JPH0694713A - アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンｉｉｉ活性の測定キット - Google Patents
アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンｉｉｉ活性の測定キットInfo
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- JPH0694713A JPH0694713A JP3287371A JP28737191A JPH0694713A JP H0694713 A JPH0694713 A JP H0694713A JP 3287371 A JP3287371 A JP 3287371A JP 28737191 A JP28737191 A JP 28737191A JP H0694713 A JPH0694713 A JP H0694713A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】特殊な検査機器、施設を必要とせず、短時間で
検査のできる高感度のアンチトロンビンＩＩＩの測定方
法を提供する。 【構成】被検検体中のアンチトロンビンＩＩＩと遊離型
ヘパリンを結合させ、ヘパリン・アンチトロンビンＩＩ
Ｉ複合体を形成させ、次に、同複合体を活性型凝固因子
または、トロンビンを、共有結合または、非特異吸着に
より、担体に固定化した器具に結合させ、更に、標識抗
原（標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、
または、標識抗体（標識抗ヘパリン・アンチトロンビン
ＩＩＩ複合体抗体）を用いて定量する。
検査のできる高感度のアンチトロンビンＩＩＩの測定方
法を提供する。 【構成】被検検体中のアンチトロンビンＩＩＩと遊離型
ヘパリンを結合させ、ヘパリン・アンチトロンビンＩＩ
Ｉ複合体を形成させ、次に、同複合体を活性型凝固因子
または、トロンビンを、共有結合または、非特異吸着に
より、担体に固定化した器具に結合させ、更に、標識抗
原（標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、
または、標識抗体（標識抗ヘパリン・アンチトロンビン
ＩＩＩ複合体抗体）を用いて定量する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアンチトロンビンＩＩＩ
活性の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンＩＩＩ
活性の測定キットに関する。
活性の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンＩＩＩ
活性の測定キットに関する。
【０００２】
【従来技術】血液凝固、線溶、キニン遊離、補体等の反
応系では、多数の血中プロテアーゼが密接に関連して機
能している。血液中の抗凝固因子として、アンチトロン
ビンＩＩＩ、α２−マクログロブリン、その他複数の因
子が存在するが、特に、アンチトロンビンＩＩＩは最も
重要な働きをしている。アンチトロンビンＩＩＩは、ト
ロンビン、活性化第ＩＸ因子、活性化第Ｘ因子を不活化
する。特に、アンチトロンビンＩＩＩによる活性化第Ｘ
因子の不活化は、血液凝固の制御に最も効果的な働きを
している。アンチトロンビンＩＩＩは分子量６７，００
０で、４２５個のアミノ酸で構成されている単鎖の糖蛋
白で、電気泳動上α２グロブリンの位置に泳動される。
主な構造上の特徴は、アルギニン反応基とリジン残基に
ある。Ｃ末端に近いアルギニン反応基は、トロンビンを
始め、血液凝固第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第
ＸＩＩ因子等の活性型凝固因子やプラスミンなどのセリ
ン系蛋白分解酵素の活性中心であるセリンと反応し、複
合体を形成し、失活させる作用がある。一方、Ｎ末端に
近いリジン残基は主にヘパリンと結合し、オレイン酸
や、補体等とも結合する。このリジン残基にヘパリンが
結合することによってアンチトロンビンＩＩＩに構造変
化が起こり、セリン系蛋白分解酵素との反応が急速に進
行する。
応系では、多数の血中プロテアーゼが密接に関連して機
能している。血液中の抗凝固因子として、アンチトロン
ビンＩＩＩ、α２−マクログロブリン、その他複数の因
子が存在するが、特に、アンチトロンビンＩＩＩは最も
重要な働きをしている。アンチトロンビンＩＩＩは、ト
ロンビン、活性化第ＩＸ因子、活性化第Ｘ因子を不活化
する。特に、アンチトロンビンＩＩＩによる活性化第Ｘ
因子の不活化は、血液凝固の制御に最も効果的な働きを
している。アンチトロンビンＩＩＩは分子量６７，００
０で、４２５個のアミノ酸で構成されている単鎖の糖蛋
白で、電気泳動上α２グロブリンの位置に泳動される。
主な構造上の特徴は、アルギニン反応基とリジン残基に
ある。Ｃ末端に近いアルギニン反応基は、トロンビンを
始め、血液凝固第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第
ＸＩＩ因子等の活性型凝固因子やプラスミンなどのセリ
ン系蛋白分解酵素の活性中心であるセリンと反応し、複
合体を形成し、失活させる作用がある。一方、Ｎ末端に
近いリジン残基は主にヘパリンと結合し、オレイン酸
や、補体等とも結合する。このリジン残基にヘパリンが
結合することによってアンチトロンビンＩＩＩに構造変
化が起こり、セリン系蛋白分解酵素との反応が急速に進
行する。
【０００３】アンチトロンビンＩＩＩの測定方法は、生
物活性の測定方法と抗原量を検索する免疫学的測定法に
大別される。既知の測定方法を以下に示す。 Ａ．生物学的測定法 １．凝血学的測定法 ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定法 脱フィブリノゲン血漿または血清に一定量のトロンビン
を加え、放置した後、フィブリノゲンを加えて凝固時間
を測定する方法。 ｂ．ヘパリンコファクター活性測定法 凝血学的測定系に，ヘパリンを加え、アンチトロンビン
ＩＩＩ・ヘパリン複合体のトロンビン中和反応を凝血学
的に測定する方法。 ２．トロンビンアガロース平板法 トロンビンを含んだアガロース平板に穴を開け、被検血
漿を注入し、２４時間静置する。次いで、過熱溶解した
アガロースとフィブリノーゲンの混和液を平板上に重層
し、静置する。重層したフィブリノーゲンはアガロース
ゲル内で下層のトロンビンによりフィブリンに転化し、
白濁するが、検体孔の周囲に拡散したアンチトロンビン
ＩＩＩにより反応が阻止される。このゲル内でのフィブ
