CN103592445A

CN103592445A - 检测降钙素原的试剂盒

Info

Publication number: CN103592445A
Application number: CN201310484699.9A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Beijing Leadman Biochemistry Co Ltd
Current assignee: Beijing Leadman Biochemistry Co Ltd
Priority date: 2013-10-16
Filing date: 2013-10-16
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明公开了一种检测降钙素原的试剂盒，包括：抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。本发明提供的检测降钙素原的试剂盒采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血清或血浆样品中的PCT含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。

Description

检测降钙素原的试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫分析领域，特别是涉及一种检测降钙素原的试剂盒。

背景技术

降钙素原（简称PCT）是无激素活性的降钙素（简称CT）前体物质，来自定位于第11号染色体上（11p15，4）的单拷贝基因，PCT是由116个氨基酸组成、分子量为13KD的糖蛋白。PCT由N末端-降钙素-C末端三部分组成，其不会降解为降钙素，不受体内激素水平影响。PCT的半衰期为25～30小时，是用于检测细菌感染所致炎症反应的较好指标之一。临床资料显示，PCT浓度高于0.1ng/mL时说明存在临床相关的细菌感染，需要采用抗生素进行治疗；当PCT浓度>0.5ng/mL时，要考虑患者可能发展成重症败血症或败血症性休克的危险，因此，PCT可以作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的实验室常规指标。

目前，检测降钙素原的方法主要有放射性免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析法（GICA）和化学发光免疫分析法（CLIA）等。RIA有很高的检测灵敏度，但由于标记物具有放射性危害，标记物稳定性差，废弃物难以处理等缺点，已逐渐退出临床检验领域；ELISA法存在灵敏度低、线性范围窄、不易实现全自动化等缺陷；GICA具有操作简单，检测速度快等优点，但也存在灵敏度低、试剂不稳定、重复性较差、难以进行定量等缺点；CLIA法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多优点得到了广泛的应用。但是，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒多为进口的封闭式全自动化学发光检测系统，需要昂贵的全自动化学发光检测仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种检测降钙素原的试剂盒，具有简便、快速、灵敏度高、线性范围宽和稳定性好等优点，以克服现有技术的不足。

基于上述目的，本发明提供的检测降钙素原的试剂盒包括：

抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，

异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体，

碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体，和

碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。

可选地，所述试剂盒还包括用于稀释所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体的稀释液，所述稀释液为pH值为7.5～8.5、含质量比为0.3～0.7%的牛血清白蛋白和0.05～0.3%的叠氮化钠防腐剂的0.05～0.2M Tris-HCl缓冲液。

较佳地，所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液配制成0.5～2μg/mL的磁微粒溶液。

较佳地，所述异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25～0.5μg/mL异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体溶液。

优选地，所述碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25～0.5μg/mL碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液。

可选地，所述化学发光底物液是0.1～0.3M，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷。

较佳地，所述化学发光底物液是0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，并含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷。

可选地，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为0.1～0.2M，pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.01～0.04%的吐温20和15～20%的氯化钠。

较佳地，所述清洗液为0.1M，pH值为8的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.02%的吐温20和15%的氯化钠。

可选地，所述试剂盒还包括降钙素原系列校准品，所述校准品浓度范围为0～50ng/mL。

从上面所述可以看出，本发明提供的检测降钙素原的试剂盒采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血清或血浆样品中的PCT含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。而且，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明提供的试剂盒结构简便，使用方便，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，试剂盒成本低，无放射性污染，临床适用性强，更适用于我国临床检测，适合在国内的各级医院推广使用。

附图说明

图1为本发明实施例试剂盒中PCT的浓度－发光值曲线图；

图2为本发明实施例A,B点连点拟合曲线图；

图3为本发明实施例的试剂盒与国外试剂盒的PCT血清样本检测结果相关性图（单位：ng/ml）。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明提供的检测降钙素原的试剂盒，包括抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体和碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。

