 아침기상 직후, 기상 후 30분, 60분 후에 채취된 타액 시료 및 첫 채취가 10분 이상 지연된 타액 시료에서 분석한 코티졸 농도 변화를 나타낸 결과이다.
도 3은 사춘기 전 여아, 초경 전 사춘기 발달 단계의 여아, 정상적 생리 주기를 가지고 있는 성인여성에 대한 기상 직후, 기상 30분 후 및 60분 후의 DHEA 농도를 분석한 결과이다.
도 4는 사춘기 전 여아, 초경 전 사춘기 발달 단계의 여아, 정상적 생리 주기를 가지고 있는 성인여성에 대한 기상 직후, 기상 30분 후 및 60분 후의 E2 농도를 분석한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"성조숙증(precocious puberty)이란 평균치보다 2표준편차 이상 2차 성징의 출현이 빠른 경우인데, 일반적으로 여아에서 8세 이전 유방 발달, 9세 이전 음모 발달, 9.5세 전 초경이 생기는 경우를 말하며, 남아에서는 9세 이전에 고환의 용적이 4 mL 이상 또는 직경이 2.5 cm 이상으로 증가하는 경우를 말한다. 시상하부-뇌하수체-생식샘 축 활성화의 유무에 따라서 중추성 또는 진성 성조숙증(central or true precocious puberty)과 말초성 또는 가성 성조숙증(peripheral or pseudoprecocious puberty)으로 나눌 수 있다. 본 발명은 바람직하게는 여자의 진성 성조숙증 진단에 유용하다.
"진단"은 특정 병리 또는 생리 상태의 존재 또는 활성 등을 확인하는 것을 의미한다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명에서는 인간을 대상으로 하였다.
"시료" 또는 "샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 액형 조직일 수 있다. 본 발명에서는 타액(saliva)을 사용한다.
"스테로이드호르몬(steroid hormone)"이란 4원자고리 탄화수소인 스테로이드 고리(사이클로펜타노하이드로페난트렌 고리)를 기본 구조로 가진 호르몬으로, 고등동물이나 사람에게서 볼 수 있는 웅성·자성의 생식선 호르몬(성호르몬)이나 부신피질 호르몬 등이 포함된다.
"생식선 호르몬 또는 성호르몬"이란 척추동물의 암컷·수컷의 생식선에서 분비되는 호르몬으로 생식기의 발육을 촉진시키고 그 기능을 유지시키는 역할을 한다. 호르몬을 분비하는 생식선은 웅성의 경우는 정소 중의 간세포(間細胞)이고 자성은 주로 난소(卵巢) 중의 여포나 황체이다. 생식선뿐만 아니라 부신피질로부터도 성호르몬의 작용을 갖는 물질이 분비된다. 또, 임신 중에는 태반으로부터도 성호르몬이 분비되어 임신유지에 기여한다. 성호르몬은 모두 스테로이드계 물질이다
"생리 또는 월경"은 인간의 성인 여성이 주기적으로 난소에서 난자를 만들어 내고 수정되었을 경우 수정란이 자궁에 착상하게 하기 위한 자궁점막이 이후 출혈과 함께 질을 통해 배출되는 생리 현상을 말한다. 보통 28일 정도의 주기를 가지며 3~5일 정도 지속된다. 하지만 개인별로 또한 건강 상태에 따라 주기가 차이가 날 수 있다. 대개 12~15세 정도로 성장하게 되면 처음 월경을 시작하게 되며, 여성은 일생동안 약 400회의 월경을 하게 되고 이후 45~55세가 되면 폐경기가 되어 월경을 멈추게 된다. 월경으로 흘리는 피는 약 35 ml이며 10~80 ml 이내는 정상이다.
"생리주기(menstrual cycle)"란 수정란이 착상되도록 비후된 자궁점막이 수정란이 없는 경우 출혈과 함께 질을 통해 배출되는 현상을 통상적으로 “생리 (mensturation)”라 한다. 이 현상은 일정한 기간 (21~35일)을 가지고 나타는 특징이 있으며 대개 약 28일의 간격으로 나타난다. 28일 동안 난자의 성장, 배란, 황체형성이 이뤄지는 난소주기와 자궁점막의 비후, 비후된 자궁점막의 유지, 자궁점막의 배출이뤄지는 자궁주기가 동조되어 이뤄지고 이 현상은 연속성을 가지고 반복 (cycle)되기 때문에 통상적으로 "생리가 시작되는 날부터 다음 생리 시작일 까지 기간“을 “생리주기”라 한다.
"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지된 물질은 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 성조숙증 진단 방법 또는 이에 필요한 정보를 제공하는 것에 관한 것이다.
본 발명에서 "성조숙증"은 2차 성징이 평균치의 2표준편차보다 빨리 나타나는 증상으로 정의되며, 성적 성숙 및 수정 능력을 갖추기 위해 성선 및 시상하부-뇌하수체-성선 축의 기능이 활성화되는 사춘기의 시작을 포함한다.
사춘기는 어린이에서 어른이되는 전이 (transition) 시기이다. 이 시기에는 2차 성징의 발달 및 성장이 동반된다. 여아에서는 가슴 및 음모 (pubic hair)의 발달 남아에서는 고환 및 생식기의 크기 발달 및 음모의 발달이 2차 성징의 외현 마커로 이용된다.
여아의 경우 가슴 및 음모의 발달 단계를 각각 5단계로 나눌 수 있고 넓게는 사춘기 이전단계, 초기, 중기, 말기, 성인단계로 나눌 수 있으며 한국인 여아의 경우 가슴발달이 11.3 ± 1.3세, 음모발달이 12.3 ± 1.2세에 시작되고, 초경은 12.0 ± 1.0세에 시작되는 것으로 보고되어 있다. 성 성숙 특히, 초경율은 유방발달 2단계에서 18.2%, 3단계에서 66.1%, 4단계에서 91.7%, 5단계에 서 100% 로 알려져 있고, 음모발달 2단계에서 52%, 음모발달 3단계에서 93.8%로 보고 되어있다. 이러한 결과는 가슴발달 및 음모 발달이 초경의 시작과 밀접히 연관은 되어 있으나 2차 성징의 외현마커만으로는 초경의 시작을 쉽게 예측할 수 없다는 것을 시사한다.
