CN114460309A - 一种检测钙骨素的试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种检测钙骨素的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测钙骨素的试剂盒及检测方法，属于免疫检测的技术领域，解决了相关检测方法用时长的问题。本发明试剂盒包括校准品、生理盐水、R1试剂、R2试剂和R3试剂；所述R1试剂包括磁分离试剂和抗红细胞抗体；R2试剂包括HRP标记的BGP单抗；R3试剂包括Acridan标记的BGP单抗；测步骤包括：S1、于人全血中加生理盐水和R1试剂，反应、磁分离后得反应液A；S2、于反应液A中加R2试剂和R3试剂，孵育后得反应液B；S3、于反应液B中加入激发液隔离液，测定；S4、绘制标准曲线，确定BGP含量。本发明试剂盒和方法用于检测人全血中的BGP含量，其具有检测高效、用时少的优点。

Description

一种检测钙骨素的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及免疫检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种检测钙骨素的试剂盒及检测方法。
背景技术
骨钙素主要是由成骨细胞成牙质细胞合成并分泌的，属于γ-羧谷氨酸包含蛋白类。骨钙素中谷氨酸基经γ-羧基化后才具有生物学效应，而其中的羧基化必须有维生素K参与，因此也是维生素K依赖性蛋白质。骨钙素又称骨γ-羧谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins，BGP)，该蛋白质在骨矿化峰期之后才出现积聚。BGP的基因首先翻译成一个88个氨基酸残基的骨钙素原，骨钙素原移走信号肽后，γ-羧基化识别位点与依赖维生素K的羧化酶结合发生羧化反应，进而使得骨钙素中的谷氨酸基从无活性的谷氨酸残基转化为有活性的γ-羧基谷氨酸，此后前肽移走，完成骨矿化。
BGP是骨转化的特异标志物，成骨细胞分泌的BGP大量沉积在骨质中，而约20％的BGP进入血液循环，因此通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态。骨钙素值随年龄的变化以及骨更新率的变化而不同：骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低。因此可以通过检测血清中骨钙素的水平来了解骨更新的变化。
目前，针对血清中骨钙素的含量测定，其检测对象为血清，因此在进行检测的第一步就是获得血清。临床上检测血清中BGP含量的常见方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)和磁微粒化学发光法。其中，放射免疫法在检测过程中存在放射性污染，而酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。
而采用其中的磁微粒化学发光法进行血清中BGP含量检测时，是将做了荧光标记的BGP单抗负载于磁微粒上，而BGP单抗和待检测血清中的BGP特异性结合后，将负载有BGP单抗、BGP和荧光标记物的磁微粒拿去做荧光检测，以实现最终的检测血清中BGP含量的目的。该方法虽然也在一定程度上提高了BGP含量检测的灵敏度和准确性，使得该方法的最低检测限为0.5-1ng/mL，但是同时也还是存在检测时间过长(检测时间为35-40min左右)的问题，从而不适用于临床快速检测的应用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本申请第一个目的在于提供一种检测钙骨素的试剂盒，本申请的第二个目的在于提供一种检测钙骨素的试剂盒的检测方法。采用本申请的试剂盒进行人全血样本中BGP的检测时，以磁分离技术替代传统的离心操作，以将人全血样本中的红细胞去除，缩短了每个样本的检测时间；同时本申请的检测方法是纯液相反应，具有快速检测人血中BGP的含量且检测灵敏度高的优点。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种检测钙骨素的试剂盒，包括校准品、生理盐水、R1试剂、R2试剂以及R3试剂；其中，所述R1试剂包括能够与人全血中的红细胞特异性结合的抗红细胞抗体以及能够结合抗红细胞抗体的磁分离试剂；所述R2试剂包括HRP标记的BGP单抗的溶液；所述R3试剂包括Acridan标记的BGP单抗的溶液；所述校准品包括包括浓度为0ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL的骨钙素抗原溶液。
通过采用上述技术方案，在使用本申请的试剂盒时，直接用人全血样本进行检测即可。用R1试剂中的磁分离试剂结合抗红细胞抗体，随后抗红细胞抗体和人全血中的红细胞特异性结合，形成磁分离试剂-抗红细胞抗体-红细胞复合物，便于后期通过磁分离处理将人全血中的红细胞高效完全地去除。通过R2试剂和R3试剂的组合使用，将二者和人全血样本混合后，其中，R2试剂中的HRP标记的BGP单抗和人全血样本中的BGP进行特异性结合，R3试剂中的Acridan标记的BGP单抗和人全血样本中的BGP的其他结合位点特异性结合，进而形成HRP-BGP-Acridan复合物，HRP-BGP-Acridan复合物在激发液和隔离液的作用下产生剧烈的发光反应，最终实现对人血中BGP含量的检测。
进一步地，所述磁分离试剂的制备方法包括以下步骤：将粒径为1-3um的羧基磁珠，经第一缓冲液清洗，随后利用EDC试剂活化，接着进行稀释，即得到磁分离试剂。
通过采用上述技术方案，于羧基磁珠内加入EDC试剂后，羧基磁珠上的羧基被活化，使得羧基磁珠上具有活化的能够非特异性结合蛋白质或者氨基酸的结合位点，以便在后期实现将蛋白质负载于羧基磁珠上的目的。此外，本申请的羧基磁珠的粒径仅为1-3um，盛放在容器内的羧基磁珠为类似于细沙式的流体状态；羧基磁珠的比表面积较大，能够负载的蛋白质或者氨基酸更多，负载效果更好。
进一步地，所述R1试剂的制备方法包括以下步骤：
S1-1、于所述磁分离试剂中加入所述抗红细胞抗体，单位体积的所述羧基磁珠中所述抗红细胞抗体的加入量为6-10mg/mL，充分混匀后反应28-32min，使得所述抗红细胞抗体和所述羧基磁珠交联，得到第一交联液；
S1-2、于所述第一交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，以使所述羧基磁珠上未反应的活化氨基酸位点完全反应，随后经磁吸附处理，于固相得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物；
S1-3、用第二缓冲液对所述羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物进行清洗后，于固相内加入所述第二缓冲液，即得到所述R1试剂，其中，所述R1试剂中所述抗红细胞抗体的浓度为1.1-1.5mg/L。