リノーゲン−フィブリンの転化阻止によって生じた透明
輪の大きさがアンチトロンビンＩＩＩの濃度を反映す
る。検体孔の周囲に生じた透明輪の直径を計測し、標準
アンチトロンビンＩＩＩ活性を算出する。 ３．合成基質法 被検血漿にヘパリンを加え、即効性に抗トロンビン作用
を示すアンチトロンビンＩＩＩ・ヘパリン複合体を形成
させる。ここに一定過剰のトロンビンを添加すると複合
体の量に比例してトロンビンが不活化される。次に、ト
ロンビンに特異的な合成ペプチド基質を添加すると、残
存トロンビンがこの基質をアミド分解してペプチド基質
のＮ末端に結合した発色基を遊離する。この発色基質を
比色定量することによりアンチトロンビンＩＩＩ活性を
求める。 Ｂ．免疫学的測定法 １．一次元免疫拡散法（ＳＲＩＤ）法 抗アンチトロンビンＩＩＩ血清を含んだアガロース平板
上に開けた検体孔に被検血漿を注入し、室温で２４〜４
８時間水平に静置する。標準アンチトロンビンＩＩＩ血
清を用いて同様の操作をして描いた検量線からアンチト
ロンビンＩＩＩ量（蛋白濃度）を求める。 ２．ローレル免疫電気泳動法 抗アンチトロンビンＩＩＩ血清を含んだアガロース平板
上に開けた検体孔に被検血漿を注入し、検体孔を陰極側
として電気泳動を行なう。生じたロケット状の沈降線の
高さは、被検血漿中のアンチトロンビンＩＩＩの蛋白濃
度に比例する。標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用い
て同様の操作をして描いた検量線からアンチトロンビン
ＩＩＩ量（蛋白濃度）を求める。 ３．ラテックス凝集法 スライドグラス上で、抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗
体を感作したラテックス粒子懸濁液と希釈被検血漿を、
一定時間攪拌し、ラテックス粒子の凝集を判定する。被
検血漿の希釈倍数にラテックス試薬の感度を乗じること
により、アンチトロンビンＩＩＩの蛋白濃度を半定量す
る。 ４．ラテックス凝集比濁法 抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗体を感作したラテック
ス粒子懸濁液中に、被検血漿中のアンチトロンビンＩＩ
Ｉが加わると均一に分散していたラテックス粒子は抗原
抗体反応によって凝集する。この反応は時間経過と共に
増強するが、その濁度の初期変化速度を白色光（５８５
ｎｍ）または、近赤外光（９４０ｎｍ）の波長で測定す
る。標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用いて同様の操
作をして描いた検量線からアンチトロンビンＩＩＩ量
（蛋白濃度）を求める。 ５．レーザーネフェロメトリー法 抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗体希釈液に被検血漿中
のアンチトロンビンＩＩＩが加わると抗原抗体反応によ
り、免疫複合体が形成される。この不溶性の免疫複合体
にレーザー光を照射し、その散乱光度を測定する。不溶
性の免疫複合体の濃度に比例して散乱光の強度が増加す
る。標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用いて同様の操
作をして描いた検量線からアンチトロンビンＩＩＩ量
（蛋白濃度）を求める。 ６．免疫比濁法 抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗体希釈液に被検血漿中
のアンチトロンビンＩＩＩが加わると抗原抗体反応によ
り、免疫複合体が形成される。この不溶性の免疫複合体
は散乱光を増大し、透過光を減少させる。この反応系に
高分子ポリマーを添加して測定感度を上げ、波長３４０
ｎｍで測光し、標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用い
て同様の操作をして描いた検量線からアンチトロンビン
ＩＩＩ量（蛋白濃度）を求める。
物活性の測定方法と抗原量を検索する免疫学的測定法に
大別される。既知の測定方法を以下に示す。 Ａ．生物学的測定法 １．凝血学的測定法 ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定法 脱フィブリノゲン血漿または血清に一定量のトロンビン
を加え、放置した後、フィブリノゲンを加えて凝固時間
を測定する方法。 ｂ．ヘパリンコファクター活性測定法 凝血学的測定系に，ヘパリンを加え、アンチトロンビン
ＩＩＩ・ヘパリン複合体のトロンビン中和反応を凝血学
的に測定する方法。 ２．トロンビンアガロース平板法 トロンビンを含んだアガロース平板に穴を開け、被検血
漿を注入し、２４時間静置する。次いで、過熱溶解した
アガロースとフィブリノーゲンの混和液を平板上に重層
し、静置する。重層したフィブリノーゲンはアガロース
ゲル内で下層のトロンビンによりフィブリンに転化し、
白濁するが、検体孔の周囲に拡散したアンチトロンビン
ＩＩＩにより反応が阻止される。このゲル内でのフィブ
リノーゲン−フィブリンの転化阻止によって生じた透明
輪の大きさがアンチトロンビンＩＩＩの濃度を反映す
る。検体孔の周囲に生じた透明輪の直径を計測し、標準
アンチトロンビンＩＩＩ活性を算出する。 ３．合成基質法 被検血漿にヘパリンを加え、即効性に抗トロンビン作用
を示すアンチトロンビンＩＩＩ・ヘパリン複合体を形成
させる。ここに一定過剰のトロンビンを添加すると複合
体の量に比例してトロンビンが不活化される。次に、ト
ロンビンに特異的な合成ペプチド基質を添加すると、残
存トロンビンがこの基質をアミド分解してペプチド基質
のＮ末端に結合した発色基を遊離する。この発色基質を
比色定量することによりアンチトロンビンＩＩＩ活性を
求める。 Ｂ．免疫学的測定法 １．一次元免疫拡散法（ＳＲＩＤ）法 抗アンチトロンビンＩＩＩ血清を含んだアガロース平板
上に開けた検体孔に被検血漿を注入し、室温で２４〜４
８時間水平に静置する。標準アンチトロンビンＩＩＩ血
清を用いて同様の操作をして描いた検量線からアンチト
ロンビンＩＩＩ量（蛋白濃度）を求める。 ２．ローレル免疫電気泳動法 抗アンチトロンビンＩＩＩ血清を含んだアガロース平板
上に開けた検体孔に被検血漿を注入し、検体孔を陰極側
として電気泳動を行なう。生じたロケット状の沈降線の
高さは、被検血漿中のアンチトロンビンＩＩＩの蛋白濃
度に比例する。標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用い
て同様の操作をして描いた検量線からアンチトロンビン
ＩＩＩ量（蛋白濃度）を求める。 ３．ラテックス凝集法 スライドグラス上で、抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗
