CN101625365A - 一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β-内酰胺酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β－内酰胺酶的方法，涉及一种光纤生物传感器，其包括光学系统、电子学系统、数据采集系统及控制与处理系统，其还包括光纤和传感器，其中光纤材料为聚苯乙烯，传感器上设有敏感膜，敏感膜上含有利用戊二醛固定的Cy5标记的β－内酰胺酶单克隆抗体。该单克隆抗体通过以β－内酰胺酶为抗原免疫小鼠，细胞融合等过程制备。本发明具有高灵敏度、抗电磁辐射、抗电子频率干扰、抗腐蚀性，且仪器体积小，方便携带，所需检测样品少，响应时间快，易于操作和成本低廉等优点。可广泛用于液态牛奶、奶粉、固体样品等乳制品中β－内酰胺酶的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品β-内酰胺酶的方法，属于生物技术领域。
背景技术
“解抗剂”学名β-内酰胺酶，它是针对β-内酰胺类抗生素提炼出来的一种化学品，是一种抗生素分解剂，它能有效分解牛奶中残留的抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂，该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。但是为了追求利益，一些商贩使用它来降解掉牛乳中残留的抗生素，生产所谓的“人造无抗奶”，致使抗生素酶解后的残留物进入乳制品，对人体健康造成伤害，同时它也能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。因此，迫切需要快速的检测方法，从而能准确的检测乳制品中β-内酰胺酶。
目前，国内常用的牛奶中的抗生素检测主要依据GB方法进行，此方法操作比较简便，比较适合基层单位使用，但是存在着灵敏度较低、操作误差较大等问题，比如：TTC显色时间的掌握和目测、菌种的保存和接种量等。也有相关机构采用产生头孢素法来检测牛奶中的β-内酰胺酶，这种方法灵敏度相对较高，但是能够检测的β-内酰胺酶的类别比较少，实用性较差。
生物传感器是以生物化学和传感技术为基础，用酶、抗体、细胞等生物活性物质作为分子识别元件，配上信号转换器和电子测量仪所构成的分析工具。生物传感器具有准确、灵敏、易操作和可重复使用等优点。其中光纤传感器是一种光电转换设备，抗腐蚀、抗电磁辐射和电子频率干扰，同时光纤低衰减率的高质量传输可实现对危险地区的远距离检测。由于光纤传感器的上述特点，其在食品安全检测控制领域的应用有着广阔的前景。
利用生物传感器，特别是光纤生物传感器检测乳制品中β-内酰胺酶的方法，还未见有此类专利报道。本发明专利利用生物传感器技术建立了一种快速检测乳制品中β-内酰胺酶方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测β-内酰胺酶的光纤生物传感器。该传感器是由光学系统、电子学系统、数据采集系统及控制与处理系统组成。所用的光纤材料为聚苯乙烯。
本发明的另一个目的在于提供一种利用光纤生物传感器检测β-内酰胺酶的方法，其检测原理为：
在光纤表面加上载有β-内酰胺酶抗体的生物敏感元件，当倏逝波穿过生物敏感元件时，或产生光信号，或导致倏逝波与光纤内传播光线的强度、相位或频率的改变，而测量这些变化，即可获得生物敏感元件上变化的信息。
本发明所述的一种利用光纤生物传感器检测β-内酰胺酶的方法，具体包括以下步骤：
所述的β-内酰胺酶抗体制备：取β-内酰胺酶100μg、卡介苗5mg，与等体积佛氏完全佐剂研磨后注入6周龄雌性BALBPC小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐剂，隔周腹腔注射5次，融合前3天腹腔注射50μg β-内酰胺酶标准溶液，以50％PEG4000为融合剂，将小鼠脾细胞与NS1细胞融合，IMDM2HAT选择培养，2周后换HT培养液培养。以β-内酰胺酶为抗原，经间接ELISA法筛选阳性克隆后的杂交瘤细胞，所得细胞株继续扩增培养。将阳性细胞株注入BALBPC小鼠腹腔，诱生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及琼脂双扩散法检测β-内酰胺酶抗体；