通过采用上述技术方案，首先磁分离试剂中的羧基磁珠已经被活化，使得羧基磁珠具有结合抗红细胞抗体的能力，进而实现羧基磁珠和抗红细胞抗体的非特异性结合。但此时，羧基磁珠上活化氨基酸位点并未全部负载有抗红细胞抗体，因此加入过量的甘氨酸，以使得羧基磁珠上的活化氨基酸位点均负载有蛋白质或者氨基酸，进而使得形成的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物的稳定性更好。步骤S1-3中第二缓冲液的清洗操作，主要是为了将羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物上黏附的例如含有胺基的氨基酸溶液等杂质洗去，以避免这些杂质对后续的反应带来干扰。步骤S1-3中第二缓冲液的再次加入，其目的在于进一步提高羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物的稳定性；而羧基磁珠和抗红细胞抗体的稳定交联，有利于更加全面地去除人全血样本中的红细胞。
进一步地，所述HRP标记的BGP单抗溶液的制备方法包括以下步骤：
S2-1、取质量比为1:(1.2-1.3)的BGP单抗和HRP分别做脱盐处理后，将分别含有两种蛋白质的溶液混合并浓缩，得到第一浓缩液，所述第一浓缩液中含有BGP单抗和HRP；
S2-2、于所述第一浓缩液里加入BS3试剂，并在水浴环境下反应，使得BGP单抗和HRP交联，得到第二交联液，所述第二交联液中含有HRP标记的BGP单抗；其中，所述BS3试剂和BGP单抗的质量比为(0.4-0.5)：1；
S2-3、于所述第二交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得未反应的活化氨基酸位点完全反应；
S2-4、对步骤S2-3最终获得的溶液进行蛋白纯化，收集含有HRP标记的BGP单抗的第一纯化液并浓缩，使得浓缩液中HRP标记的BGP单抗的浓度为0.9-1.0mg/mL，即得HRP标记的BGP单抗溶液。
通过采用上述技术方案，首先使用BS3试剂将BGP单抗和HRP交联，实现对BGP单抗的HRP标记；随后将HRP标记的BGP单抗脱盐纯化，得到纯化后的HRP标记的BGP单抗；最后将纯化后的HRP标记的BGP单抗溶液进行浓缩，使得HRP标记的BGP单抗的稳定性更佳，其原因在于：蛋白纯化后得到的是BGP单抗-HRP复合物，当蛋白质存在溶液中时，蛋白质的浓度越大，蛋白质的稳定性越高，因此，将纯化后的HRP标记的BGP单抗溶液进行浓缩，使得纯化液中的蛋白质浓度变大，进而使得HRP标记的BGP单抗的稳定性更高。
进一步地，所述R2试剂的制备方法包括以下步骤：于所述HRP标记的BGP单抗溶液中加入第三缓冲液，使得所述HRP标记的BGP单抗的浓度为0.015-0.025mg/L，最终得到的溶液即为所述R2试剂。
通过采用上述技术方案，采用第三缓冲液将HRP标记的BGP单抗封闭，使得HRP和BGP单抗之间的交联更稳定。在上述的原料用量下，HRP标记的BGP单抗易于与待检样本中的BGP结合。
进一步地，所述Acridan标记的BGP单抗溶液的制备方法包括以下步骤：
S3-1、取BGP单抗进行脱盐处理，得到脱盐处理的BGP单抗溶液；
S3-2、将所述脱盐处理的BGP单抗溶液浓缩后，BGP单抗的浓度为5-7mg/mL；随后加入交联剂Acridan试剂反应后，得到第三交联液，所述第三交联液中含有Acridan标记的BGP单抗；其中，所述Acridan试剂和BGP单抗的质量比为(0.15-0.25)：1；
S3-3、于所述第三交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得溶液内未反应的活化氨基酸位点完全反应；
S3-4、将步骤S3-3最终得到的溶液进行脱盐处理后，即得到Acridan标记的BGP单抗溶液，其中，Acridan标记的BGP单抗浓度为0.9-1.0mg/mL。
进一步地，所述R3试剂的制备方法包括以下步骤：于所述Acridan标记的BGP单抗中加入第四缓冲液，使得Acridan标记的BGP单抗的浓度为0.015-0.025mg/L，最终得到的溶液即为得到R3试剂。
通过采用上述技术方案，首先使用Acridan试剂标记BGP单抗，实现BGP的Acridan标记；随后对Acridan标记的BGP单抗进行脱盐纯化，得到Acridan标记的BGP单抗；最后用第四缓冲液将Acridan标记的BGP单抗封闭，进一步稳定Acridan和BGP单抗之间的交联效果。在上述的原料用量下，其交联效果好；除此以外，得到的Acridan标记的BGP单抗易于与待检样本中的BGP发生特异性结合，从而保证了检测结果的准确性。
为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：一种上述检测钙骨素的试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：
Ⅰ、取人全血样本，随后于人全血样本中加入所述生理盐水和所述R1试剂，在反应时间大于3min后，进行磁分离处理，收集液相；
Ⅱ、于所述液相中加入所述R2试剂和所述R3试剂，在35-37℃的条件下孵育5-7min后，实现BGP和HRP标记的BGP单抗、Acridan标记的BGP单抗的同时交联，得到第四交联液，所述第四交联液中含有HRP标记的BGP单抗-BGP-Acridan标记的BGP单抗的复合物；
Ⅲ、准备激发液和隔离液，于所述第四交联液中加入所述激发液和所述隔离液后，测定发光值即可；
Ⅳ、以所述标准品为待测样品，进行步骤Ⅰ-Ⅲ，测定其发光值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中BGP的含量。
通过采用上述技术方案，本申请提供的是基于夹心法化学发光免疫分析法与邻近化学发光技术相结合的原理，实现人全血中BGP含量检测的一种新方法。在本申请的方法中，首先在检测样本的选择上，选用的是人全血，未对人全血进行离心处理，省去了离心步骤(通常离心步骤的时间需要15-30min)，进而缩短了每个样品的检测时间，由此，本申请的试剂盒和方法在医学检测应用上，具有较好的应用前景。其次，在本申请的检测方法中，生理盐水的加入使得人全血样本中的红细胞维持正常的渗透压，避免因红细胞破裂后，其内容物释放到外部溶液中，影响后续的反应和检测。在该方法中，磁分离试剂和抗红细胞抗体先行交联，交联产物在接触人血样本时，人血样本中的红细胞通过抗原-抗体间的特异性结合，与交联产物形成磁分离试剂-抗红细胞抗体-红细胞复合物(即为固相)。在磁吸附的作用下，磁分离试剂-抗红细胞抗体-红细胞复合物与人血样本进行固液分离，摒弃固相，留有液相(液相中含有待检测的BGP)以进行后面的处理过程。该脱除人全血中红细胞的磁分离方式与现有技术的离心方式相比，首先花费的时间较短，其次，红细胞的脱除是基于抗原抗体的靶向性特异性结合以及磁分离原理来实现的，使得红细胞的脱除效率更高。