体を感作したラテックス粒子懸濁液と希釈被検血漿を、
一定時間攪拌し、ラテックス粒子の凝集を判定する。被
検血漿の希釈倍数にラテックス試薬の感度を乗じること
により、アンチトロンビンＩＩＩの蛋白濃度を半定量す
る。 ４．ラテックス凝集比濁法 抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗体を感作したラテック
ス粒子懸濁液中に、被検血漿中のアンチトロンビンＩＩ
Ｉが加わると均一に分散していたラテックス粒子は抗原
抗体反応によって凝集する。この反応は時間経過と共に
増強するが、その濁度の初期変化速度を白色光（５８５
ｎｍ）または、近赤外光（９４０ｎｍ）の波長で測定す
る。標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用いて同様の操
作をして描いた検量線からアンチトロンビンＩＩＩ量
（蛋白濃度）を求める。 ５．レーザーネフェロメトリー法 抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗体希釈液に被検血漿中
のアンチトロンビンＩＩＩが加わると抗原抗体反応によ
り、免疫複合体が形成される。この不溶性の免疫複合体
にレーザー光を照射し、その散乱光度を測定する。不溶
性の免疫複合体の濃度に比例して散乱光の強度が増加す
る。標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用いて同様の操
作をして描いた検量線からアンチトロンビンＩＩＩ量
（蛋白濃度）を求める。 ６．免疫比濁法 抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗体希釈液に被検血漿中
のアンチトロンビンＩＩＩが加わると抗原抗体反応によ
り、免疫複合体が形成される。この不溶性の免疫複合体
は散乱光を増大し、透過光を減少させる。この反応系に
高分子ポリマーを添加して測定感度を上げ、波長３４０
ｎｍで測光し、標準アンチトロンビンＩＩＩ血清を用い
て同様の操作をして描いた検量線からアンチトロンビン
ＩＩＩ量（蛋白濃度）を求める。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、（１）被検
検体中のアンチトロンビンＩＩＩと遊離型ヘパリンを結
合させ、ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形
成させ、次に、（２）同複合体を活性化凝固因子（活性
化凝固第ＩＸ因子または、活性化凝固Ｘ因子）または、
トロンビンを、共有結合または、非特異吸着により、担
体に固定化した器具に結合させ、更に、（３）標識抗原
（標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ま
たは、標識抗体（標識抗ヘパリン・アンチトロンビンＩ
ＩＩ複合体抗体）を用いて定量する方法が、前述の方法
と比較して、優れていることを見出し、本発明を完成し
た。
検体中のアンチトロンビンＩＩＩと遊離型ヘパリンを結
合させ、ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形
成させ、次に、（２）同複合体を活性化凝固因子（活性
化凝固第ＩＸ因子または、活性化凝固Ｘ因子）または、
トロンビンを、共有結合または、非特異吸着により、担
体に固定化した器具に結合させ、更に、（３）標識抗原
（標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ま
たは、標識抗体（標識抗ヘパリン・アンチトロンビンＩ
ＩＩ複合体抗体）を用いて定量する方法が、前述の方法
と比較して、優れていることを見出し、本発明を完成し
た。
【０００５】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例には何ら限定される
ものではない。
説明するが、本発明は以下の実施例には何ら限定される
ものではない。
【０００６】実施例１． Ａ．アンチトロンビンＩＩＩキットの構成 （１）トロンビンを固定化したアガロースを封入したカ
ートリッジ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管にトロンビンを固定
化したアガロースを封入ししたカートリッジ各１個を分
取、混和し、室温で５分間インキュベートし、トロンビ
ン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成さ
せた。 （３）各試験管の内容液を捨て、試験管内のカートリッ
ジを洗浄液２ｍｌで２回洗浄、水切りをした。 （４）（３）の操作をした各試験管に酵素標識ヘパリン
・アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体２ｍｌを添加、混
和し、３７℃で３０分間インキュベートし、トロンビン
・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成させた。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、試
験管内のカートリッジを洗浄液２ｍｌで３回洗浄、水切
りをした。 （６）（５）の操作をした各試験管に酵素基質液５００
μｌを添加、混和し、室温で１０分間インキュベートし
た。 （７）（６）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。（８）ブランクを対照にして、４９
２ｎｍの吸光度を測定した。 （９）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
ートリッジ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管にトロンビンを固定
化したアガロースを封入ししたカートリッジ各１個を分
取、混和し、室温で５分間インキュベートし、トロンビ
ン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成さ
せた。 （３）各試験管の内容液を捨て、試験管内のカートリッ
ジを洗浄液２ｍｌで２回洗浄、水切りをした。 （４）（３）の操作をした各試験管に酵素標識ヘパリン
・アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体２ｍｌを添加、混
和し、３７℃で３０分間インキュベートし、トロンビン