초경은 정상적인 성인여성에서 나타나는 생리현상이며 여아에서 성인 여성과 동일한 체내의 신경내분계가 완성되었고 정상적인 생식활동을 할 수 있는 체내환경이 조성되었다는 것을 의미한다.
여아의 가슴 및 음모발달은 생식소 및 부신의 호르몬 생성증가와 연관되어 있다. 사춘기의 시작과 함께 생식소 (난소)의 성호르몬 생성증가가 나타나는 현상을 "성선호르몬분비(gonadarche)" 부신에서 DHEA 생성이 증가하는 현상을 “부신피질기능항진(adrenarche)"이라 불리우며 성호르몬의 생성증가는 여아의 경우 가슴발달 (thelache)을 유도하며 DHEA의 증가는 음모의 발달 (pubarache)을 유도하는 것으로 알려져 있다.
그러나 어느 요인에 의하여 성선호르몬 분비(gonadarche) 및 부신피질기능항진(adrenarche)이 시작되는지에 대해서는 알려져 있지 않다. 1980년 Wildt등은 GnRH 유도체를 어린 원숭이에 간헐적으로 주사할 경우 성조숙을 유도할 수 있고 사춘기의 시작이 뇌하수체 및 난소 발달에 의존하기보다는 시상하부의 신경세포에서 GnRH가 방출에 의존한다는 사실을 Science에 발표하였다(Wildt 등, 1980). 이는 시상하부의 GnRH 신경세포에 저해요인들이 작용하여 GnRH의 방출을 억제하고 있으며 그 억제요인이 제거되면서 시상하부-뇌하수체-생식소로 이어지는 생식내분비축이 활성화되고 그 축에서 생성,분비되는 성 호르몬에 의하여 2차 성징의 발달 및 초경이 유도되는 것으로 해석되어 진다.
본 발명의 성조숙증 진단 및/또는 이에 필요한 정보는, 특히, 여아의 사춘기 초기 단계, 여아의 생식 내분비선의 성숙 여부 이에 따른 초경 시작 시기에 대한 정보 등을 포함하고, 바람직하게는 여아의 초경 시작 시기 등의 예측에 활용할 수 있다.
타액이용
본 발명은 "타액(saliva)" 내 존재하는 특정 호르몬들을 이용한다.
지금까지 호르몬의 농도는 혈액에서 주로 측정하였다. 내분비학 관점에서 보면 혈액은 호르몬의 표적기관이 아니라 단순한 호르몬의 이동매체이다. 대부분의 혈중 단백질계열 호르몬 (성장호르몬, 인슐린 등)은 물에 잘 용해되며 혈중에서는 활성화된 형태로 존재하지만 부신피질, 성선에서 생성되는 스테로이드는 물에 잘 녹지 않기 때문에 다른 매체 (운반단백질)와 결합하여 혈중에 존재한다. 스테로이드가 운반매체와 결합되어 있을 때는 표적기관의 호르몬 수용체에 작용하지 못하기 때문에 '불활성 상태'라 하며 생리적인 기작을 유도할 수 없다. 혈중 스테로이드 대부분(95-99%)은 이러한 불활성 상태로 존재하며 극히 일부 (1-4%)만 운반매체와 결합되어있지 않은 상태(활성상태)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈중 스테로이드의 농도는 활성 상태의 호르몬의 농도라기보다는 대부분 불활성 상태의 농도라 할 수 있다.
이에 반하여, 타액에 포함되어 있는 스테로이드는 혈액과 달리 모두 운반매체와 결합되어 있지 않은 활성 상태이며 세포외액(extracelluar fluid)에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드가 단순 확산방식(passive diffusion)에 의해 타액샘으로 이동한 것 이다. 따라서 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 조직 안에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드로 인식되고 있다.
또한, 타액은 혈액과 달리 의료진의 도움 없이도 개인의 수면주기에 맞추어 일반인이 쉽게 채취할 수 있기 때문에 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 연구를 쉽게 진행할 수 있는 장점을 가지고 있다. 즉, 타액을 이용할 경우 혈액으로 접근이 어려웠던 활성상태의 스테로이드의 농도와 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 접근이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명은 타액 내 존재하는 호르몬들의 농도를 측정하는 바, 상기와 같은 장점을 효과로 발휘할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 타액은 적어도 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분의 3번에 걸쳐서 채취하여 사용하는 것이 바람직하다.
대상 호르몬
본 발명은 성조숙증 진단을 위해, 상기 타액 내 존재하는 데히드로에피안드로스테론(DHEA; dehydroepiandrosterone) 및 "에스트라디올 (estraiol-17β, E2)"의 농도를 이용하는 것을 특징으로 한다.
"DHEA"는 비교적 약한 안드로겐 스테로이드로 남성호르몬과 여성호르몬 합성에 필요한 중간단계 물질이다. DHEA는 주로 부신 피질에서 분비되지만 성선(gonad), 지방조직 그리고 뇌에서도 소량이 합성되는 것으로 알려져 있다. 사람의 경우 하루에 DHEA가 약 4 mg 그리고 황산화 형태인 DHEA-s는 약 25 mg 분비되어 혈액 내에서 가장 많은 스테로이드이다.
DHEA의 기능은 아직도 완전히 밝혀지지는 않았지만 작용 기전을 몇 가지로 나누어 생각할 수 있는데 첫째, 성호르몬의 전구물질로써의 기능이 있어 필요한 조직에서 남성 혹은 여성 호르몬으로 변환되어 사용되고(Labrie 등, 1998), 둘째, 중추신경계에서는 신경활성화 스테로이드로 작용하여 여러 신경전달물질들과의 상호 작용을 통하여 신경 자극을 조절하며(Park-Chung 등, 1999), 셋째, 스트레스 상태에서 코티졸의 역할을 완충해 주고(Kimonides 등, 1999), 넷째, 칼슘 관문 칼륨 통로(calcium gated potassium channel)를 활성화하는 역할을 한다(Farrukh 등, 1998).
"E2"은 생식소(난소)에서 생성, 분비되는 호르몬이다. 특히 여성에서 유선의 발달, 자궁내막의 비후에 관여하고 난소의 난자의 성장을 유도하는 호르몬으로 알려져 있다. 특히, E2은 난소의 스테로이드 생성과정 중 최종산물이며 난자의 성장과 자궁비후의 조절자 역할을 한다.