在待检测样本中加入定量的HRP标记的BGP单抗、Acridan标记的BGP单抗，孵育后，HRP标记的BGP单抗和Acridan标记的BGP单抗分别与BGP抗原上的不同结合位点进行结合，形成“三明治”结构。在这个结构中，Acridan与HRP在空间位置上逐渐靠近；并在加入激发液和隔离液后能够产生剧烈的发光反应，即为临近化学发光现象。随后根据标准曲线即可算出样品中的BGP含量。在一定的检测范围内，发光强度与样本中的BGP浓度成正比。
本申请的方法首先采用的是人全血样本进行检测，免去人全血离心过程，样品的预处理步骤简单，且总检测时间短；其次，本申请的检测方法是基于液-液相反应进行的检测，和现有的固-液相(固相指包被载体，包被载体包括包被板、磁性微球等能够负载蛋白质的固相物质)反应的检测体系相比，本申请的检测方法的灵敏度更优，尤其是针对于低浓度BGP的检测，具有反应更快、更彻底的优势；在低浓度范围内的BGP检测，其灵敏度优于传统的检测方法。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本申请提出了一种新的方法学，本申请的方法学基于磁分离技术、夹心法化学发光免疫分析法与邻近化学发光技术的技术原理，实现了对人全血样本中BGP含量的检测。
2.由于本申请的方法采用的是人全血样本进行检测，不包含针对人全血的离心处理过程，针对一个样本，在其检测方法的灵敏度不大于0.5ng/mL的前提条件下，其检测时间短于12min，具有总检测时间短的优势；其次，本申请的检测方法，在0-300ng/mL的浓度范围内的BGP检测，本申请方法的符合率较高(R2≥0.92)。
3.本发明通过采用磁分离技术并引入抗原-抗体的特异性结合，能够快速有效地将人全血中的红细胞去除，操作高效。
具体实施方式
本申请中以下原料为购买获得：
其中，羧基磁珠的粒径为1-2um，购自merck。MES缓冲液的配置：将1.952g的MES溶于80mL的纯水中，调节pH为6.0，用纯水定容到100mL即可。抗红细胞抗体的来源为Holmes。EDC试剂购自Sigma。配置TRIS缓冲液的试剂中，其中，Tween-20购自Sigma；BSA-V(牛血清白蛋白，不含脂肪酸)购自Roche。
BGP单抗为市售，可购自Fitzgerald；BGP标准品购自于Fitzgerald。辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)购自Sigma；PD-10纯化柱购自GE。BS3试剂购自Sigma；Bio-Rad蛋白纯化仪的LP系统购自美国伯乐Bio-Rad，其为液相色谱，设备型号为：BioLogicLP。羊血清购自四季青，小鼠血清购自春雷杰创。
Acridan试剂为的主要成分为9，10-二氢吖啶，购自Lumigen；激发液、隔离液购自Lumigen。底物液为APS-5(即：9-(4’-氯苯硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶二钠盐)，购自于Lumigen。人血清样本来自北京市顺义区医院，碱性磷酸酶购自Sigma-Aldrich。
磁分离试剂的制备
本申请的磁分离试剂的制备方法包括以下步骤：取羧基磁珠，用第一缓冲液多次清洗后备用；随后加入EDC试剂，使得羧基磁珠被活化，混合均匀后备用；将上述溶液用第一缓冲液清洗，即得到磁分离试剂。
其中，羧基磁珠的尺寸可以是1-3um，例如可以是2um。由于羧基磁珠的粒径较小，所以将羧基磁珠置于容器内时，为流体形态，因此在本申请的表述中，于羧基磁珠内添加的相关溶液的用量以羧基磁珠的体积计。
第一缓冲液为酸性缓冲液，可以是pH6.0的MES缓冲液。
以单体体积的羧基磁珠计，每次清洗羧基磁珠时第一缓冲液的用量为30-50mL，例如第一缓冲液的用量为35mL、40mL、45mL；用第一缓冲液清洗羧基磁珠的操作可以进行多次，例如清洗2-4次。
单位体积的羧基磁珠内EDC的加入量为4.5-5.5mg/mL，例如5mg/mL。
R1试剂的制备
R1试剂的制备方法，包括以下步骤：
S1-1、于磁分离试剂中加入抗红细胞抗体，以单位体积的羧基磁珠计，抗红细胞抗体的加入量为6-10mg/mL，充分混匀后反应28-32min，使得所述抗红细胞抗体和所述磁分离试剂交联，得到第一交联液，其中，第一交联液中含有负载了抗红细胞抗体的羧基磁珠；
S1-2、于第一交联液中加入用于结合未反应的活化氨基酸位点的含有胺基的氨基酸溶液后，于室温反应4.5-8min，于固相得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物；甘氨酸溶液后，S1-3、用第二缓冲液清洗步骤S1-2最终获得的交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物，随后加入第二缓冲液进行溶液的稀释，使得溶液中抗红细胞抗体的浓度为1.1-1.5mg/L，即得到R1试剂。
其中，步骤S1-1中，单位体积的羧基磁珠中抗红细胞抗体的加入量可以为6-10mg/mL，例如7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL；充分混匀后的反应时间可以为28-32min，如29min，30min，31min。步骤S1-2中，含有胺基的氨基酸溶液可以选择为甘氨酸溶液、Tris溶液(即三羟甲基氨基甲烷的溶液)，对含有胺基的氨基酸溶液的浓度和用量不做限制，只要达到使得未反应的活化氨基酸位点均结合有氨基酸即可。进一步地，当含有胺基的氨基酸溶液选择为甘氨酸溶液的浓度可以为1M、2M、3M；选择1M甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110)：1000，例如100：1000；加入甘氨酸溶液后，反应时间至少为4.5min，可以选择为4.5-8min，例如5min，6min，7min。
Tris溶液，即三羟甲基氨基甲烷的溶液，配置为0.05mol/L的Tris-HCl溶液。Tris溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110)：1000，例如100：1000；加入Tris溶液后，反应时间至少为4.5min，可以选择为4.5-8min，例如5min，6min，7min。
HRP标记的BGP单抗溶液的制备
HRP标记的BGP单抗的制备方法，包括以下步骤：
S2-1、取BGP单抗和HRP，分别加入第五缓冲液后进行脱盐处理，得到BGP单抗溶液和HRP溶液，其中，BGP单抗和HRP的质量比为1:(1.2-1.3)；
S2-2、将BGP单抗溶液和HRP溶液混合到一起并浓缩，得到第一浓缩液，第一浓缩液中包含BGP单抗和HRP，第一浓缩液中BGP单抗的浓度为0.9-1.0mg/mL；