所述的抗体包被液为0.02mol/L的Na2CO3和0.04mol/L的NaHCO3溶液，pH值为9.6；
所述的稀释液为0.5％的干酪素和0.01mol/L的PBS，pH值为9.6；
所述的清洗液为0.02mol/L磷酸盐，0.05％的TritonX-100和0.1g/L的NaN3，pH值为7.2；
所述β-内酰胺酶标准溶液的配制：取一定量的β-内酰胺酶，配制为浓度分别为0、5、10、50、100和200μg/L的标准溶液；
所述包被抗体的制备：用包被液将β-内酰胺酶抗体稀释至一定浓度并装入毛细管中，将光纤插入4℃孵育12～16h，然后可用于相应的免疫反应。暂时不用时可置4℃保存；
所述标记抗体的制备：将所测标本的抗体用稀释液稀释到一定浓度，在碱性环境下与荧光素染料Cy5结合后，通过凝胶过滤分离到标记了Cy5的单克隆抗体。
所述抗体固定的制作：通过三氨基丙基三乙基硅烷等硅烷类物质将光纤表面硅烷化，然后借助双功能交联剂戊二醛将标记了Cy5的β-内酰胺酶单克隆抗体进行固定。
所述标准曲线的制作：将标记了Cy5的β-内酰胺酶单克隆抗体固定到活化器上，放入光纤生物传感器，取一定量的不同浓度的β-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，约300s后，将检测结果进行显示和保存。记录不同浓度的β-内酰胺酶标准溶液所对应的光信号值，制作标准曲线。
所述乳制品中β-内酰胺酶的检测方法：进行测试时，可直接将经过适当预处理的样品放入光纤生物传感器进行测试，根据所测得的光信号，对照标准曲线，即可求出样品中β-内酰胺酶的浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下的积极效果：
(1)本发明首次公开了一种光纤生物传感器，可用于检测乳制品中的β-内酰胺酶；
(2)抗原-抗体特异性结合决定了该光纤生物传感器的高灵敏度，不受其他干扰，降低了检出下限，且该光纤传感器具有抗电磁辐射、抗电子频率干扰、抗腐蚀等优点；
(3)体积小，方便携带，且所需检测样品少；
(4)使用荧光取代了放射性物质，响应时间快，易于操作和成本低廉。
具体实施例
本发明的内容可通过以下实施例作进一步详细阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
β-内酰胺酶抗体制备
取β-内酰胺酶100μg、卡介苗5mg，与等体积佛氏完全佐剂研磨后注入6周龄雌性BALBPC小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐剂，隔周腹腔注射5次，融合前3天腹腔注射50μgβ-内酰胺酶标准溶液，以50％PEG4000为融合剂，将小鼠脾细胞与NS1细胞融合，IMDM2HAT选择培养，2周后换HT培养液培养。以β-内酰胺酶为抗原，经间接ELISA法筛选阳性克隆后的杂交瘤细胞，所得细胞株继续扩增培养。将阳性细胞株注入BALBPC小鼠腹腔，诱生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及琼脂双扩散法检测β-内酰胺酶抗体，制备β-内酰胺酶抗体。
实施例2
(1)包被抗体的制备
用包被液将β-内酰胺酶抗体稀释至一定浓度并装入毛细管中，将光纤插入4℃孵育12～16h，然后可用于相应的免疫反应。暂时不用时可置4℃保存。
(2)标记抗体的制备
将所测标本的抗体用稀释液稀释到一定浓度，在碱性环境下与荧光素染料Cy5结合后，通过凝胶过滤分离到标记了Cy5的单克隆抗体。
(3)抗体固定的制作
通过三氨基丙基三乙基硅烷等硅烷类物质将光纤表面硅烷化，然后借助双功能交联剂戊二醛将标记了Cy5的β-内酰胺酶单克隆抗体进行固定。
(4)具体实施方式
将标记了Cy5的β-内酰胺酶单克隆抗体固定到活化器上，放入光纤生物传感器，检测时，取一定量预处理好的样品或β-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间后，将检测结果进行显示和保存。记录不同样品溶液所对应的光信号值。
实施例3
(1)标准曲线的制作