・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成させた。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、試
験管内のカートリッジを洗浄液２ｍｌで３回洗浄、水切
りをした。 （６）（５）の操作をした各試験管に酵素基質液５００
μｌを添加、混和し、室温で１０分間インキュベートし
た。 （７）（６）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。（８）ブランクを対照にして、４９
２ｎｍの吸光度を測定した。 （９）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【０００７】実施例２．Ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活
性測定キットの構成 （１）反応性官能基を固相化し、更にトロンビンを共有
結合させたビーズ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管にトロンビンを共有
結合させたビーズ各１個を分取、混和し、室温で５分間
インキュベートし、トロンビン・ヘパリン・アンチトロ
ンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （３）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （４）（３）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体２ｍｌを添加、
混和し、３７℃で３０分間インキュベートし、トロンビ
ン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパ
リン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成させ
た。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、試
験管内のビーズを洗浄液２ｍｌで３回洗浄した。 （６）新たに準備した各試小験管に酵素基質液５００μ
ｌを秤量し、（５）の操作をしたビーズを移し、混和
後、室温で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各小試験管に反応停止液２ｍ
ｌを添加、混和した。（７）ブランクを対照にして、４
９２ｎｍの吸光度を測定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
性測定キットの構成 （１）反応性官能基を固相化し、更にトロンビンを共有
結合させたビーズ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管にトロンビンを共有
結合させたビーズ各１個を分取、混和し、室温で５分間
インキュベートし、トロンビン・ヘパリン・アンチトロ
ンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （３）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （４）（３）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体２ｍｌを添加、
混和し、３７℃で３０分間インキュベートし、トロンビ
ン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパ
リン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成させ
た。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、試
験管内のビーズを洗浄液２ｍｌで３回洗浄した。 （６）新たに準備した各試小験管に酵素基質液５００μ
ｌを秤量し、（５）の操作をしたビーズを移し、混和
後、室温で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各小試験管に反応停止液２ｍ
ｌを添加、混和した。（７）ブランクを対照にして、４
９２ｎｍの吸光度を測定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【０００８】実施例３． Ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定キットの構成 （１）トロンビンを共有結合させたマイクロタイタープ
レート （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌと、ヘパリン緩衝液１
ｍｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、
ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させ
た。 （２）トロンビンを共有結合させたマイクロタイタープ
レートに、（１）の操作をした検体２００μｌを秤量、
混和し、室温で３０分間インキュベートし、トロンビン
・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させ
た。 （３）各マイクロタイタープレートの内容液を捨て、マ
イクロタイタープレートの各穴を洗浄液３００μｌで３
回洗浄した。 （４）（３）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴に、酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複
合体抗体２００μｌを添加、混和し、３７℃で３０分間
インキュベートし、トロンビン・ヘパリン・アンチトロ
ンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩ
ＩＩ抗体複合体を形成させた。 （５）（４）の操作をしたマイクロタイタープレートの
内容液を捨て、マイクロタイタープレートの各穴を洗浄
液３００μｌで３回洗浄した。 （６）（５）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴に酵素基質液２００μｌを添加、混和し、室温で１
０分間インキュベートした。 （７）（６）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴に反応停止液１００μｌを添加、混和した。 （８）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （９）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