S2-3、于步骤S2-2中得到的第一浓缩液里加入BS3试剂，充分混匀并在35-37℃的水浴条件下反应1.7-2.3h，使得BGP单抗和HRP交联，得到第二交联液，第二交联液中含有HRP标记的BGP单抗；其中，BS3试剂和BGP单抗的质量比为(0.4-0.5)：1；
S2-4、于步骤S2-3获得的第二交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，用于结合溶液中未反应的活化氨基酸位点，随后在室温条件下至少反应20min；
S2-5、对步骤S2-4最终获得的溶液进行蛋白纯化后，收集含有HRP标记的BGP单抗的第一纯化液并浓缩，得到第二浓缩液，第二浓缩液中HRP标记的BGP单抗的浓度为0.9-1.0mg/mL，即得HRP标记的BGP单抗。
其中，步骤S2-1中，第五缓冲液为碱性缓冲液，可以为pH7.2的PB磷酸盐缓冲液；BGP单抗和HRP的质量比可以为1：(1.2-1.3)，例如1：1.25。步骤S2-2中，第一浓缩液中BGP单抗的浓度可以为0.9-1.0mg/mL，例如0.95mg/mL。步骤S2-3中，水浴的时间可以为1.7-2.3h，例如1.8h，1.9h，2.0h，2.1h，2.2h；BS3试剂和BGP单抗的质量比可以为(0.4-0.5)：1，例如0.45：1。步骤S2-4中，含有胺基的氨基酸溶液可以选择为甘氨酸溶液、Tris溶液，对含有胺基的氨基酸溶液的浓度和用量不做限制，只要达到使得未反应的活化氨基酸位点均结合有氨基酸即可。进一步地，当含有胺基的氨基酸溶液选择为甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液的浓度可以为1M、2M、3M；选择1M甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液与第二交联液的体积比可以为(90-110)：1000，例如100：1000。加入含有胺基的氨基酸溶液后，反应时间至少为20min，可以选择为20-25min，25-35min，例如22min，24min，26min，28min。步骤S2-5中，第二浓缩液中HRP标记的BGP单抗的浓度可以为0.9-1.0mg/mL，例如0.95mg/mL。
Tris溶液，即三羟甲基氨基甲烷的溶液，配置为0.05mol/L的Tris-HCl溶液。Tris溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110)：1000，例如100：1000；加入Tris溶液后，反应时间至少为4.5min，可以选择为4.5-8min，例如5min，6min，7min。
R2试剂的制备
R2试剂的制备包括以下步骤：于制备得到的HRP标记的BGP单抗溶液(即上述制备得到的HRP标记的BGP单抗浓度为0.9-1.0mg/mL的溶液)中加入第三缓冲液，使得HRP标记的BGP单抗的浓度为0.015-0.025mg/L，最终得到的溶液即为R2试剂。
其中，HRP标记的BGP单抗的浓度可以为0.015-0.025mg/L，例如0.017mg/L，0.019mg/L，0.021mg/L，0.023mg/L。
Acridan标记的BGP单抗溶液
Acridan标记的BGP单抗溶液的制备方法包括以下步骤：
S3-1、取BGP单抗，用第六缓冲液冲洗后做脱盐处理并浓缩，得到第三浓缩液，第三缩液中BGP单抗的浓度为5-8mg/mL；
S3-2、于第三浓缩液中加入Acridan试剂，充分混匀后在35-37℃的水浴条件下至少反应0.8h，得到第三交联液，第三交联液中含有Acridan标记的BGP单抗；其中，Acridan试剂和BGP单抗的质量比为(0.15-0.25)：1；
S3-3、于第三交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，用于结合未反应的活化氨基酸位点，随后在室温条件下反应17-23min；
S3-4、将步骤S3-3最终得到的溶液进行脱盐处理，即得到Acridan标记的BGP单抗；其中，Acridan标记的BGP单抗浓度为0.9-1.0mg/mL。
其中，步骤S3-1中，第六缓冲液为碱性缓冲液即可，例如可以为pH7.2的PB磷酸盐缓冲液；第三浓缩液中BGP单抗的浓度可以为5-8mg/mL，例如5.5mg/mL，6mg/mL，6.5mg/mL，7mg/mL，7.5mg/mL。步骤S3-2中，Acridan试剂和BGP单抗的质量比可以为(0.15-0.25)：1，例如0.15：1，0.17：1，0.19：1，0.21：1；水浴时间至少为0.8h，可以为0.8-1.2h，例如0.9h，1.0h，1.1h。步骤S3-3中，含有胺基的氨基酸溶液可以选择为甘氨酸溶液、Tris溶液，对含有胺基的氨基酸溶液的浓度和用量不做限制，只要达到使得未反应的活化氨基酸位点均结合有氨基酸即可。进一步地，当含有胺基的氨基酸溶液选择为甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液的浓度可以为1M、2M、3M；选择1M甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液与第三交联液的体积比可以为(90-110)：1000，例如100：1000。加入含有胺基的氨基酸溶液后，反应时间至少为20min，可以选择为20-25min，25-35min，例如22min，24min，26min，28min。
Tris溶液，即三羟甲基氨基甲烷的溶液，配置为0.05mol/L的Tris-HCl溶液。Tris溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110)：1000，例如100：1000；加入Tris溶液后，反应时间至少为4.5min，可以选择为4.5-8min，例如5min，6min，7min。
R3试剂的制备
R3试剂的制备方法包括以下步骤：于上述制备得到的Acridan标记的BGP单抗溶液(即上述制备得到的Acridan标记的BGP单抗浓度为0.9-1.0mg/mL的溶液)中加入第四缓冲液，使得Acridan标记的BGP单抗的浓度为0.015-0.025mg/L，即为R3试剂。
其中，Acridan标记的BGP单抗的浓度可以为0.015-0.025mg/L，例如0.017mg/L，0.019mg/L，0.021mg/L，0.023mg/L。
一种全血检测胸苷激酶1的化学发光免疫检测方法
一种全血检测胸苷激酶1的化学发光免疫检测方法，包括以下步骤：
Ⅰ、取人全血样本加入到洁净的样本杯中，随后加入生理盐水和R1试剂，使得R1试剂中的负载于羧基磁珠上的抗红细胞抗体和人全血样本中的红细胞特异性结合，并均负载于羧基磁珠上，此时，固相上存在的是羧基磁珠、抗红细胞抗体和红细胞。在反应大于3min后，至少进行2min的磁分离处理，然后弃去固相(即羧基磁珠、抗红细胞抗体和红细胞)，得到磁分离溶液；其中，生理盐水的加入只要能够维持人全血样本的渗透压即可，R1试剂和人全血样本的体积比为(3-9)：10；