정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성에서는 E2의 생성, 분비 또한 일정한 일주기리듬을 나타내며 아침기상후 최초 1시간안에 약 150-200%의 상승이 나타나는 것으로 보고되어 있다. 아침기상 후 E2 농도의 변화는 생리기, 여포기, 배란기에 따라 증가폭 및 분비량이 달라지며 폐경기 여성에서는 아침기상 후 E2 농도 증가가 나타나지 않은 것으로 보고되어 있다(Ahn 등, 2012).
특히, 본 발명에서 에스트라디올 (estradiol)로서 17번 탄소의 하이드록실 그룹 (OH) 위치가 베타형의 에스트라디올(β-estradiol)인 것이 바람직하다. 베타 에스트라디올은 축약하여 E2로 표시하며, 척추동물의 암컷의 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬인 에스트로젠 (estrogen)의 한 종류로써, 난소·태반 등에서 추출·결정화되는 여포호르몬의 하나이다. 암컷의 생식선을 발달시켜 2차·3차성징을 나타내는데, 특히 포유류에서 발정을 일으킨다. 또한, 세포핵에 들어가 새로운 단백질의 합성을 촉진하고, 세포의 증식을 일으키는 작용이 있다. 특히, 베타 에스트라디올은 여성의 몸 안에서 심하게 변동하는 생식호르몬으로, 카페인과 비슷한 작용, 즉 아데노신이 원래부터 가지고 있는 억제효과를 상쇄함으로써, 여성들이 월경 주기 중 여포기 후기, 곧 배란 직전에 경험한다는 가벼운 흥분을 일으키는 물질로 알려져 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 DHEA 및 E2 농도 측정 전에 적합한 타액시료의 결정을 위해 코티졸의 농도 변화를 추가로 확인하는 것이 더욱 바람직하다.
"코티졸(cortisol)"은 부신피질에서 분비되는 스테로이드 호르몬이다.
부신의 하루주기 리듬은 뇌신경, 시상하부(hypothalamus), 뇌하수체 (pituitary)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있으며 근본적으로는 개인의 수면주기에 의하여 결정되어진다. 정상적으로 밤에 수면을 취한 후, 아침에 일어나면 뇌신경에서는 기상(wake up)을 인지하며, 이 신호는 시상하부의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에 도달하게 되고 시교차상핵에서는 생체시계 유전자(bioclock gene)가 활성화 되며, 이 신호는 다시 뇌실옆핵(paraventricular nucleus, PVN)에 전달된다. 뇌실옆 핵에서는 이 자극에 반응하여 부신피질자극호르몬 분비호르몬(corticotropin releasing hormone, CRH)을 분비하며, 분비된 분비호르몬은 뇌하수체를 자극하여 부신피질자극호르몬(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)을 생성, 분비하게 된다. 뇌하수체에서 생성, 분비되는 부신피질자극호르몬 농도는 기상 후 15분에 정점(peak)에 이른다. 혈액에 분비된 부신피질자극호르몬은 부신에 작용하여 부신피질의 코티졸의 생성을 증가시키게 된다.
따라서, 최정상 코티졸 농도는 기상 후 30분 정도에 나타나며 이때의 코티졸 농도가 하루 중 가장 높다. 이와 같이 아침에 잠에서 깨어난 후 30분 정도에 코티졸 농도가 정상에 이르는 현상을 기상에 따른 코티졸 반응(cortisol awakening response, 이하 CAR)이라 한다. CAR은 일반적인 수면 환경, 빛, 수면시간 동안 깨는 현상등에 영향을 받지 않으며, 건강상태에 의하여 많은 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 그러나 기상 직후 타액 시료채취가 10분 이상 지연되면 CAR 현상은 나타나지 않은 것으로 보고되어 있다
그러므로, 본 발명의 성조숙증 진단을 위한 정확한 정보를 수득하기 위해서는 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내의 코티졸 농도 변화가 2.5 nmol 이상인 경우의 타액을 대상으로 DHEA 및 E2 농도를 측정하는 것이 가장 바람직하다. 이 때, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내의 코티졸 농도 변화 확인은 아침기상 직후, 기상 30분, 기상 60분에 각각 채취한 타액을 대상으로 할 수 있다.
진단 방법
본 발명은 타액 내의 데히드로에피안드로스테론(DHEA; dehydroepiandrosterone) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)을 이용하여 여아의 성조숙증을 진단하는 방법 및 이에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 특히, 여아의 사춘기 초기 단계, 여아의 생식 내분비선의 성숙 여부 및 이에 따른 초경 시작 시기에 대한 정보 등을 정확하게 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 방법에 대하여 구체적으로 기술한다.
(a) 적합한 시료로서의 타액 준비
본 발명의 성조숙증 진단에 사용하는 시료는 규정된 정확한 시간에 채취된 타액으로, 아침기상 직후(눈을 뜬 후 바로), 기상 30분, 기상 60분에 채취한 타액을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
특히, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안에 코티졸의 농도가 최소 2.5 nmol 이상 증가하는 타액을 사용하는 것이 바람직하다.
정상적인 성인 남녀에서 아침기상 후 코티졸의 농도는 50-150% 증가하는 것으로 보고되어 있고, 기상 직후부터 기상 30분 후 까지 최소 2.5 nmol이 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 정상적인 남,여에서 아침 기상 직후 첫 타액 시료의 채취가 10분 이상 지연되었을 경우에는 이러한 코티졸 증가 현상을 관찰할 수 없는 것으로 보고되어 있다.
본 발명은 아침기상 직후, 기상 30, 60분 후에 채취한 타액을 이용하여 DHEA 및 E2를 정량분석하는 것을 주요한 특징으로 한다.
기상 후 10분 이상 지연되어 채취된 타액에서는 코티졸 농도 증가 현상을 볼 수 없고, 이러한 시료에서 추가적으로 다른 스테로이드 호르몬인 DHEA나 E2의 정량분석은 의미가 없는 바, 이러한 시료들은 본 발명의 검사에서 제외되어야 한다.
