CN104698189A - 保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途 - Google Patents

保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途，所述稳定剂的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶、多聚赖氨酸和水。本发明能够有效的保护FITC与抗原抗体偶联物的稳定性，能够使FITC与抗原抗体偶联物工作液保存一年后活性剩余达到95％以上，相较于现有常规用试剂，使FITC与抗原抗体偶联物的稳定性得到大幅提高，显著延长了相关试剂盒的有效期，并使得试剂盒能够长期保持良好的性能参数；且制备方法简单，经济成本低，适于在相关免疫分析测定领域推广应用。

Description

保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及免疫分析测定用试剂技术领域，尤其涉及保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途。
背景技术
在免疫分析测定中，采用异硫氰酸荧光素(FITC)抗体偶联固相载体，FITC偶联特异性抗体或抗原的级联放大技术能够大大提高分析试剂的灵敏度和线性范围，并且可以实现固相载体通用化，便于生产、降低成本。但FITC与抗原或抗体的偶联物稀释为浓度较低的工作液后稳定性大幅降低，容易水解失活，若受到光照则更会加速其失活。为防止FITC与抗原或抗体的偶联物活性降低，影响分析测定准确度，现有技术中，一般使用含有动物血清、牛血清白蛋白、酪蛋白等成分的稀释液保护FITC与抗原或抗体的偶联物的稳定性，虽然起到一定的稳定作用，但作用有限，通常保存一年(保存温度2～8℃)后活性剩余60～80％，不能很好的满足免疫分析测定应用。
因此，亟需开发一种稳定剂，有效保护异硫氰酸荧光素与抗原或抗体偶联物的稳定性，避免由于其稳定性不好导致试剂盒的有效期过短、空白限等性能参数逐渐下降，从而满足免疫分析测定的要求，保障分析测定的效果。
发明内容
本发明的目的是，针对现有技术存在的问题，提供保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途，有效保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定性，从而为相关分析测试提供保障。
本发明解决问题的技术方案是：保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂，所述稳定剂的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶、多聚赖氨酸和水。
在本发明保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂中，优选地，每1L所述稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲烷0.01mol、β-乳球蛋白1g～5g、N，N二甲基二吖啶硝酸盐1mg～3mg、鱼皮凝胶1g～3g、多聚赖氨酸0.1g～1g、余量为水。
在本发明保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂中，优选地，所述稳定剂的pH为7～9。
在本发明保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂中，优选地，所述稳定剂的pH为8。
上述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的制备方法，将上述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的各原料三羟甲基氨基甲烷、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀，即得到保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂。
优选地，在室温下，将所述稳定剂的各原料即三羟甲基氨基甲烷、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀后，用4mol/L盐酸调pH至7～9，制备完成后置于2～8℃下保存。
本发明还提供了上述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的用途，将其用于免疫分析测定；优选地，在免疫分析测定中，将异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物用所述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂稀释。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能够有效的保护FITC与抗原抗体偶联物的稳定性，能够使FITC与抗原抗体偶联物工作液保存一年(2～8℃)后活性剩余达到95％以上，相较于现有常规用试剂，使FITC与抗原抗体偶联物的稳定性得到大幅提高，显著延长了相关试剂盒的有效期，并使得试剂盒能够长期保持良好的性能参数；且制备方法简单，经济成本低，适于在相关免疫分析测定领域推广应用。
附图说明
图1为现有技术试剂1’号4℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
图2为现有技术试剂1’号37℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
图3为由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
图4为由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
图5为由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
图6为由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
图7为由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