Ⅱ、随后将磁分离溶液置于洁净的反应杯中；在反应杯中加入R2试剂和R3试剂，随后在水浴条件下至少孵育15min后，使得待检测样本中同一BGP上同时特异性结合有HRP标记的BGP单抗和Acridan标记的BGP单抗，得到第四交联液，第四交联液中含有HRP标记的BGP单抗-BGP-Acridan标记的BGP单抗的复合物；其中，R2试剂和磁分离溶液的体积比为(9-15)：6，R3试剂和磁分离溶液的体积比为(11-15)：6；
Ⅲ、于第四交联液中加入的激发液和的隔离液后，在25-30s后测定发光值；其中，激发液和磁分离溶液的体积比为(9-13)：6，隔离液和磁分离溶液的体积比为(9-13)：6；
Ⅳ、以所述标准品为待测样品，进行步骤Ⅰ-Ⅲ，测定其发光值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中BGP的含量。
其中，步骤Ⅰ中，于人全血样本中加入生理盐水和R1试剂后，反应时间至少为3min，主要使得人全血样本中的红细胞维持正常的渗透压，反应时间可以为3-5min，可以为5-10min；随后的磁分离处理时间至少为2min，可以为2-5min；R1试剂和人全血样本的体积比可以为(3-9)：10，可以为(3-6)：10，可以为(6-9)：10，例如2：10，4：10，8：10。
步骤Ⅱ中，在反应杯中加入R2试剂和R3试剂后，水浴时间至少为15min，可以为15-20min，20-25min，例如18min，23min，28min；R2试剂和磁分离溶液的体积比可以为(9-15)：6，可以为(11-13)：6，例如10：6，12：6；R3试剂和磁分离溶液的体积比可以为(11-15)：6，可以为(11-13)：6，例如10：6，12：6。
步骤Ⅲ中，激发液和磁分离溶液的体积比可以为(9-11)：6，可以为(11-13)：6，例如10：6，12：6；隔离液和磁分离溶液的体积比可以为(9-11)：6，可以为(11-13)：6，例如10：6，12：6。
制备例
磁分离试剂的制备例
磁分离试剂的制备方法，具体包括以下步骤：
取50uL的羧基磁珠，用第一缓冲液清洗，本制备中选择的第一缓冲液为pH6.0的MES缓冲液，将羧基磁珠清洗3次，每次MES缓冲液的加入量为2mL，弃去清洗液后留有羧基磁珠备用。称取5mg的EDC试剂，加入到1mL的pH6.0的MES溶液中，得到EDC试剂-MES溶液，EDC试剂-MES溶液中EDC的含量为5mg/mL，混合均匀后备用。
将上述获得的EDC试剂-MES溶液全部加入到上述备用的羧基磁珠中，使得羧基磁珠被活化，得到的最终溶液为磁分离试剂。该活化过程使得羧基磁珠上具有结合氨基酸的活化氨基酸位点，以便在后期能够结合相关的氨基酸或蛋白质。
R1试剂的制备例
R1试剂的制备方法，即为磁珠标记的抗红细胞抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
S1-1、于制备例1中得到的1mL的磁分离试剂中加入0.4mg的抗红细胞抗体，充分混匀后反应30min，由于活化的羧基磁珠上具有结合氨基酸的活化氨基酸位点，因此抗红细胞抗体能够和羧基磁珠上的活化氨基酸位点非特异性结合，即完成抗红细胞抗体和羧基磁珠的交联，得到第一交联液，第一交联液中含有负载了抗红细胞抗体的羧基磁珠。
S1-2、于第一交联液中加入甘氨酸溶液，用于结合羧基磁珠上未结合到抗红细胞抗体的活化氨基酸位点。然后通过磁吸附的操作，留下固相，弃去液相，即得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物该羧基磁珠上交联有抗红细胞抗体。其中，本制备例中添加的是100uL的1M甘氨酸溶液，随后于室温反应5min，步骤S1-1和步骤S1-2实现了羧基磁珠和抗红细胞抗体的稳固交联。
S1-3、用第二缓冲液清洗步骤S1-2最终获得的羧基磁珠(该羧基磁珠上交联有抗红细胞抗体)，清洗3次，每次清洗的缓冲液用量为2mL。然后通过磁分离处理后留有羧基磁珠，弃去清洗液。最后于羧基磁珠内加入20mL的第二缓冲液，配置为使用液。第二缓冲液的加入主要实现了羧基磁珠和抗红细胞抗体在交联后的封闭及保存。本制备例中选择的第二缓冲液，是将TRIS、NaCl、NaN3、Tween-20以及BSA-V分别加入至纯水中，即配置得到第二缓冲液，即第二缓冲液为pH 8.0的含有0.01M TRIS，0.2M NaCl，0.005M NaN3，0.01％(w/w)Tween-20和0.1％(w/w)BSA-V的溶液。
S1-4、于步骤S1-3制备得到的使用液中加入第二缓冲液以将使用液稀释，使得稀释液中抗红细胞抗体的浓度为1.4mg/L，即得到R1试剂。
HRP标记的BGP单抗溶液的制备例
HRP标记的BGP单抗溶液的制备方法，包括以下步骤：
S2-1、取1mg的BGP单抗和1.25mg的HRP，分别用第五缓冲液冲洗后进行脱盐处理，本实施例的第五缓冲液选择为pH7.2的PB磷酸盐缓冲液，本制备例中以下步骤里提到的PB磷酸盐缓冲液均为pH7.2的PB磷酸盐缓冲液。
(i)获得脱盐处理的BGP单抗溶液：
将1mg的BGP单抗加入0.2mL的PB磷酸盐缓冲液中，混匀；
上样：在一次性PD-10纯化柱的柱子平衡后，取0.2mL的上述的溶解有BGP单抗的PB磷酸盐缓冲液一次性自PD-10纯化柱的柱顶处添加，进行BGP单抗的脱盐纯化；
洗脱：待添加的样品全部进入PD-10纯化柱内后，自柱顶加入2.3mL的PB磷酸盐缓冲液，待缓冲液全部进入纯化柱后再加入2.5mL的PB磷酸盐缓冲液洗脱得到脱盐处理的BGP单抗溶液。
(ii)获得脱盐处理的HRP溶液：
将1.25mg的HRP加入0.2mL的PB磷酸盐缓冲液中，混匀，得到HRP溶液；
上样：在一次性PD-10纯化柱的柱子平衡后，取0.2mL上述的HRP溶液自PD-10纯化柱的柱顶添加至PD-10纯化柱内，进行脱盐纯化；
洗脱：待上述添加的样品全部进入PD-10纯化柱内后，自柱顶加入2.3mL的PB磷酸盐缓冲液，待缓冲液全部进入PD-10纯化柱后再加入2.5mL的PB磷酸盐缓冲液洗脱得到脱盐处理的HRP溶液。
上述的步骤(i)和(ii)的脱盐处理分别实现了BGP的脱盐纯化和HRP的脱盐纯化。
S2-2、将经过脱盐处理的BGP单抗溶液和脱盐处理的HRP溶液混合到一起并采用GE的10K的离心浓缩管进行离心浓缩，使得最终溶液的体积浓缩到1mL，得到第一浓缩液，第一浓缩液中BGP单抗的浓度为0.9mg/mL。
S2-3、于通过步骤S2-2得到的第一浓缩液中加入0.45mg的交联剂BS3试剂，充分混匀，并在37℃的水浴条件下反应2.2h，使得BGP单抗和HRP交联，得到第二交联液，第二交联液中含有HRP标记的BGP单抗，第二交联液的体积为1mL。
S2-4、于步骤S2-3中获得的第二交联液中加入100uL的1M甘氨酸溶液，在室温条件下反应20min，以结合HRP上未结合有BGP单抗的活化氨基酸位点，使得HRP和BGP单抗之间的交联更加稳固。