그러므로, 검사 대상자가 기상 직후에 바로 타액을 채취했다고 표시하더라도 기상이라는 의미가 개인별 차이가 있기 때문에 아침기상 직후 첫 타액시료의 채취가 지연되었는지를, 즉 규정된 시간에 정확히 채취되었는지를 확인하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 방법은 준비된 타액이 분석에 적합한지 여부를 확인하기 위하여 코티졸의 농도 변화를 측정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이는 아침기상 후 코티졸의 농도 변화를 통하여 정확한 시간에 타액이 채취되었는지 확인하기 위한 것으로서, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안에 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 경우의 타액을 시료로 결정하여 사용하는 것이 바람직하다.
(b) 타액 내 DHEA 및 E2 의 농도 측정
본 발명에서는 아침기상 직후, 기상 30, 60분 후에 채취한 각각의 타액에서 DHEA 및 E2의 농도를 측정하여 그 농도 변화를 관찰한다.
본 발명에서 코티졸, DHEA, E2농도 측정에 다양한 방법을 사용할 수 있다.
즉, 제한은 없으나, 바람직하게는, 방사선 면역 측정법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 효소를 표지자로 이용한 효소면역측정법(EIA), luminol이나 그 유도체 또는 aminobutyl-ethylisoluminol(ABEI)로 감도를 증가시킨 화학섬광면역측정법(chemiluminescence immunoassay; CIA), 또는 형광물질표지자(fluorescent label)를 이용한 형광면역측정법(fluorescence immunoassay; FIA) 등이 사용될 수 있다.
방사면역측정법은 높은 감도(sensitivity)와 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 나타내며, 반응 후의 분명하고 명백한 검출을 가능케 해주는 등 여러 이점을 가지고 있는 바, 가장 바람직하게는 방사선 면역 측정법을 사용할 수 있고, 이를 위해 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법을 이용할 수 있다. 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 혈액의 1/100-1/1000 정도로 매우 낮은 문제점이 있으므로, 타액에 포함되어 있는 소량의 호르몬 농도를 측정하기 위하여 고도로 민감한 분석 시스템이 요구되는데, 이러한 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법이 유용하게 활용될 수 있다. 보다 상세한 측정과정은 액상-이중항체 방법을 이용한 호르몬 측정에 관한 논문(Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population ; age - related differences , diurnal , and correlations with serum levels . Yonsei Med J. 2007;48:379-88)을 참조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 요오드 125 (125I)로 표지된 항원과 2차 항체을 이용한 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)을 이용하였다.
즉, 아침기상 직후, 기상 30분 후, 60분 후에 채취한 각각의 타액에서 코티졸, DHEA 및 E2의 농도를 측정하고, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안에 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 경우의 타액을 시료로 한 경우에 대하여 DHEA 및 E2의 농도 변화를 분석한다.
(c) DHEA 의 아침기상 후 최초 1시간 동안 총분비량에 의해 사춘기 발달 시작 여부에 대한 정보 수득
상기 (b)에서 측정된 DHEA 농도값을 이용하여, 아침기상 후 최초 한시간 동안 분비된 총 DHEA 분비량을 구함으로써, 대상 여아의 사춘기 발달의 초기 단계 여부인지에 대한 정보를 수득할 수 있다.
본 발명에서, 아침기상 직후, 기상 30분 후, 60분 후에 채취한 각각의 타액에서 측정된 DHEA 농도를 적분하여 아침기상 후 최초 한시간 동안 분비된 총 DHEA 분비량이 약 13.63 nmol/L 이상, 바람직하게는 13.63 ~ 41.34 nmol/L 범위인 경우는 대상 여아가 사춘기 발달의 시작 단계에 있는 것으로 판단한다.
이는, 아침기상 후 최초 1시간 동안 분비된 DHEA 총량이, 부신피질 기능항진(adrenarche)이 시작되었는지에 대한 지표로 활용될 수 있음을 의미한다.
(d) E2 의 농도 증가 기울기(slope)율의 변화율( 기울기값의 변화율)에 의해 생식 내분비축의 성숙도에 대한 정보 수득
상기 (b)에서 측정된 E2 농도값을 이용하여, 아침기상 후 최초 한시간 동안의 E2 분비 양상을 분석함으로써, 대상 여아의 체내 내분비적 환경에 대한 정보를 수득할 수 있다.
이 때, 상기 E2 농도 증가 기울기값은 기상 직후 및 기상 후 30분 사이의 증가율을 이용하는 것이 바람직하다. 특히, 아침기상 직후 채취된 타액에서 측정된 E2 농도 증가 기울기값이 0.32 이상, 바람직하게는 0.32 ~0.47 범위인 경우, 대상 여아의 생식 내분비 축이 성인과 같이 성숙된 경우로 판단한다.
또한, 본 방법은 추가로 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 총 분비량 구하는 단계를 포함할 수 있고, 이를 성인 여성의 경우와 비교하여 초경 시작 시기를 예측할 수 있다.
즉, E2의 농도 증가 기울기값 및 총 분비량을 이용하여, 초경이 시작되지않은 사춘기 여아에서 시상하부-뇌하수체-난소로 이어지는 생식 내분비 축이 성인 여성과 같이 성숙되어 있는지 여부를 알려줌으로써 초경의 시기를 예측할 수 있게 한다.
그러므로, 본 발명은 바람직한 구체예로서,
바람직한 일 구체예로서,
(a) 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 코티졸, DHEA 및 E2의 농도를 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 코티졸 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 것을 확인하는 단계;
(c) (b)가 확인된 타액으로부터 측정된 DHEA 농도값을 이용하여 기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량을 구하는 단계;
(d) (b)가 확인된 타액으로부터 측정된 E2 농도값을 이용하여 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값을 구하는 단계를 포함하는, 성조숙증 진단 또는 이에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 구체예로서,
(a) 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 DHEA 농도를 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 DHEA 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량을 구하는 단계; 및
(c) 상기 총 DHEA 분비량이 13.63 nmol/L 이상인 경우에 대상 여아는 사춘기 발달의 초기 단계에 있다고 판단하는 단계를 포함하는, 성조숙증 진단 또는 이에 필요한 정보로서, 대상 여아가 사춘기 발달 초기 단계인지 여부를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 또 다른 구체예로서,
(a) 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 E2 농도를 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 E2 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값을 구하는 단계; 및
(c) E2의 농도 증가 기울기값이 0.32 이상인 경우에 대상 여아는 생식 내분비선이 성숙되었다고 판단하는 단계를 포함하는, 성조숙증 진단 또는 이에 필요한 정보로서, 대상 여아의 생식 내분비선의 성숙 여부를 제공하는 방법을 제공한다.