图8为由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用百分数如无特殊说明均指质量百分含量。
下述实施例中所用的材料、试剂等，除特别说明外，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明的一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂，将原料三羟甲基氨基甲烷、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀制得，每1L所得稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲烷0.01mol、β-乳球蛋白1g、N，N二甲基二吖啶硝酸盐1mg、鱼皮凝胶1g、多聚赖氨酸0.1g、余量为水。
在上述实施例中，为增强对异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的保护效果，优选地，在室温下，将所述稳定剂的各原料即三羟甲基氨基甲烷、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀后，用4mol/L盐酸调pH至7～9，较佳地，调pH至8，制备完成后置于2～8℃下保存。
实施例2
本发明的一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂基本制备方法同实施例1，其中，每1L所得稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲烷0.01mol、β-乳球蛋白3g、N，N二甲基二吖啶硝酸盐3mg、鱼皮凝胶3g、多聚赖氨酸0.55g、余量为水。
实施例3
本发明的一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂基本制备方法同实施例1，其中，每1L所得稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲烷0.01mol、β-乳球蛋白5g、N，N二甲基二吖啶硝酸盐5mg、鱼皮凝胶5g、多聚赖氨酸1g、余量为水。
对上述实施例所制得的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂分别进行应用测试，以前列腺特异性抗原磁微粒化学发光免疫分析试剂(PSA试剂)为例，测定试剂1号的37℃的加速稳定性，试剂1号中的FITC与PSA抗体偶联物分别用上述实施例1-3制得的稳定剂配制成工作液。具体地，所述的PSA试剂包括：含有FITC偶联PSA抗体的溶液，简称试剂1号；偶联有FITC抗体的磁微粒的悬浮液，简称磁分离试剂；碱性磷酸酶(ALP)标记的PSA抗体的溶液，简称试剂2号。所述PSA试剂制备方法如下：
1、试剂1号的制备
(1)制备用材料与仪器：以Tris缓冲液保存的PSA抗体，纯度超过99％，浓度为5mg/mL；异硫氰酸荧光素(FITC)，碳酸氢钠等试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱采购自GE公司；
(2)制备步骤：
①用0.2moL/L pH为9.0的碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的FITC溶液；
②按照PSA抗体与FITC分子比为1:10的比例在抗体溶液中加入步骤①所配制的FITC溶液，混合均匀后，室温下静置反应12h小时，得到PSA抗体-FITC偶联物；
③将步骤②的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，去除未反应的FITC，得到含有PSA抗体-FITC偶联物(即FITC标记的PSA抗体)的溶液；
④用上述实施例1或实施例2或实施例3中所得的稳定剂将步骤③所得含有PSA抗体-FITC偶联物的溶液稀释为工作液，即制得试剂1号。
2、试剂2号的制备
(1)材料与仪器：以Tris缓冲液保存的PSA单克隆抗体，纯度超过98％，浓度为4mg/mL，下称PSA抗体溶液；以磷酸缓冲液保存的碱性磷酸酶(ALP溶液)，ALP纯度为99％以上，ALP比活性为1200U/mg，ALP溶液浓度为17.5mg/mL；5mg/mL SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)溶液、10mg/mL 2-IT(2-亚氨基硫烷盐酸盐)溶液，其中，SMCC溶液采用固体粉末状交联剂SMCC用DMF(二甲基甲酰胺)溶解配制而成，2-IT溶液采用固体粉末状2-IT用DMF(二甲基甲酰胺)溶解配制而成，所用SMCC、2-IT均购自Sigma公司；Tris等化学试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱、AKTA-PURE蛋白纯化仪和Supperdex200凝胶纯化柱均为GE公司产品；
(2)制备步骤：
①取1mg PSA抗体溶液，加入10mg/mL的2-IT溶液2～4μL，室温静置30min，加入0.1moL/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min；用G-25凝胶柱除盐，收集活化的PSA抗体，于2-8℃保存备用；
②取1.2mg ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化的ALP抗体，于2-8℃保存备用；
③将步骤①所得活化的PSA抗体与步骤②所得活化的ALP抗体混合，于2-8℃条件下静置反应18h，通过Supperdex200凝胶纯化柱进行纯化，获得含有抗体PSA-ALP连接物(即ALP标记的PSA抗体)的溶液，于2-8℃保存备用；
④将步骤③所得抗体PSA-ALP连接物的溶液用含1％牛血清白蛋白(BSA)、10％新生牛血清、1％酪蛋白、0.5％Proclin300防腐剂、pH为8.0的0.1moL/L的Tris缓冲液稀释，稀释至PSA抗体-ALP偶联物浓度为0.5μg/mL，pH为8.0，即制得试剂2号。
3、磁分离试剂的制备
(1)材料与仪器：
磁微粒的悬浮液：磁微粒的质量百分含量为5％，磁微粒含羧基活性基团，每克磁微粒(干重)的羧基含量为0.8毫摩尔，磁微粒具有超顺磁性，磁微粒直径为1μm；
FITC抗体：羊抗FITC多克隆抗体，纯度为95％以上，稀释效价超过1:200万；