S2-5、使用Bio-Rad蛋白纯化仪的LP系统进行蛋白纯化，纯化柱为GE的Superdex200pg。上样前将步骤S2-4的溶液浓缩到500uL以内，本制备例将步骤S2-4的溶液浓缩至450uL。
S2-6、纯化仪流速设置为1mL/min，收集40-65min之间的纯化峰对应的蛋白质溶液，混匀后得到第一纯化液；将第一纯化液浓缩至0.9mL，得到第二浓缩液，通过紫外分光光度计测得第二浓缩液中HRP标记的BGP单抗的浓度为0.93mg/mL；随后于第二浓缩液中加入0.9mL的甘油，充分混匀后放于-20℃冰箱中冷冻备用。
以上步骤S2-1～S2-6，即制备得到HRP标记的BGP单抗溶液。
R2试剂的制备例
R2试剂的制备方法，包括以下步骤：于上述制备得到的HRP标记的BGP单抗溶液内加入第三缓冲液，以将上述步骤S2-6最终得到的溶液稀释，使得HRP标记的BGP单抗的浓度为0.023mg/L，此稀释后的溶液即为R2试剂。本制备例中的第三缓冲液是将pH8.0的TRIS、NaCl、青霉素、羊血清和小鼠血清分别加入至纯水中，配置得到0.01M TRIS，0.015M NaCl，0.001M青霉素，0.1％羊血清和0.01％小鼠血清的溶液。第三缓冲液的加入主要实现了交联后HRP标记的BGP单抗封闭和稳定。
Acridan标记的BGP单抗溶液的制备例
Acridan标记的BGP单抗溶液的制备方法，包括以下步骤：
S3-1、取1mg的BGP单抗，加入第六缓冲液之后做脱盐处理，使用的纯化柱是一次性PD-10纯化柱。其具体的纯化步骤同R2试剂的制备例中的步骤S2-1(i)，最终得到脱盐处理的BGP单抗溶液。本制备例中第六缓冲液选择为pH7.2的PB磷酸盐缓冲液。
将上述最终得到的脱盐处理的BGP单抗溶液浓缩到0.9mL，得到第三浓缩液，且第三浓缩液中BGP单抗的浓度为6mg/mL。当溶液中BGP单抗的浓度较大时，BGP单抗的稳定性更高。
S3-2、于通过步骤S3-1得到的第三浓缩液内加入0.2mg的Acridan试剂，充分混匀后在37℃的水浴条件下反应1h，使得BGP单抗和Acridan试剂交联，得到第三交联液，第三交联液内含有Acridan标记的BGP单抗。同时，第三交联液中可能含有还未完全结合有BGP单抗的Acridan试剂，这部分Acridan试剂上存在未反应的活化氨基酸位点，会影响Acridan试剂和BGP单抗之间的交联稳定性，此未反应的活化氨基酸位点在以下步骤中进一步处理。
S3-3、于步骤S3-2中最终得到的第三交联液中加入100uL的1M甘氨酸溶液，在室温条件下反应20min，使得步骤S3-3中Acridan试剂上的未反应的活化氨基酸位点，全部结合有甘氨酸，进一步稳定了Acridan试剂和BGP单抗之间的交联稳定性。
S3-4、将步骤S3-3最终得到的溶液，使用PD-10纯化柱进行脱盐处理，获得脱盐处理的Acridan标记的BGP单抗溶液的具体步骤为：
上样：在PD-10纯化柱的柱子平衡后，将步骤S3-3最终得到的溶液取0.6mL加到一次性PD-10纯化柱的柱子顶上，行脱盐纯化；
洗脱：样品全部进入PD-10纯化柱内后，自柱顶加入2mL的PB磷酸盐缓冲液，待PB磷酸盐缓冲液全部进入纯化柱后再加入2.5mL的PB磷酸盐缓冲液洗脱得到脱盐处理的Acridan标记的BGP单抗溶液。
收集1mL经脱盐处理的Acridan标记的BGP单抗溶液，通过紫外分光光度计测得其中的Acridan标记的BGP单抗的浓度为1.0mg/mL，同时加入0.9mL的甘油，充分混匀后放于-20℃的冰箱冷冻备用。
以上步骤S3-1～S3-4，即制备得到Acridan标记的BGP单抗溶液。
R3试剂的制备例
R3试剂的制备方法，包括以下步骤：与上述制备得到的Acridan标记的BGP单抗溶液中加入第四缓冲液，将上述步骤S3-4最终得到的溶液稀释，使得Acridan标记的BGP单抗的浓度为0.025mg/L，此稀释后的溶液即为R3试剂。本制备例中的第四缓冲液是用TRIS、NaCl、青霉素、羊血清和小鼠血清分别加入至纯水中，配置得到pH8.0的0.01M TRIS，0.015MNaCl，0.001M青霉素，0.1％羊血清，0.01％小鼠血清的溶液。第四缓冲液的加入主要实现了在Acridan试剂和BGP单抗交联后的封闭和稳定。
碱性磷酸酶标记的BGP单抗的制备例
本制备例与HRP标记的BGP单抗的制备例的区别在于，本制备例以等量的碱性磷酸酶替换HRP标记的BGP单抗的制备例中的HRP，其它同HRP标记的BGP单抗的制备例的操作。
磁珠标记的BGP单抗的制备例
本制备例与磁分离试剂的制备例的区别在于，本制备例以等量的BGP单抗替换磁分离试剂的制备例中的抗红细胞抗体，其它同磁分离试剂的制备例的操作。
实施例
本实施例提供了一种检测钙骨素的试剂盒，本申请的试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、R4试剂和校准品。其中R1试剂为磁分离试剂、浓度为1.3mg/L的抗红细胞抗体、tween-20和BSA-V的混合物；R1试剂盛放于试剂瓶内，且R1试剂的装量为6mL。R2试剂为0.02mg/L的辣根过氧化物酶标记的BGP单抗，羊、小鼠血清的混合物；R2试剂盛放于试剂瓶内，且R2试剂的装量为12mL。R3试剂为0.02mg/L的Acridan标记的BGP单抗，羊、小鼠血清的混合物；R3试剂盛放于试剂瓶内，且R3试剂的装量为12mL。试剂R4为生理盐水；R4试剂盛放于试剂瓶内，其装量为20mL。校准品包括浓度分别为0ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL的骨钙素抗原溶液。
本申请的全血检测BGP的试剂盒的组成具体见表1。
表1本实施例的BGP试剂盒的组成
Figure BDA0003549421960000151
一种全血检测胸苷激酶1的检测方法，包括以下步骤：
Ⅰ、取获取得到的人全血样本100uL加入到洁净的样本杯中，随后加入100uL的R4试剂和60uL的R1试剂，反应3min，然后磁分离1min后，弃去固相，得到反应液A；取60uL反应液A到一个洁净的反应杯中并丢弃样本杯。
Ⅱ、在反应杯中加入120uL的R2试剂和120uL的R3试剂，随后在37℃的条件下孵育6min后，得到反应液B。在该步骤中，R2试剂中的HRP标记的BGP单抗、反应液A中的BGP、R3试剂中的Acridan标记的BGP单抗反应后生成HRP标记的BGP单抗-BGP-Acridan标记的BGP单抗复合物。
Ⅲ、于步骤S2中得到的反应液B中加入100uL的激发液和100uL的隔离液后，在30s后使用滨松光子的BHP9507测定仪测定发光值。
Ⅳ、以不同浓度的标准品为待测样品，进行步骤Ⅰ-Ⅲ，测定其发光值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中BGP的含量。
R1试剂通过R1试剂的制备例制备得到；R2试剂通过R2试剂的制备例制备得到；R3试剂通过R3试剂的制备例制备得到。