이처럼, 본 발명은 DHEA 및 E2을 이용하여 DHEA 농도증가 현상 및 E2 분비양상의 변화를 분석함으로써, 여아의 체내 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보 및 이에 따른 성조숙증 진단에 필요한 정보를 제공한다. 특히, 여아의 사춘기 발달 초기 단계의 시작 여부, 여아의 생식 내분비선의 성숙도 및 초경 시작 시기에 대한 예측에 관한 정보 수집 및 그 활용에 매우 유용할 것이다.
또한, 본 발명은 성 조숙증 혹은 성 만숙증에 대한 의료적 접근을 보다 용이하게 할 수 있으며, 이로 인해 나타날 수 있는 성 조숙증 및 성만숙증 예비 검사 및 예후검사에 충분히 이용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 피험자
환경적인 동질성을 보장하기 위해, 대한민국 서울 강남구의 두 초등학교를 선별하였고, 학부모 위원회의 구성원들 및 학교 선생님들로부터 여아들 및 여성 가족 구성원들의 참여에 대한 동의 및 참여자들의 건강과 사춘기 상태에 대한 정보를 받았다.
다음 기준 중 어느 하나에 해당되는 여학생들을 제외하였다: 1) 초경을 경험함; 2) 지난 달 내에 구강 성장 호르몬 치료 또는, 경구 또는 경피 글루코코르티코이드-함유 약 복용; 3) 지난 2주 내에 시차증 가짐; 4) 만성질환 진단; 5) 비정상적인 체질량지수(BMI)를 나타냄(7, 8세: BMI 13.9 이하 또는 18.4 이상; 9세: BMI 14.4 이하 또는 19.2 이상; 10세: BMI 14.9 이하 또는 19.8 이상; 11세: BMI 15.5 이하 또는 20.4 이상; 12세: BMI 16.0 이하 또는 21.0 이상).
또한, 다음 기준 중 어느 하나에 해당되는 성인 여성들도 제외하였다: 1) 직전 월경 주기는 규칙적이나 본 실험의 시작에 앞서 6개월 내에 불규칙적인 월경 주기가 2회 이상 발생; 2) 지난 6개월 내에 호르몬 대체요법 또는 경구 피임약, 타목시펜, 또는 다른 에스트로겐-, 프로게스테론- 또는 글루코코르티코이드-함유 약 복용; 3) 임신 또는 수유, 불임의 증거 또는 성병 존재, 또는 난소부전 진단, 또는 비정상적인 BMI를 나타냄(BMI 18 이하 또는 25 이상); 또는 5) 항우울제 복용 또는 흡연자. 그러나, 경구 피임약 또는 스테로이드 함유 약을 마지막으로 사용한 시기가 본 실험 6개월 이상인 피험자들에 대해서는 자격을 인정하였다.
선정된 피험자들에게 3개의 타액 채취 튜브가 담긴 팩, 타액 채취에 대한 설명, 자기 평가 문항, Tanner stage를 결정하는 설명, 및 동의서를 분배 또는 전달하였다. 여학생 부모 233명과 성인 여성 136명은 각자 사전 동의(informed assent and consen)를 보내왔다. 참여하는 모든 여아들은 한국에서 태어나 그들의 생부모와 함께 집에서 자랐다. 본 실험은 CHA 대학 강남 병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받았고 윤리 권고를 따라 실시되었다.
자가보고는 의사 평가와 강한 상관관계에 있기 때문에, 사춘기 상태는 여성-특유 사춘기 발육 자기 평가 문항을 이용하여 여아들 및/또는 그들의 부모들에 의해 결정되었는데, 유방 및 음모 발육의 5단계의 단순 Tanner line 도안을 이용하여 결정되었다. Tanner의 묘사로부터 얻어진 소량의 단순 텍스트가 예시로 첨부되었고, 설문지에 여아들 및 그들의 부모들이 ‘현재 자신과 가장 가깝게 보이는’ 예시가 있는 박스에 체크하도록 요구했다. 사춘기 단계는 자기 평가 문항에 따라 부여되었고, 초경 전 여아들은 그들의 자가보고(여아들 및 참여한 그들의 어머니와 함께) Tanner 유방(B) 및 음모(PH) 단계에 따라 분류되었다: B1PH1, B2PH1, B2PH2 및 B3PH1, B3PH2.
2. 타액 채취
일어난 후 30분에 DHEA에 대한 코티졸 비는 일하는 피험자들 내에서 목요일에서 토요일까지 안정화 시기와 함께 매일 변화를 나타내므로, 참가자들에게 목요일 또는 금요일에 일어난 즉시 그리고 일어난 후 30분 및 60분에 각 시점에서 제공되는 타액의 최소 1.5 mL 부피로 그들의 타액 샘플을 채취하도록 요구하였다. 그들에게 수면-각성 주기에 변화를 주지 않을 것을 요구하였다. 참가자들에게 정해진 시간에 타액 샘플을 채취하고(일어난 후 5분 미만, 일어난 후 25~35분 및 55~65분) 채취 튜브(Simport Inc., QC, Canada)의 표지 영역(marking area)에 각각의 채취 시간을 메모하도록 지시하였다. 외부 자극 없이 근육 움직임과 채취 튜브에 타액을 뱉는 것만으로 타액을 채취하였다. 성인 여성에게는 전날 밤에 음주를 하지 않도록 요구하였다. 샘플 채취 시기 동안에, 참가자들은 음식 섭취, 음용, 또는 양치질 및 각 샘플 채취 전에 물로 입을 헹구는 것을 삼가도록 요구하였다. 타액 안에 스테로이드 농도는 -20℃ 또는 -80℃에서 보관 후 1년까지 안정적이고, 분석 전에 4번까지 샘플의 냉동 및 해동은 측정된 농도에 영향을 미치지 않으므로, 참가자들에게 그들의 타액 샘플을 샘플 제출에 앞서 그들 소유의 가정용 냉동실에 보관하도록 요구하였다. 타액 샘플은 목요일 및 금요일에 수업을 시작하기 전에 제출되었다. 이 때, 육안검사에 의한 결정으로, 피로 오염된 샘플들은 본 실험에서 제외되었다. 튜브의 표지 영역에 시간 또는 날짜가 없는 샘플들 또한 제외되었다.