2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、Tris和其他试剂应达到化学纯。
(2)制备步骤：
①取100mg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用0.1moL/L pH为4.7的MES缓冲液10mL重悬；
②向步骤①所得液中加入2mg的FITC抗体，室温混悬60min；
③向步骤②所得液中加入0.5mL新配制的10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬2h；
④将步骤③所得液磁分离，去上清，用含1％牛血清白蛋白(BSA)、10％新生牛血清、1％酪蛋白、0.5％Proclin300防腐剂、pH为8.0的0.1moL/L的Tris缓冲液稀释，即制得磁分离试剂。
为充分证明本发明对异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定性保护效果，还依照现有技术常规配制了试剂1’号，检测其对异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定性的保护效果，以与本发明进行对照。试剂1’号的制备方法如下：
(1)制备用材料与仪器：以Tris缓冲液保存的PSA抗体，纯度超过99％，浓度为5mg/mL；异硫氰酸荧光素(FITC)，碳酸氢钠、Tris等试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱采购自GE公司；
(2)制备步骤：
①用0.2moL/L pH为9.0的碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的FITC溶液；
②按照PSA抗体与FITC分子比为1:10的比例在抗体溶液中加入步骤①所配制的FITC溶液，混合均匀后，室温下静置反应12h小时，得到PSA抗体-FITC偶联物；
③将步骤②的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，去除未反应的FITC，得到含有PSA抗体-FITC偶联物(即FITC标记的PSA抗体)的溶液；
④用含1％牛血清白蛋白(BSA)、10％新生牛血清、1％酪蛋白、0.5％Proclin300防腐剂、pH为8.0的0.1moL/L Tris的缓冲液将步骤③所得含有PSA抗体-FITC偶联物的溶液稀释为工作液，即制得试剂1’号。
将上述分别用本发明实施例1、实施例2、实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号，以及现有技术中用含1％牛血清白蛋白(BSA)、10％新生牛血清、1％酪蛋白、0.5％Proclin300防腐剂、pH为8.0的0.1moL/L的Tris缓冲液稀释制备的试剂1’号，均分别于37℃条件下放置6天(加速稳定性37℃条件下6天相当于4℃保存1年)、4℃条件下保存6天，然后通过搭配上述试剂2号、磁分离试剂及发光底物和清洗液等其他试剂盒组分测定校准品发光值和空白限，所用检测仪器为北京滨松公司的BHP9507型号化学发光免疫分析仪，检测后对测定结果进行分析对照。在上述检测分析中，所用发光底物为碱性磷酸酶的酶促化学发光底物，购自北京阿匹斯生物技术有限公司，为含0.6mmol/L二氧杂环乙烷类化合物的Tris缓冲液，pH 9.35。在上述检测分析中，所用校准品的制备方法如下：
(1)材料与仪器：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、Proclin300试剂至少达到化学纯；前列腺特异性抗原购自Fitzgerald公司，纯度超过98％；
(2)制备步骤：
①量取600mL纯化水于容器中，称取200mL新生牛血清加入容器中，充分搅拌混合均匀；
②称取磷酸氢二钾3.4g、磷酸二氢钾0.36g、Proclin300防腐剂0.02mL加入步骤①所得混合液中，充分搅拌至完全溶解；
③用4mol/L盐酸调步骤②所得混合液的pH为7.0-7.5；
④将步骤③所得混合液后用纯化水定容至1L，用0.2um滤器过滤，得校准品稀释液，于2-8℃保存待用；
⑤用步骤④所得校准品稀释液分别配制浓度为0、0.5、4、15、50、100ng/mL的前列腺特异性抗原溶液，作为校准品样本待测。
在上述检测分析中，所用清洗液的制备方法如下：
(1)材料与仪器：Tris、NaCl、Tween-20和Triton100试剂至少达到化学纯；
(2)制备步骤：
①量取80mL纯化水于容器中，称取Tris 1.21g和NaCl 0.85g于0.1L容器中，充分搅拌至完全溶解；
②称取Tween-20 0.5g、Triton100 0.5g依次加入到步骤①所得混合液中，充分搅拌，直至完全混匀；
③用4mol/L盐酸调步骤②所得混合液的pH为7.5-8.0；
④将步骤③所得混合液用纯化水定容至0.1L，用0.2um滤器过滤，得到清洗液浓缩液；
⑤取0.1L步骤④所得清洗液浓缩液加入1.4L纯化水进行1:15倍稀释后，得到清洗液。
应用上述试剂进行检测的具体操作步骤如下：
步骤 操作
1 加10μl校准品样本至检测管中
2 加50μl试剂1号至步骤1的检测管中
3 加50μl试剂2号至步骤1的检测管中
4 将检测管内试剂混匀后，37±0.5℃温育15分钟
5 加50μl磁分离试剂至步骤4的检测管中
6 将步骤5的检测管内试剂混匀后，37±0.5℃温育5分钟
7 磁分离去上清
8 加300μl清洗液至检测管中，混匀
9 磁分离去上清
10 重复步骤8、9，两遍
11 加200发光底物至检测管中，混匀3秒
12 检测发光强度
各校准品发光值测定结果见表1，所测各校准品的发光值变化比例见表2。
空白限评价中，检测“0”浓度校准品，重复检测20次，计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程y＝ax+b，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。具体检测结果如下：
现有技术试剂1’号4℃保存6天的空白限评价见表3，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图1；
现有技术试剂1’号37℃保存6天的空白限评价见表4，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图2；