具体地，所述检测降钙素原的试剂盒可以通过以下步骤制得：

一、PCT校准品的制备

用pH=7.5，0.1M Tris-HCl缓冲液将PCT纯品稀释成6个水平的冻干校准品，用纯水复溶后的目标浓度分别为0、0.25、2、10、25和50ng/ml。其中，所述降钙素原校准品的原料为标准级，纯度不低于99%。

二、抗异硫氰酸荧光素（FITC）多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备

将粒径为1μm的磁微粒加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH=4.7的25mM的MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL；每mL悬浮液中加入抗FITC多克隆抗体2mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为10mg/mL的EDC溶液，每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/mL的EDC溶液，在室温条件下搅拌反应4小时后得到包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒；然后加磁场，静置15min，倒出上清液，用pH=8.0，含质量比为0.5%的牛血清白蛋白（BSA）和0.2%的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液清洗4次，并用该缓冲液将包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒配制成1μg/mL的工作液。该包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒溶液在4℃保存，不应冻存，用时混匀。

三、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的降钙素原单克隆抗体溶液的制备

将降钙素原单克隆抗体置于透析袋，在用0.2M pH=9.0的碳酸盐缓冲液中过夜透析；用0.2M pH=9.0的NaHCO₃溶液配制浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，每mg降钙素原单克隆抗体加入0.15mL浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20小时后，在0.2M pH=9.0的碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得到异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体；用含有质量百分含量为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分含量为0.2%的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体，得到浓度为0.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体溶液。

四、碱性磷酸酶（ALP）标记的降钙素原单克隆抗体溶液的制备

用去离子水配制13.76mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，取降钙素原单克隆抗体预先装在尖底试管里，加入13.76mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液（加入量为抗体体积1/100），混匀，在室温下放置30分钟，即得活化后的降钙素原单克隆抗体。

取碱性磷酸酶预先装在尖底试管里（碱性磷酸酶与降钙素原单克隆抗体的质量比为1:1），用无水二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磷酸酶的试管中加入Sulfo-SMCC溶液（加入量为ALP体积1/20），混匀，在室温下放置15分钟，即得活化后的碱性磷酸酶溶液。

在上述活化后的降钙素原单克隆抗体中加入1M的MgCl₂溶液（加入量为抗体体积1/500），再继续加入活化后的碱性磷酸酶溶液，将试管放在4℃条件下14～16小时，即得碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液。

安装蛋白质纯化系统(AKTA purifier100)，使用Superdex200制备级16/70(或相近)柱子，使用pH=7.0去离子水配制的质量百分浓度为2%的三乙醇胺溶液进行平衡，流速1ml/min，收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值，收集280nm处吸光值大于0.02的管份，计算碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体的浓度。用含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的0.1M Tris-HCl缓冲液稀释该碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体，得到浓度为0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液。

五、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液的制备

用0.2M pH=9.3的Tris-HCl缓冲液配制二氧杂环乙烷化合物(APCL)终浓度为0.3mg/mL的溶液。

六、清洗液的配制

向0.1M、pH=8.0的Tris-HCl缓冲液中加入吐温20和氯化钠，其中，吐温20的质量百分浓度为0.02%，氯化钠的质量百分浓度为15%；

七、将用上述方法制备的各组分检验合格后组装成试剂盒，组装成试剂盒后需要抽检合格后才能出厂。

在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的待测样品基质中快速分离、纯化出目的待测物是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。可选地，所述磁微粒为0.7～3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹有活性基团的聚合物。优选地，所述活性基团为羧基。

优选地，本发明提供的试剂盒还包括反应试管，其材料选自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的至少一种。