レート （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌと、ヘパリン緩衝液１
ｍｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、
ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させ
た。 （２）トロンビンを共有結合させたマイクロタイタープ
レートに、（１）の操作をした検体２００μｌを秤量、
混和し、室温で３０分間インキュベートし、トロンビン
・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させ
た。 （３）各マイクロタイタープレートの内容液を捨て、マ
イクロタイタープレートの各穴を洗浄液３００μｌで３
回洗浄した。 （４）（３）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴に、酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複
合体抗体２００μｌを添加、混和し、３７℃で３０分間
インキュベートし、トロンビン・ヘパリン・アンチトロ
ンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩ
ＩＩ抗体複合体を形成させた。 （５）（４）の操作をしたマイクロタイタープレートの
内容液を捨て、マイクロタイタープレートの各穴を洗浄
液３００μｌで３回洗浄した。 （６）（５）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴に酵素基質液２００μｌを添加、混和し、室温で１
０分間インキュベートした。 （７）（６）の操作をしたマイクロタイタープレートの
各穴に反応停止液１００μｌを添加、混和した。 （８）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （９）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【０００９】実施例４． Ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定キットの構成 （１）反応性官能基にトロンビンを共有結合させた試験
管 （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）反応性官能基を固相化し、更にトロンビンを共有
結合させた試験管に、（１）の操作をした検体１ｍｌを
秤量、混和し、室温で３０分間インキュベートし、トロ
ンビン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形
成させた。 （３）各試験管の内容液を捨て、各試験管を洗浄液３ｍ
ｌで３回洗浄した。 （４）（３）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体２ｍｌを添加、
混和し、３７℃で３０分間インキュベートし、トロンビ
ン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパ
リン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成させ
た。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、各
試験管を洗浄液３ｍｌで３回洗浄した。 （６）（５）の操作をした各試験管に酵素基質液１ｍｌ
を添加、混和し、室温で１０分間インキュベートした。 （７）（６）の操作をした各試験管に反応停止液１ｍｌ
を添加、混和した。 （８）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （９）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
管 （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）ヘパリン緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）反応性官能基を固相化し、更にトロンビンを共有
結合させた試験管に、（１）の操作をした検体１ｍｌを
秤量、混和し、室温で３０分間インキュベートし、トロ
ンビン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形
成させた。 （３）各試験管の内容液を捨て、各試験管を洗浄液３ｍ
ｌで３回洗浄した。 （４）（３）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体２ｍｌを添加、
混和し、３７℃で３０分間インキュベートし、トロンビ
ン・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識ヘパ
リン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成させ
た。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、各
試験管を洗浄液３ｍｌで３回洗浄した。 （６）（５）の操作をした各試験管に酵素基質液１ｍｌ
を添加、混和し、室温で１０分間インキュベートした。 （７）（６）の操作をした各試験管に反応停止液１ｍｌ
を添加、混和した。 （８）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （９）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【００１０】実施例５． Ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定キットの構成 （１）活性化凝固第Ｘ因子を固定化したアガロースを封
入したカートリッジ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の小試験管に、活性化凝固第Ｘ因子を固定
化したアガロースを封入したカートリッジ各１個を分
取、混和し、室温で３分間インキュベートし、活性化凝
固第Ｘ因子・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体
を形成させた。 （３）（４）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体２ｍｌを添加、混和