取一定量的不同浓度的β-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，约300s后，将检测结果进行显示和保存。记录不同浓度的β-内酰胺酶标准溶液所对应的光信号值，制作标准曲线。
(2)样品的预处理及检测
称取不含β-内酰胺酶的奶粉1g，加入5倍体积DMSO振荡1h，离心取上清液2μl。向上述清液中添加终浓度为50μg/L的β-内酰胺酶，稀释10倍作为检测对照样品，利用光纤生物传感器进行测试。
取20ul的样品，滴加到光纤传感器的敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，等待数据稳定，约300s后，读取所测计算机所显示的信号的强度，对照所作的β-内酰胺酶标准曲线，求得样品溶液β-内酰胺酶的含量，乘以样品稀释倍数10倍，得出所测样品中β-内酰胺酶的含量。
Claims (6)
1.一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β-内酰胺酶的方法，其步骤为：
(1)β-内酰胺酶抗体的制备
取β-内酰胺酶100μg、卡介苗5mg，与等体积佛氏完全佐剂研磨后注入6周龄雌性BALBPC小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐剂，隔周腹腔注射5次，融合前3天腹腔注射50μg β-内酰胺酶标准溶液，以50％PEG4000为融合剂，将小鼠脾细胞与NS1细胞融合，IMDM2HAT选择培养，2周后换HT培养液培养。以β-内酰胺酶为抗原，经间接ELISA法筛选阳性克隆后的杂交瘤细胞，所得细胞株继续扩增培养。将阳性细胞株注入BALBPC小鼠腹腔，诱生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及琼脂双扩散法检测β-内酰胺酶抗体。
(2)包被抗体的制备
用包被液将β-内酰胺酶抗体稀释至一定浓度并装入毛细管中，将光纤插入，4℃孵育12～16h，4℃保存备用。
(3)标记抗体的制备
将所测标本的抗体用稀释液稀释到一定浓度，在碱性环境下与荧光素染料Cy5结合后，通过凝胶过滤分离到标记了Cy5的单克隆抗体。
(4)固定抗体的制备
将通过三氨基丙基三乙基硅烷等硅烷类物质将光纤表面硅烷化，然后借助双功能交联剂戊二醛将标记了Cy5的β-内酰胺酶单抗进行固定。
(5)标准曲线的制作
将标记了Cy5的β-内酰胺酶单抗固定到活化器上，放入光纤生物传感器，取一定量的不同浓度的β-内酰胺酶标准溶液滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，约300s后，将检测结果进行显示和保存。记录不同浓度的β-内酰胺酶标准溶液所对应的光信号值，制作标准曲线。
(6)样品的检测
取一定量的待测样品滴加到传感器敏感膜上，再将传感器插入到系统接口中，按下测试键，响应一段时间，待数据稳定后，记录并保存测得信号值，对照β-内酰胺酶标准曲线，得出样品中β-内酰胺酶的含量。
2.如权利要求3所述的一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β-内酰胺酶的方法，其中所述的包被液为0.02mol/L的Na2CO3和0.04mol/L的NaHCO3，pH值为9.6。
3.如权利要求3所述的一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β-内酰胺酶的方法，其中所述的稀释液为0.5％的干酪素和0.01mol/L的PBS，pH值为9.6。
4.如权利要求3所述的一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β-内酰胺酶的方法，其中所述的清洗液为0.02mol/L磷酸盐，0.05％的TritonX-100和0.1g/L的NaN3，pH值为7.2。
5.一种利用光纤生物传感器快速检测乳制品中β-内酰胺酶的方法，其特征在于其包括光学系统、电子学系统、数据采集系统及控制与处理系统，其特征在于其还包括光纤和传感器。
6.根据权利要求书5所述的光纤材料为聚苯乙烯。
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