本发明提供的试剂盒的检测原理为：将待测样本，FITC标记的降钙素原单克隆抗体溶液和ALP标记的降钙素原单克隆抗体溶液混合温育，荧光素（FITC）和碱性磷酸酶（ALP）标记的一对抗PCT单克隆抗体与样本中PCT抗原分子结合，形成免疫复合物。然后加入包被有抗FITC多克隆抗体的磁微粒，免疫复合物被吸附到磁微粒表面。洗涤去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物，ALP催化底物发光，测定相对发光强度（RLU）。在一定范围内RLU与PCT抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的PCT含量。

具体地，本发明提供的试剂盒的检测方法可以包括：

一、样本要求

取5.0ml静脉血至玻璃试管中，不加抗凝剂，在室温中静置，然后通过离心（3000rpm×5min）分离血清部分。

二、检测方法

试剂从储存条件下取出后应平衡到室温再用于检测；使用前将抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀，但是不能使用磁力搅拌器搅拌；清洗液：用去离子水将清洗液稀释15倍，混匀；设定好37℃水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；根据需要准备试管并做好标记。

加50μl校准品和待测样本至对应试管中，每个样品应更换移液器头避免交叉污染。加50μl FITC标记的降钙素原单克隆抗体溶液和50μl ALP标记的降钙素原单克隆抗体溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分），置37±0.5℃水浴15分钟。然后加入50μl抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液至每一试管中，用多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分），置37±0.5℃水浴5分钟，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀2分钟。用一大而缓慢的圆周运动倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，拍击，以除去沾在管壁上的液滴。加300μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀30秒（2000转/分）。重复上述清洗操作，共清洗3次。

加100μl碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混匀3秒，在5分钟内用发光检测仪进行检测。利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，参见图1，再根据待测样本的相对发光强度（RLU）可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。

按照本领域中常规的制造及检定规程对本发明的试剂盒进行检定，结果如下：

1、试剂盒精密度测定

（1）分析内精密度

将本发明提供的试剂盒取两批，分别测定低、高不同浓度的血清，10孔平行测定，得出批内变异系数为2%和1.75%。

表1分析内精密度测试

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			0.52	10	2
9.93	10	1.75

（2）分析间精密度

将实施例1中制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、高不同浓度的血清，10孔平行测定。每份血清得到30个浓度测值，统计分析间变异系数为7.98%和5.85%。

表2分析间精密度测试

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			0.52	30	7.98
9.93	30	5.85

2、试剂盒准确度测定

准确性是指测量值接近真值的程度，通常用回收率表示。

回收试验：先将降钙素原纯品配制成浓度为400-800ng/mL的高标溶液。将人血清样本分成两份，一份直接测定，另一份中加入一定体积的高标溶液（高标溶液体积与人血清体积比例为1:20，加入高标溶液后，待测物的总浓度必须在试剂盒测定线性范围以内），同时测定两份样本，每个样本重复测定3次，按下面的公式计算回收率。

R = \frac{C \times (V_{0} + V) - C_{0} \times V_{0}}{{V \times C}_{S}} \times 100 %

式中：R—回收率；

V—加高标溶液的体积；

V₀—人血清样本的体积；

C—人血清样本中加入高标溶液后的浓度；

C₀—人血清样本的浓度；

C_s—高标溶液的浓度；

结果如表3所示，PCT的回收率在85%～115%之间。

表3、准确度测定

3、最低检测限

最低检测限是在一给定的显著性水平上可与零剂量相区别的剂量。用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光强度（RLU）值，计算其平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入所述一次方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。

（1）A点发光值

A点发光均值：X=1419SD=298X+2SD=2014

（2）B点发光值

B点发光均值：X=9659

（3）A,B点连点拟合曲线，参见图2。

（4）灵敏度=0.018ng/mL

4、试剂盒特异性实验

对本发明提供的试剂盒特异性检验是选取与PCT有类似结构的降钙素（CT），配制成大于生理浓度的样本，采用该试剂盒进行测定，并计算交叉反应率。结果见表4，本法与CT的交叉反应率均小于0.5%。