전형적인 CAR은 순응 피험자 내에서 개인의 기준치를 넘어 코티졸 레벨 내 적어도 2.5nmol/L 증가로서 정의된다. 건강한 피험자에 있어서, 일어난 다음 10분 이상 지연 후에 첫 샘플의 채취는 일어난 후 코티졸 증가가 나타나지 않는데, 일부 피험자들에 있어서, 전형적인 CAR은 관측되지 않았다. 그리고, 일어난 직후, 일어난 후 30분 및 60분의 코티졸 농도는 초경 전 여아들 일부에 있어서(n=76), 각각 14.8±4.8, 11.0±4.6 및 7.3±3.5nmol/L, 성인 여성들 일부에 있어서(n=32), 각각 15.3±5.3, 13.8±4.3, 9.1±4.0 nmol/L였다. 우리는 이러한 케이스들은 불순응 피험자들이라고 생각하였다. 그들은 다음 목요일 또는 금요일에 또 다른 타액 샘플 집단을 채취하고 일어난 후 첫 타액을 제공하는데 지체하지 않도록 요구하였다. 이러한 불순응 피험자들 케이스 가운데, 많은 초경 전 여아들(n=43) 및 성인여성들(n=21) 샘플의 두 번째 집단에서 전형적인 CAR이 관측되었다. 다른 초경 전 여아들(n=33) 및 성인여성들(n=11_은 두 번째 채취에 참여하지 않았거나, 우리는 그들의 타액 샘플의 두 번째 집단에서 전형적인 CAR을 관측하지 못하였다. 그들은 무응답자들 또는 불순응 피험자들로 생각되고, 차후의 분석에서 제외하였다.
제외 절차 후에, 158명의 초경 전 여아들 및 69명의 성인 여성들로부터 채취한 타액 샘플들로 얻어진 데이터를 본 실험에 포함시켰다.
여학생들은 0630h±15 min(range: 0605h ~ 0712h), 성인 여성은 0625h±29min(range:0525h ~ 0750h)에 일어났다. 한국 천문 정보학에 따르면, 타액 샘플 채취 기간 동안에 서울에서 평균 일출은 0512 h ~ 0513 h에서 이루어졌다.
3. 타액 정제
채취된 샘플은 찌꺼기를 제거한 후에 -70 ℃에서 보관하였다. 뮤신을 타액전시키기 위해, 샘플들을 해동하고 원심분리하였다(10,000g, 15min, 4℃). 상층액을 채취하고 시험을 수행할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 모든 타액 샘플들은 전남대학교의 호르몬 연구센터에서 분석되었다.
4. 타액 내 호르몬 농도 측정
타액 내 코티졸, DHEA, 및 E2 농도는 방사면역측정법을 이용하여 결정되었다.
코티졸, DHEA, 및 E2에 대한 참조 표준은 Sigma-Aldrich 화학 회사로부터 얻었다(MO, USA). 코티졸, DHEA, 및 E2의 표준 재고품 용액(10 mmol/L)을 에탄올에서 준비하였고, 상기 재고품 용액을 50 mmol/L 인산-완충액 살린을 함유한 0.1% 겔라틴으로 희석함으로써 상용 표준을 제조하였다(ph=7.2).
Isotope Co. Ltd. 기관(부다페스트, 헝가리)으로부터 요오드화 코티졸 및 E2를 수득하였다. 이전에 설명한 방사성 스테로이드용 프로토콜을 변형함으로써 Iodine-125-labeled DHEA(DHEA-7-(O-carboxymethyl) oximino-(2-[125I] iodohistamine) 를 준비하였다. 코티졸 항혈청을 Accurate Chemical & Scientific Co.(NY, USA)로부터 구입하였고, E2 항혈청을 Meridian Life Science, Inc.(ME, USA)로부터 구입하였다.
코티졸 항혈청은 코티손(cortisone), 11-데옥시코티졸(11-deoxycortisol),프레드니솔론(prednisolone), 코티졸-21-글루코시듀로네이트(cortisol-21-glucosiduronate), 코티졸-21-설페이트(cortisol-21-sulphate), 및 다른 스테로이드와 각각 1.0%, 8.9%, 31.6%, 1.3%, 0.01% 미만, 및 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다. DHEA 항혈청은 안드로스테네디온(androstenedione), 에피안드로스테론(epiandrosterone), 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone), 및 다른 스테로이드와 각각 0.4%, 0.2%, 1.3%, 및 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다. E2 항혈청은 에스트리올(estriol), 에스트론(estrone), 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone), 및 다른 스테로이드와 각각 0.09%, 0.5%, 및 0.01% 미만의 교차 반응 레벨로 교차 반응한다.
3.6 및 10.9 nmol/L의 평균 코티졸 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay 변동계수(CV)는 각각 7.4% 및 8.5% 였다(n=26). 코티졸에 대한 검출예민도는 0.4 nmol/L 였다. 159.0 및 795.0 pmol/L의 평균 DHEA 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay CV는 각각 12.5% 및 10.1% 였다(n=26). DHEA에 대한 검출예민도는 0.7 pmol/L였다. 18.4 및 183.6 pmol/L의 평균 E2 농도를 이용한 품질관리로부터 평가한 Inter-assay CV는 각각 11.5% 및 13.2% 였다(n=26). E2에 대한 검출예민도는 3.7 pmol/L였다. B1PH1에 해당되는 14명의 여아들로부터 채취된 타액 샘플들은 검출한계(1.8 pmol/L) 아래의 E2농도를 함유하였다.
5. 데이터 분석
기상 후(post-awakening) 동안에 스테로이드 분비 활동을 분석하기 위해 보조 색인(auxiliary indices)을 적용하였다. 코티졸, DHEA, 및 E2 농도 결정 후에 기상 후 시기 동안에 총 코티졸, DHEA, 및 E2 분비는 일어난 즉시 시점으로부터 일어난 후 60분까지 윈도우용 GraphPad Prism 버전 5.00(GraphPad Software, CA, USA)를 사용하여 그라운드에 대한 곡선 아래의 면적(AUC)으로 계산되었다(각각 CARauc. DHEAauc, and E2auc).