由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限评价见表5，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图3；
由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限评价见表6，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图4；
由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限评价见表7，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图5；
由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限评价见表8，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图6；
由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限评价见表9，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图7；
由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限评价见表10，A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程参见图8。
通过对照上述检测结果可见，本发明提供的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂对FITC与抗原或抗体生成的偶联物能够进行有效保护，能够使FITC与抗原或抗体的偶联物工作液保存一年(2～8℃)后活性剩余达到95％以上，同等条件下，相比现有技术具有显著的稳定性，使偶联物活性保持时间显著延长，有效避免了活性降低，从而也有效避免了由于其稳定性不好导致试剂盒的有效期过短、空白限等性能参数逐渐下降，进而为免疫分析精确测定提供了保障。
表1测定校准品发光值的对照表
表2测定校准品的发光值变化比例
表3现有技术的试剂1’号4℃保存6天的空白限
表4现有技术试剂1’号37℃保存6天的空白限
表5由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限
表6由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限
表7由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限
表8由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限
表9由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号4℃保存6天的空白限
表10由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号37℃保存6天的空白限
本发明不限于上述实施方式，本领域技术人员所做出的对上述实施方式任何显而易见的改进或变更，都不会超出本发明的构思和所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂，其特征在于，所述稳定剂的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶、多聚赖氨酸和水。
2.根据权利要求1所述的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂，其特征在于，每1L所述稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲烷0.01mol、β-乳球蛋白1g～5g、N，N二甲基二吖啶硝酸盐1mg～3mg、鱼皮凝胶1g～3g、多聚赖氨酸0.1g～1g、余量为水。
3.根据权利要求1或2所述的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂，其特征在于，所述稳定剂的pH为7～9。
4.根据权利要求1或2所述的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂，其特征在于，所述稳定剂的pH为8。
5.一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的制备方法，将权利要求1-4中任一项所述的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的各原料在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀，得到保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂。
6.根据权利要求5所述的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的制备方法，其特征在于，在室温下，将所述稳定剂的各原料在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀后，用4mol/L盐酸调pH至7～9，制备完成后置于2～8℃下保存。
7.一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的用途，其特征在于，将权利要求1-4任一项所述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂用于免疫分析测定。
8.根据权利要求7所述的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的用途，其特征在于，在免疫分析测定中，将异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物用所述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂稀释。
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