表4特异性实验

5、试剂盒稳定性实验

对本发明提供的试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达12个月。

经过大量的实验证明，本发明提供的试剂盒方法学指标如下：

检测范围：0～50ng/mL。

灵敏度：最小检测限不高于0.05ng/mL。

精密度：小于10%。

准确性：平均回收率在95%～105%。

特异性：与降钙素（CT）的交叉小于0.5%。

稳定性：试剂各组分置4℃12个月和37℃7天后测定结果均符合要求，试剂盒效期可达12个月。

本发明提供的试剂盒与国外试剂盒进行临床样本测值比对：

用本发明提供的试剂盒和罗氏诊断产品(上海)有限公司的降钙素原（PCT）检测试剂盒（电化学发光法）试剂盒分别对105份人血清样品同时进行检测。其检测结果见附图3，采用本发明提供的试剂盒测得的血清PCT浓度为横坐标，以罗氏诊断产品(上海)有限公司的PCT检测试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y=1.01x–0.186，相关系数r为：0.992。经统计学处理结果表明，本发明提供的试剂盒与国外试剂盒测得的临床样本测值相关性良好。

本发明提供的试剂盒综合采用了悬浮磁微粒载体技术和化学发光检测技术，使系统能够充分满足临床对检测结果的要求：

1、检测范围宽：表面巨大的磁微粒免疫反应载体、灵敏稳定的碱性磷酸酶底物APCL-Ⅰ化学发光体系保证了宽的线性范围。

2、灵敏度高：APCL-Ⅰ发光系统，使检测信号大为增强。检测限可达10-19mol的水平；悬浮磁微粒比表面巨大，可有效捕获样品中的痕量待测物，提高检测的灵敏度。

3、特异性强：选用单克隆抗体，与潜在交叉物无明显交叉反应

4、快速准确：悬浮磁微粒作为反应载体，可发挥液相免疫反应的优点，保证免疫反应和发光反应迅速达到平衡，无需耗时等待；APCL-Ⅰ发光峰值到达时间短、峰值平台稳定，使检测快速、准确。

本发明采用双抗体夹心法的反应模式，有效地利用了化学发光检测技术结合磁微粒免疫分离技术原理，定量测定人体血清或血浆样品中的PCT的含量，确保了检测的灵敏度，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。而且，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明的试剂盒结构简便，使用方便，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，试剂盒成本低，无放射性污染，临床适用性强，更适用于我国临床检测，适合在国内的各级医院推广使用，有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验中的应用与发展。

本发明提供的试剂盒是结合磁微粒免疫分离技术在酶联免疫分析的基础上应用酶促化学发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度大大提高，并且操作简便实用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光检测仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量、快检测，使用成本低，更易推广应用。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，包括：

抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒，

异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体，

碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体，和

碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液。

2.根据权利要求1所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于稀释所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体的稀释液，所述稀释液为pH值为7.5～8.5、含质量比为0.3～0.7%的牛血清白蛋白和0.05～0.3%的叠氮化钠防腐剂的0.05～0.2M Tris-HCl缓冲液。

3.根据权利要求2所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于稀释液配制成0.5～2μg/mL的磁微粒溶液。

4.根据权利要求2所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25～0.5μg/mL异硫氰酸荧光素标记的降钙素原单克隆抗体溶液。

5.根据权利要求2所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶解在稀释液中配制成0.25～0.5μg/mL碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液。

6.根据权利要求1所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液是0.1～0.3M，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷。

7.根据权利要求6所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液是0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，并含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷。

8.根据权利要求1所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为0.1～0.2M，pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.01～0.04%的吐温20和15～20%的氯化钠。

9.根据权利要求8所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述清洗液为0.1M，pH值为8的Tris-HCl缓冲液中加入质量百分比为0.02%的吐温20和15%的氯化钠。

10.根据权利要求1所述的检测降钙素原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括降钙素原系列校准品，所述校准品浓度范围为0～50ng/mL。