し、３７℃で３分間インキュベートした。 （４）各試験管の内容液を捨て、試験管内のカートリッ
ジを洗浄液２ｍｌで２回洗浄、水切りをした。 （５）新たに準備した、各試験管に酵素基質液１ｍｌを
分取し、（４）の操作をしたビーズを移し、混和し、３
７℃で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各試験管に反応停止液１ｍｌ
を添加、混和した。 （７）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
入したカートリッジ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の小試験管に、活性化凝固第Ｘ因子を固定
化したアガロースを封入したカートリッジ各１個を分
取、混和し、室温で３分間インキュベートし、活性化凝
固第Ｘ因子・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体
を形成させた。 （３）（４）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体２ｍｌを添加、混和
し、３７℃で３分間インキュベートした。 （４）各試験管の内容液を捨て、試験管内のカートリッ
ジを洗浄液２ｍｌで２回洗浄、水切りをした。 （５）新たに準備した、各試験管に酵素基質液１ｍｌを
分取し、（４）の操作をしたビーズを移し、混和し、３
７℃で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各試験管に反応停止液１ｍｌ
を添加、混和した。 （７）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【００１１】実施例６． Ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定キットの構成 （１）反応性官能基を固相化し、更に活性化第ＩＸ因子
を共有結合させたビーズ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衡液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管に活性化第ＩＸ因子
を共有結合させたビーズ各１個を分取し、混和し、室温
で５分間インキュベートし、活性化凝固第ＩＸ因子・ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （３）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （４）（３）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合抗体２ｍｌを添加、混
和し、３７℃で３０分間インキュベートし、活性化第Ｉ
Ｘ因子・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識
ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成さ
せた。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、試
験管内のビーズを洗浄液２ｍｌで３回洗浄した。 （６）新たに準備した各試験管に酵素基質液５００μｌ
を秤量し、（５）の操作をしたビーズを移し、混和後、
室温で１０分間インキュベートした。 （７）（６）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。 （８）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
を共有結合させたビーズ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体抗体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衡液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管に活性化第ＩＸ因子
を共有結合させたビーズ各１個を分取し、混和し、室温
で５分間インキュベートし、活性化凝固第ＩＸ因子・ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （３）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （４）（３）の操作をした各試験管に、酵素標識ヘパリ
ン・アンチトロンビンＩＩＩ複合抗体２ｍｌを添加、混
和し、３７℃で３０分間インキュベートし、活性化第Ｉ
Ｘ因子・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ・酵素標識
ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ抗体複合体を形成さ
せた。 （５）（４）の操作をした各試験管の内容液を捨て、試
験管内のビーズを洗浄液２ｍｌで３回洗浄した。 （６）新たに準備した各試験管に酵素基質液５００μｌ
を秤量し、（５）の操作をしたビーズを移し、混和後、
室温で１０分間インキュベートした。 （７）（６）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。 （８）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【００１２】実施例７． Ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定キットの構成 （１）反応性官能基を固相化し、更にトロンビンを共有
結合させたビーズ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管にトロンビンを共有
結合させたビーズ各１個を分取、混和し、室温で３分間
インキュベートし、トロンビン・ヘパリン・アンチトロ
ンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （３）（２）の操作をした各試験管に酵素標識ヘパリン
・アンチトロンビンＩＩＩ複合体５０μｌを添加、混和
し、室温で３分間インキュベートした。 （４）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （５）新たに準備した各試験管に酵素基質液５００μｌ
を秤量し、（４）の操作をしたビーズを移し、混和後、