일어난 후 첫 30분 이내에 코티졸 레벨 순 증가(CARi)는 각 피험자를 대상으로 계산되었다. 일어난 후 첫 30분 이내에 E2 레벨 증가에 대한 파라미터 베타는(E2Inc 기울기) 선형 회귀를 이용하여 각 피험자를 대상으로 계산되었다.
Shapiro-Wilk 정규성 검증은 변수들, 즉 각 검사 시점에 스테로이드 농도 및보조 색인(auxiliary indices)이 정상적으로 분포되지 않음을 드러냈다. 따라서 모수치 통계 검증을 위한 샘플 분포를 정규화하기 위해 상기 값들을 로그-전환하였다. 평균 스테로이드 레벨 및 보조 색인(auxiliary indices)에서 집단 차이는 5% 유의수준에서 일방향 또는 양방향 ANOVA 검증 또는 양방향 t 검증을 이용하여 분석하였다. 일방향 ANOVA 검증이 현저한 차이를 나타낼 때(p<0.05), 특정 집단 차이를 발견하기 위해 Tukey’s post-hoc test를 수행하였다. SAS 버전 9.1(SAS Institute Inc., NC, USA)을 이용하여 통계적 계산을 수행하였다. 0.05 미만의 p 값을 유의미한 것으로 간주하였다.
참고예 1 : 초경이 시작되지 않은 여아들의 사춘기 발달단계
참고를 위해, 참가한 초경 전 여아들의 나이에 따른 각 사춘기 단계의 도수분포(Frequency distribution)를 도 1에 도시하였다.
초경이 시작되지 않은 여아들의 2차성징의 발달을 Tanner의 발달 단계에 따라 구분한다. 이들 여아의 가슴 발달 (breast, B) 및 음모 (pubic hair, PH)의 발달 단계에 따라 구분하며 전체적으로 B1PH1, B2PH1, B2PH2, B3PH1 및B3PH2등으로 구분한다. .
실시예 1 : 타액채취시간 기준이 되는 코티졸 농도의 변화
정상적인 성인 남녀에서 아침기상 후 코티졸의 농도는 50-150% 증가하는 것으로 보고되어 있고, 이는 기상 직후부터 기상 30분 후 까지 최소 2.5 nmol이 증가하는 것으로 알려져 있다. 특히, 정상적인 남녀에서 기상 직후 첫 타액시료의 채취가 10분 이상 지연되었을 경우 기상 후 코티졸 증가 현상을 관찰할 수 없다. 이러한 시료에서 추가적으로 다른 스테로이드 즉, DHEA 나 E2의 정량분석은 의미가 없는 바, 아침 기상 후 호르몬 반응 검사에서 반드시 제외되어야 한다.
참여한 여아들을 5개의 서브 그룹으로 분류하고 (B1PH1, B2PH1, B2PH2, B3PH1, 및 B3PH2) , CAR을 평가하여 그 결과를 도 2에 도시하였다.
two-way ANOVA 분석을 통해, 서브 그룹들 및 유의한 시간 효과(F2, 663 =87.72, p < 0.0001) 사이의 기상 후 코티졸 분비의 수준에서의 차이점을 보여주는 결과(F5, 663 = 13.25, p < 0.0001)를 확인하였다. 실험한 모든 그룹에서 코티졸 분비의 유사한 패턴이 확인되었다 (도 2A). B1PH1그룹의 여아들도 B2PH1 (F1, 312 = 1.23, p > 0.05), B2PH2 (F1, 243 = 0.44, p > 0.05) 및 성인 여자 (F1, 408 = 0.10, p > 0.05) 의 경우와 유사한 결과를 보였다(도 2A). 즉, 코티졸 농도는 사춘기의 발달의 진행에 따라 증가하였고, B3PH1 및 B3PH2 여아들은 성인 여성의 경우 및 다른 단계보다 더 높게 나타났다 (p < 0.0001).
또한, 본 발명자들은 CARauc (F5, 221 = 5.72, p < 0.001) 상에서 사춘기 발달 단계도 확인하였다(도 2B). 그 결과, B3PH1 및 B3PH2 여아들의 CARauc가 더욱 높게 나타남을 알 수 있었다.
또한, CARi 상에서 사춘기 발달 단계에 따른 영향도 관찰하였다 (F5, 221 = 2.94, p < 0.05) (도 2C). 그 결과, B1PH1 여아들보다 B3PH1 의 여아들의 경우가 현저히 CARi 가 높게 나타났고(p < 0.05), 이는 성인 여자 및 다른 사춘기 발달 단계의 경우와 비슷하였다(도 2C).
이러한 결과를 통해, B1PH1 여아들에게서 나타나는 전형적인 CAR 패턴이 사춘기 발달 진행 동안 변하지는 않지만, 기상 후 코티졸 수준 정도가 사춘기 중기 단계의 여아들에게서 증가함을 알 수 있었다.
실시예 2 : 아침 기상 후 최초 1시간 동안 분비된 DHEA 총량에 따른 사춘기 발달 단계 확인
정상적인 생리주기를 갖고 있는 여성과 초경이 시작되지 않은 사춘기 발달이 진행중인 여아에 대하여, 아침기상 후 최초 1시간 동안에 정상적으로 채취된 타액 시료로부터 DHEA 농도를 분석한 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, DHEA의 수준은 사춘기 발달이 진행되면서 증가 됨을 알 수 있었고, 특히 사춘기 시작인 B2PH1단계에서 커다란 증가가 나타남이 확인되었다(도 3A).
B1PH1단계, B2PH1단계 및 성인 여성의 아침기상 후 최초 1시간 동안 분비된 DHEA 총량 (area under the curve, AUC)을 도 3B 및 아래 표 1에 기재하였다.
[표 1]
1PH1단계, B2PH1단계 및 성인여성의 아침기상 후 최초 1시간동안 분비된 DHEA 총량 (단위 nmol)
Figure PCTKR2015005752-appb-I000001
표 1에 나타난 바와 같이, 최초 1시간 동안 분비된 DHEA 총량은 사춘기 시작전인 B1PH1과 사춘기가 시작돤 B2PH1에서 급격히 증가되어 있음을 알 수 있었고, 이러한 결과를 바탕으로, DHEA의 총분비량이 아침 기상 후 최초 1시간 동안에 13.63 nmol 이상이면 여아에서 사춘기 발달 단계가 시작되는 것으로 판단할 수 있는 기준을 마련하였다.