对比例
本对比例和实施例的区别在于，本对比例是采用另一种检测方法检测人血中BGP含量，采用商用的BGP试剂盒，购自新产业生物。本对比例采用常规的磁微粒化学发光法检测BGP含量，其他公司的类似产品在加样量，孵育时间上存在差异，但整体流程相同，包括以下步骤：
步骤一：直接使用采血管取样，将采集得到的全血样本在3000rpm的转速下离心25min，取上清液于洁净的样本杯中，得到血清样本。
步骤二：取15uL的血清标本于一洁净的反应管中，于血清样本中加入120uL的碱性磷酸酶标记的BGP单抗，60uL羧基磁珠标记的BGP单抗和120uL的第四缓冲液，得到溶液Ⅰ；随后在37℃的条件下孵育15min。在该反应中，血清终的BGP单抗完全反应。碱性磷酸酶标记的BGP单抗和BGP(血清样本中的BGP)特异性结合，羧基磁珠标记的BGP单抗和BGP(血清样本中的BGP)上的其它结合位点特异性结合，最终形成磷酸酶标记的BGP单抗-BGP-羧基磁珠标记的BGP单抗复合物。
其中，碱性磷酸酶标记的BGP单抗通过碱性磷酸酶标记的BGP单抗的制备例制备得到，羧基磁珠标记的BGP单抗是通过磁珠标记的BGP单抗的制备例制备得到。
步骤三：将步骤二中获得的溶液用磁性架吸附1min，羧基磁珠被吸附，随后丢弃液相中的剩余液。此处的羧基磁珠是磷酸酶标记的BGP单抗-BGP-羧基磁珠标记的BGP单抗复合物，被吸附在磁性架上；而血清中的其它杂质以及未反应的碱性磷酸酶-TK 1单抗被保留在剩余液中。该过程实现了将羧基磁珠(磷酸酶标记的BGP单抗-BGP-羧基磁珠标记的BGP单抗复合物)和杂质的分离。同时，被吸附在磁性架上的磷酸酶标记的BGP单抗-BGP-羧基磁珠标记的BGP单抗复合物，由于羧基磁珠外表面上还黏附有血清中的杂质物质等(该部分杂质会对后期的发光反应产生干扰)，这部分杂质有待在接下来的步骤中去除。
然后加入400uL清洗液，震荡混匀，实现清洗羧基磁珠(羧基磁珠是磷酸酶标记的BGP单抗-BGP-羧基磁珠标记的BGP单抗复合物)的目的，将羧基磁珠外表面上非特异性吸附的血清中的杂质物质等去除。其中，清洗液为含0.1％Tween-20的生理盐水。
步骤四：重复步骤三4次。
步骤五：用磁性架吸附1min，随后吸取反应管中的剩余液，清除剩余液体，保留羧基磁珠，此处的羧基磁珠上负载磷酸酶标记的BGP单抗和BGP，即为磷酸酶标记的BGP单抗-BGP-羧基磁珠标记的BGP单抗复合物。
然后于羧基磁珠内加入200uL底物液APS-5，底物液中含有发光底物APS-5，震荡混匀后进行检测即可。
检测方法的验证
采取获得同样的人全血样本，分别采用实施例和对比例的方法进行人血中BGP的含量测定。使用实施例的BGP试剂盒，按照实施例的BGP检测方法制备得到的样本，采用HM240全自动分析系统进行检测；使用对比例的BGP试剂盒，按照对比例的BGP检测方法制备得到的样本，采用Axceed 260全自动化学发光免疫系统进行检测。
(1)检测时间比较
和采用对比例的检测方法进行人全血中BGP含量的方法相比，采用实施例的检测方法，其总的操作及反应时间比对比例的方法短，即检测一个人全血样本中BGP的含量的总用时少，各个处理阶段的具体用时见表2。
表2实施例和对比例两种检测方法的各个处理阶段的用时
Figure BDA0003549421960000181
注：实施例中的孵育时间即为实施例步骤S1中所述的反应时长(3min)、磁分离时长(1min)和步骤S2中所述的孵育时长(6min)的总和时间，即10min。
从表2的数据看出，采用实施例的方法进行人全血中BGP含量测定时，由于实施例的方法能够针对人全血样本直接进行检测，不需要增加人全血样本的离心处理，因此在获取人全血样本后，整个检测时间仅花费676s，即11.3min；而采用传统的磁微粒化学发光法进行人血中BGP含量测定时，首先要做的就是对获取得到的人全血进行离心处理，随后获得血清样本后再进行其它的操作，而仅仅离心这一步骤就用时15min，接近于实施例的检测方法的总用时；且采用对比例的检测方法，其总用时达1711s，即28.5min。
(2)线性比对
取BGP标准品配置BGP标准溶液，BGP的浓度(pmol/L)分别为：0ng/mL、2.5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL、300ng/mL。分别使用实施例的BGP试剂盒和检测方法、对比例的BGP试剂盒和检测方法进行检测，分别得到对应BGP浓度的发光数值，具体结果见表3。通过表3的结果，分析两种检测方法的线性回归。
表3实施例和对比例的检测方法的线性回归的对比
Figure BDA0003549421960000191
将表3的结果计算后，实施例中检测方法的一元线性标准曲线的方程为：y＝5988.7x-1434.2，R2＝0.9999；对比例中检测方法的一元线性标准曲线的方程为：y＝6076.2x-5631.3，R2＝0.9999。从该结果看出，本申请的检测方法和现有的检测方法的线性回归相似；且两种方法的一元线性标准曲线的R2均为0.9999，表明本申请的检测方法的线性回归和现有的对比例的方法相比，无明显差异。
(3)灵敏度比对
表4实施例和对比例的检测方法的灵敏度对比
检测方法 灵敏度(<u>ng/mL</u>)
实施例 0.5
对比例 1
表4的结果表明，本申请实施例的方法能够获得更高的检测灵敏度。出现这种结果的可能原因为：实施例的方法为纯液相反应，各个反应物之间的反应进行地高效完全。而对比例中存在的固相的非特异性吸附的反应底物(羧基磁珠标记的BGP，羧基磁珠和BGP之间是非特异性吸附)，使得反应不够完全、充分。因此实施例的方法灵敏度优于传统方法。
进一步具体的解释为：实施例的方法中，参与反应的底物有：HRP标记的BGP单抗、BGP、Acridan标记的BGP单抗，三者交联后得到HRP标记的BGP单抗-BGP-Acridan标记的BGP单抗复合物，所有反应均在液相中进行。而对比例的方法中，参与反应的底物为：碱性磷酸酶标记的BGP单抗、BGP、羧基磁珠标记的BGP单抗，三者交联得到碱性磷酸酶标记的BGP单抗-BGP-羧基磁珠标记的BGP单抗复合物。其中，碱性磷酸酶标记的BGP单抗和BGP的结合为抗原(BGP)和抗体(碱性磷酸酶标记的BGP单抗)之间的特异性吸附，该反应在液相中进行；BGP和羧基磁珠标记的BGP单抗之间的结合是液相(血清中BGP)和固相(羧基磁珠标记的BGP单抗)之间的特异性吸附反应；且羧基磁珠标记的BGP单抗本身在制备时，BGP和羧基磁珠的连接是非特异性吸附连接，本身会存在羧基磁珠上用于结合氨基酸的活化氨基酸位点上没有结合到BGP单抗(有部分活化氨基酸位点结合了甘氨酸)；除此以外，BGP单抗和羧基磁珠的结合是非特异性结合，不够牢固。因此，实施例中纯液相的反应和对比例的反应相比，底物稳定性更强、反应更完全，因此其灵敏度更高。
(4)临床样本对比