室温で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。 （７）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
結合させたビーズ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で５分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管にトロンビンを共有
結合させたビーズ各１個を分取、混和し、室温で３分間
インキュベートし、トロンビン・ヘパリン・アンチトロ
ンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （３）（２）の操作をした各試験管に酵素標識ヘパリン
・アンチトロンビンＩＩＩ複合体５０μｌを添加、混和
し、室温で３分間インキュベートした。 （４）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （５）新たに準備した各試験管に酵素基質液５００μｌ
を秤量し、（４）の操作をしたビーズを移し、混和後、
室温で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。 （７）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【００１３】実施例８． Ａ．アンチトロンビンＩＩＩ活性測定キットの構成 （１）活性化凝固第ＩＸ因子を非特異吸着させたビーズ （２）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体 （３）酵素標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合
体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で３分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管に、活性化凝固第Ｉ
Ｘ因子を非特異吸着させたビーズ各１個を分取、混和
し、室温で３分間インキュベートし、活性化凝固第ＩＸ
因子・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成
させた。 （３）（２）の操作をした各試験管に酵素標識ヘパリン
・アンチトロンビンＩＩＩ複合体５０μｌを添加、混和
し、室温で３分間インキュベートした。 （４）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （５）新たに準備した各試験管に酵素基質液５００μｌ
を秤量し、（４）の操作をしたビーズを移し、混和後、
室温で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。 （７）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
体 （４）洗浄液 （５）酵素基質 （６）緩衝液 （７）反応停止液 Ｂ．測定操作 （１）小試験管に、検体５０μｌとヘパリン緩衝液１ｍ
ｌを分取、混和し、室温で３分間インキュベートし、ヘ
パリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成させた。 （２）（１）の操作をした各試験管に、活性化凝固第Ｉ
Ｘ因子を非特異吸着させたビーズ各１個を分取、混和
し、室温で３分間インキュベートし、活性化凝固第ＩＸ
因子・ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を形成
させた。 （３）（２）の操作をした各試験管に酵素標識ヘパリン
・アンチトロンビンＩＩＩ複合体５０μｌを添加、混和
し、室温で３分間インキュベートした。 （４）各試験管の内容液を捨て、試験管内のビーズを洗
浄液２ｍｌで２回洗浄した。 （５）新たに準備した各試験管に酵素基質液５００μｌ
を秤量し、（４）の操作をしたビーズを移し、混和後、
室温で１０分間インキュベートした。 （６）（５）の操作をした各試験管に反応停止液２ｍｌ
を添加、混和した。 （７）ブランクを対照にして、４９２ｎｍの吸光度を測
定した。 （８）標準ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いて同一操作をして描いた検量線から検体のアンチト
ロンビンＩＩＩ活性を求めた。
【００１４】
【発明の効果】本発明は、被検体中のアンチトロンビン
ＩＩＩと遊離型ヘパリンを結合させ、ヘパリン・アンチ
トロンビンＩＩＩ複合体を形成させ、次に、同複合体を
活性化凝固因子または、トロンビンを、共有結合また
は、非特異吸着により、担体に固定化した器具に結合さ
せ、更に、標識抗原（標識ヘパリン・アンチトロンビン
ＩＩＩ複合体）、または、標識抗体（標識抗ヘパリン・
アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体）を用いて定量する
方法である。本発明によれば、 （１）従来、煩雑であったアンチトロンビンＩＩＩ活性
の測定が容易となる。 （２）活性化凝固因子（活性化凝固第ＩＸ因子または、
活性化凝固第Ｘ因子）または、トロンビンを固定化した
アフィニティークロマトグラフィー担体を固相化した実
験器具（試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、
磁性粒子、ろ紙、ストリップ等）は、従来法（非特異吸
着法）による実験器具に比較して、検体を多量に吸着す
ることが可能となり、検体の希釈が不要になる。 （３）ＥＩＡ法（サンドイッチ法）と比較して、抗体使
用量が半減する。 （４）標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いた競合法によれば、短時間でのアンチトロンビンＩ
ＩＩ活性の測定が可能となる。という利点がある。
ＩＩＩと遊離型ヘパリンを結合させ、ヘパリン・アンチ
トロンビンＩＩＩ複合体を形成させ、次に、同複合体を
活性化凝固因子または、トロンビンを、共有結合また
は、非特異吸着により、担体に固定化した器具に結合さ
せ、更に、標識抗原（標識ヘパリン・アンチトロンビン
ＩＩＩ複合体）、または、標識抗体（標識抗ヘパリン・
アンチトロンビンＩＩＩ複合体抗体）を用いて定量する
方法である。本発明によれば、 （１）従来、煩雑であったアンチトロンビンＩＩＩ活性
の測定が容易となる。 （２）活性化凝固因子（活性化凝固第ＩＸ因子または、
活性化凝固第Ｘ因子）または、トロンビンを固定化した
アフィニティークロマトグラフィー担体を固相化した実
験器具（試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、