실시예 3 : 아침 기상 후 최초 1시간 동안 분비된 E2 증가 기울기에 따른 생식 내분비축의 성숙도 확인
정상적인 생리주기를 갖고 있는 여성과 초경이 시작되지 않은 사춘기 발달이 진행중인 여아에 대하여, 아침기상 후 최초 1시간 동안에 정상적으로 채취된 타액 시료로부터 E2 농도를 분석한 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 기상 직후의 E2의 농도는 사춘기 발달이 진행되면서 증가되었고, 특히, 초경이 시작되지 않은 사춘기 중기 단계, B3PH2단계에 이르면 정상적인 생리주기를 갖는 여성과 동일한 아침기상 후 E2 증가 현상이 나타남을 알 수 있었다 (도 4A).
또한, B3PH2 단계에서 나타나는 E2증가 기울기는 성인 여성과 통계적으로 차이를 보이지 않지만(도 4C), B3PH2 단계의 여아의 아침 기상 후 최초 1시간 동안 분비되는 E2의 총량은 성인 여성의 1/3수준으로 확인되었다(도 4B).
도 4C의 아침 기상 후 E2 증가 기울기 값을 통계적으로 정리하여 표 2에 기재하였다.
[표 2]
초경이 시작되지 않은 여아 및 정상적인 생리주기를 갖는 성인 여성에서 기상 후 최초 1시간 동안 E2 농도의 증가 기울기(slope)
Figure PCTKR2015005752-appb-I000002
상기 표2를 통해서도, 사춘기 발단 달계 중기에 이르면 성인여성과 동일한 아침기상 후 E2 증가 기울기값을 가짐, 즉 E2 분비 증가 양상이 나타남을 알 수 있고, 그 기울기는 범위는 0.32 ~ 0.47 정도의 최적 범위를 보였다.
이러한 기울기값 증가는, 아침 기상 후 빛의 자극에 의하여 시상하부에서 GnRH의 분비가 증가되어가 뇌하수체를 자극하여 난소의 성호르몬 생성 및 분비를 유도함에 의해 나타나는 것으로 생각된다. 그리고, 이는 여아의 시상하부-뇌하수체-난소로 이어지는 생식 내분비축이 성인과 같이 완성되어 있음을 시사한다.
다만, B3PH2 단계에서는 성인과 동일한 수준의 충분한 양의 E2가 생성, 분비되지 않아서(성인의 1/3 수준) 아직 생리 현상이 일어나지 않은 것으로 판단된다. 그러므로, 앞으로 E2의 수준 증가만 이루어진다면 사춘기의 피크에 나타나는 현상인 초경이 시작될 것이므로, 이러한 E2 농도 기울기 분석을 통해 생식 내분비축의 성숙도를 확인함으로써 여아의 초경 시작 시기를 예측할 수 있다
이처럼, 본 발명은 타액으로부터 코티졸, DHEA 및 E2의 농도를 측정하여 DHEA의 아침기상 총 분비량의 퍼센타일값 및 E2 증가 기울기의 퍼센타일값으로 수치화함으로써, 간단하면서도 객관적으로 여아의 사춘기 시작 및 생식 내분비 축의 성숙정도를 확인할 수 있는 바, 성조숙증의 진단 및 여아의 초경 시작 시기를 예측하는데 매우 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
본 발명은 데히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol, E2)의 농도 분석을 통하여 여아의 체내 생식 내분비적 환경에 관한 다양한 정보를 제공할 수 있는 바, 여아의 사춘기 발달 초기 단계의 시작 여부, 여아의 생식 내분비선의 성숙도 및 초경 시작 시기에 대한 예측에 관한 정보 수집에 따른 성조숙증 진단 및 활용에 매우 유용하다.

Claims (12)

  1. 대상 여아의 기상 후 최초 1시간 이내에 채취한 타액으로부터 측정한 데히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA) 및 에스트라디올(estradiol-17β, E2)의 농도를 이용하는, 성조숙증 진단 또는 이에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    다음을 포함하는, 성조숙증 진단 또는 이에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 대상 여아의 기상 후 최초 1시간 이내에 채취한 타액으로부터 DHEA 및 E2의 농도를 측정하는 단계
    (b) 상기 측정된 DHEA 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량을 구하는 단계;
    (c) 상기 측정된 E2 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값을 구하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은
    기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol인 것을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 타액은 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 성조숙증 진단에 필요한 정보는 여아의 사춘기 발달 초기 단계인지 여부, 여아의 생식 내분비선의 성숙 여부 또는 초경 시작 시기 예측을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, (b)단계에서,
    기상 후 최초 1시간 동안의 총 DHEA 분비량은 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 측정한 농도값을 적분함으로써 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, (b)단계에서,
    기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량이 13.63 nmol/L 이상인 경우에 대상 여아는 사춘기 발달의 초기 단계에 있다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2항에 있어서, (c)단계에서,
    기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값이 0.32 이상인 경우에 대상 여아는 생식 내분비선이 성숙되었다고 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 E2 농도 증가 기울기값은 기상 직후 및 기상 후 30분 사이의 증가율을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 방법은 (c) 단계에서
    기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값 및 총 분비량을 성인 여성의 경우와 비교하여 초경 시작 시기를 예측하는 것을 포함하는 방법.
  11. 다음을 포함하는, 성조숙증 진단에 필요한 정보로서, 대상 여아가 사춘기 발달 초기 단계인지 여부를 제공하는 방법:
    (a) 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 DHEA 농도를 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 DHEA 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 총 DHEA 분비량을 구하는 단계; 및
    (c) 상기 총 DHEA 분비량이 13.63 nmol/L 이상인 경우에 대상 여아는 사춘기 발달의 초기 단계에 있다고 판단하는 단계.
  12. 다음을 포함하는, 성조숙증 진단에 필요한 정보로서, 대상 여아의 생식 내분비선의 성숙 여부를 제공하는 방법:
    (a) 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 60분에 채취한 타액으로부터 E2 농도를 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정된 E2 농도값으로부터 기상 후 최초 1시간 동안 E2의 농도 증가 기울기값을 구하는 단계; 및
    (c) E2의 농도 증가 기울기값이 0.32 이상인 경우에 대상 여아는 생식 내분비선이 성숙되었다고 판단하는 단계.
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