同时本申请对比了使用实施例的BGP检测方法和对比例的(对比例中的检测方法即商用的BGP检测方法)BGP检测方法对临床样本的测试结果。临床样本为不大于250ng/mL的样本，在每个区间段选取了10例样本进行比对测试。
表5检测不同浓度范围的BGP时实施例和对比例方法的符合率结果对比
浓度范围(<u>ng/mL</u>) 0-2.5 2.5-10 10-50 50-150 150-250
实施例的R<sup>2</sup>值 0.92 0.92 0.99 0.96 0.95
对比例的R<sup>2</sup>值 0.94 0.92 0.96 0.95 0.99
本申请对比了在不同浓度范围内的BGP血清临床样本，发现使用本申请实施例的BGP检测方法，在0-250ng/mL的范围内其符合率和对比例中的检测方法相比，两种方法接近，证明本实施例方法的可重复性、再现性较好。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种检测钙骨素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、生理盐水、R1试剂、R2试剂以及R3试剂；其中，所述R1试剂包括能够与人全血中的红细胞特异性结合的抗红细胞抗体以及能够结合抗红细胞抗体的磁分离试剂；所述R2试剂包括HRP标记的BGP单抗的溶液；所述R3试剂包括Acridan标记的BGP单抗的溶液；所述校准品包括包括浓度为0 ng/mL、2.5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL的骨钙素抗原溶液。
2.根据权利要求1所述的一种检测钙骨素的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂的制备方法包括以下步骤：将粒径为1-3 um的羧基磁珠，经第一缓冲液清洗，随后利用EDC试剂活化，接着进行稀释，即得到磁分离试剂。
3.根据权利要求2所述的一种检测钙骨素的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的制备方法包括以下步骤：
S1-1、于所述磁分离试剂中加入所述抗红细胞抗体，单位体积的所述羧基磁珠中所述抗红细胞抗体的加入量为6-10 mg/mL，充分混匀后反应28-32 min，使得所述抗红细胞抗体和所述羧基磁珠交联，得到第一交联液；
S1-2、于所述第一交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，以使所述羧基磁珠上未反应的活化氨基酸位点完全反应，随后经磁吸附处理，于固相得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物；
S1-3、用第二缓冲液对所述羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物进行清洗后，于固相内加入所述第二缓冲液，即得到所述R1试剂，其中，所述R1试剂中所述抗红细胞抗体的浓度为1.1-1.5 mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种检测钙骨素的试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的BGP单抗溶液的制备方法包括以下步骤：
S2-1、取质量比为1:（1.2-1.3）的BGP单抗和HRP分别做脱盐处理后，将分别含有两种蛋白质的溶液混合并浓缩，得到第一浓缩液，所述第一浓缩液中含有BGP单抗和HRP；
S2-2、于所述第一浓缩液里加入BS3试剂，并在水浴环境下反应，使得BGP单抗和HRP交联，得到第二交联液，所述第二交联液中含有HRP标记的BGP单抗；其中，所述BS3试剂和BGP单抗的质量比为（0.4-0.5）：1；
S2-3、于所述第二交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得未反应的活化氨基酸位点完全反应；
S2-4、对步骤S2-3最终获得的溶液进行蛋白纯化，收集HRP标记的BGP单抗的第一纯化液并浓缩，使得浓缩液中HRP标记的BGP单抗的浓度为0.9-1.0 mg/mL，即得HRP标记的BGP单抗溶液。
5.根据权利要求4所述的一种检测钙骨素的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂的制备方法包括以下步骤：于所述HRP标记的BGP单抗溶液中加入第三缓冲液，使得所述HRP标记的BGP单抗的浓度为0.015-0.025 mg/L，最终得到的溶液即为所述R2试剂。
6.根据权利要求1所述的一种检测钙骨素的试剂盒，其特征在于，所述Acridan标记的BGP单抗溶液的制备方法包括以下步骤：
S3-1、取BGP单抗进行脱盐处理，得到脱盐处理的BGP单抗溶液；
S3-2、将所述脱盐处理的BGP单抗溶液浓缩后，BGP单抗的浓度为5-7 mg/mL；随后加入交联剂Acridan试剂反应后，得到第三交联液，所述第三交联液中含有Acridan标记的BGP单抗；其中，所述Acridan试剂和BGP单抗的质量比为（0.15-0.25）：1；
S3-3、于所述第三交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得溶液内未反应的活化氨基酸位点完全反应；
S3-4、将步骤S3-3最终得到的溶液进行脱盐处理后，即得到Acridan标记的BGP单抗溶液，其中，Acridan标记的BGP单抗浓度为0.9-1.0 mg/mL。
7.根据权利要求6所述的一种检测钙骨素的试剂盒，其特征在于，所述R3试剂的制备方法包括以下步骤：于所述Acridan标记的BGP单抗中加入第四缓冲液，使得Acridan标记的BGP单抗的浓度为0.015-0.025 mg/L，最终得到的溶液即为得到R3试剂。
8.权利要求1-7任一所述的一种检测钙骨素的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
Ⅰ、取人全血样本，随后于人全血样本中加入所述生理盐水和所述R1试剂，在反应时间大于3 min后，进行磁分离处理，收集液相；
Ⅱ、于所述液相中加入所述R2试剂和所述R3试剂，在35-37℃的条件下孵育5-7 min后，实现BGP和HRP标记的BGP单抗、Acridan标记的BGP单抗的同时交联，得到第四交联液，所述第四交联液中含有HRP标记的BGP单抗-BGP-Acridan标记的BGP单抗的复合物；
Ⅲ、准备激发液和隔离液，于所述第四交联液中加入所述激发液和所述隔离液后，测定发光值即可；
Ⅳ、以所述标准品为待测样品，进行步骤Ⅰ-Ⅲ，测定其发光值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中BGP的含量。
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