磁性粒子、ろ紙、ストリップ等）は、従来法（非特異吸
着法）による実験器具に比較して、検体を多量に吸着す
ることが可能となり、検体の希釈が不要になる。 （３）ＥＩＡ法（サンドイッチ法）と比較して、抗体使
用量が半減する。 （４）標識ヘパリン・アンチトロンビンＩＩＩ複合体を
用いた競合法によれば、短時間でのアンチトロンビンＩ
ＩＩ活性の測定が可能となる。という利点がある。
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 アンチトロンビンＩＩＩ活性
の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンＩＩＩ活性
の測定キット
の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンＩＩＩ活性
の測定キット
Claims (7)
- 【請求項１】（ａ）活性化凝固因子（活性化凝固第ＩＸ
因子または、活性化凝固第Ｘ因子）または、トロンビン
を固定化したアフィニティークロマトグラフィー担体を
封入したカートリッジおよび（ｂ）遊離型ヘパリンを用
いたアンチトロンビンＩＩＩ活性の測定方法。 - 【請求項２】（ａ）−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝
Ｎ−，−ＣＯＮＨ−等の反応性官能基を固相化し、その
官能基に、活性化凝固因子（活性化凝固第ＩＸ因子また
は、活性化凝固第Ｘ因子）または、トロンビンを共有結
合させた実験器具（試験管、ビーズ、マイクロタイター
プレート、磁性粒子、ろ紙、ストリップ等）および
（ｂ）遊離型ヘパリンを用いたアンチトロンビンＩＩＩ
活性の測定方法。 - 【請求項３】（ａ）活性化凝固因子（活性化凝固第ＩＸ
因子または、活性化凝固第Ｘ因子）または、トロンビン
を非特異吸着させた実験器具（試験管、ビーズ、マイク
ロタイタープレート、磁性粒子、ろ紙、ストリップ等）
および（ｂ）遊離型ヘパリンを用いたアンチトロンビン
ＩＩＩ活性の測定方法。 - 【請求項４】（ａ）活性化凝固因子（活性化凝固第ＩＸ
因子または、活性化凝固第Ｘ因子）または、トロンビン
を固定化したアフィニティークロマトグラフィー担体を
固相化した実験器具（試験管、ビーズ、マイクロタイタ
ープレート、磁性粒子、ろ紙、ストリップ等）および
（ｂ）遊離型ヘパリンを用いたアンチトロンビンＩＩＩ
活性の測定方法。 - 【請求項５】「請求項１」、「請求項２」、「請求項
３」、「請求項４」の実施の為に構成されたアンチトロ
ンビンＩＩＩ活性の測定キット。 - 【請求項６】「請求項１」、「請求項２」、「請求項
３」に記載された活性化凝固因子（活性化凝固第ＩＸ因
子または、活性化凝固第Ｘ因子）または、トロンビンを
共有結合または、非特異吸着させた実験器具。 - 【請求項７】「請求項４」に記載された活性化凝固因子
（活性化凝固第ＩＸ因子または、活性化凝固第Ｘ因子）
または、トロンビンを固定化したアフィニティークロマ
トグラフィー担体を固相化した実験器具（試験管、ビー
ズ、マイクロタイタープレート、磁性粒子、ろ紙、スト
リップ等）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3287371A JPH0694713A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンｉｉｉ活性の測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3287371A JPH0694713A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンｉｉｉ活性の測定キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0694713A true JPH0694713A (ja) | 1994-04-08 |
Family
ID=17716500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3287371A Pending JPH0694713A (ja) | 1991-07-31 | 1991-07-31 | アンチトロンビンｉｉｉ活性の測定方法とそれを用いたアンチトロンビンｉｉｉ活性の測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0694713A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2718849A1 (fr) * | 1994-04-14 | 1995-10-20 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Procédé d'immunodosage de l'antithrombine III activée par un glycosaminoglycane, anticorps monoclonaux correspondants et leur procédé d'obtention. |
| EP0825443A1 (de) * | 1996-08-17 | 1998-02-25 | Centeon Pharma GmbH | Verfahren zur Quantifizierung von Glykosaminoglykanen in Antithrombin III-haltigen Lösungen |
| EP1398387A1 (de) * | 2002-08-29 | 2004-03-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Verbesserung der Spezifität bei der Bestimmung von Antithrombin III |
| JP2016519081A (ja) * | 2013-03-14 | 2016-06-30 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシーＢａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ | ヘパリンと結合体化した抗トロンビンβに対するモノクローナル抗体 |
-
1991
- 1991-07-31 JP JP3287371A patent/JPH0694713A/ja active Pending
Cited By (10)
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