CN102268408B - 分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为：Pshw-sp20，该细胞株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC№C201124。其制备方法：1)通过药敏分析筛选出产β-内酰胺酶的菌株；2)利用分子生物学手段获得高产β-内酰胺酶的保守序列；3)将β-内酰胺酶表达在细菌BLR中；4)初步纯化表达蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠；5)在化学物质PEG作用下，SP2/0细胞和免疫的脾细胞融合；6)筛选、克隆获得能够分泌抗β-内酰胺酶抗体杂交瘤细胞株。

Description

分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法

技术领域

本发明涉及采用分子生物学、免疫学、细胞生物学等方法获得能够稳定分泌抗β-内酰胺酶抗体的细胞株，特别是一种分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法。

背景技术

β-内酰胺类抗生素的抗菌作用强、抗菌谱广、毒性低，是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素。这类药物的广泛使用(特别是滥用和误用)以及致病菌的突变，致使病原菌产生对该药物严重的耐药性问题。病原菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药的最重要的机制是质粒介导或染色体突变使病原菌分泌的一种胞外酶-β-内酰胺酶，该酶可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。微生物活性消失法检测β-内酰胺酶，如待检菌株产生β-内酰胺酶，破坏了青霉素，则在划线两边有枯草芽胞菌生长，否则指示菌仍呈很大抑菌环。β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与被打开β-内酰胺环结合，使蓝色的淀粉-碘复合物转变成无色，提示该菌产生β-内酰胺酶。青霉素被β-内酶胺酶水解后成青霉素酸，pH值下降6.8以下，用酚红指示剂，由红(紫)色(原液：枸橼酸缓冲液pH8.5)→黄色(pH6.8以下)。头孢硝基噻吩(Nitrocefin)的β-内酰胺环被β-内酰胺酶打开，基质由黄色变成红色。免疫学分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法，目前药物残留免疫分析技术主要分三大类：相对独立的分析方法、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法、免疫受体法。1973年荷兰Van Weeman、Schurrs及瑞典Engvall、Perlmann分别提出酶联免疫吸附法，30多年来国内外学者对免疫学方法检测食品中抗生素进行了大量研究。免疫学分析法快速、灵敏、特异，但前期设备投入、单样检测费用高，如果全部采用免疫法测定乳中的抗生素，按保守估算，每吨牛乳至少要增加100元的检测费用，乳品厂一年增多几十至几百万检测费，企业难以接受，不适合当前我国乳品企业发展。各国对β-内酰胺酶的分析方法按用途、作用和步骤分为筛选法、定量法和确证法三个级别。对原料乳供应者来说，知道是否有β-内酰胺酶即可判断该不该出售或收购，所以适合对大批量乳样进行初筛的微生物活性消失法和免疫学方法成为近年来的研究热点。

发明内容

本发明的目的之一在于获得分泌抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株特异产生抗β-内酰胺酶的抗体；

本发明的目的之二在于提供一种上述细胞株的制备方法；

本发明的目的之三在于提供上述细胞株的应用方法。

本发明的目的按照下述方案实现：

分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为：杂交瘤细胞Pshw-sp20，该细胞株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC№C201124，保藏日期：2011年4月13日；

所述的分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株由以下元件构成：

SHV型β内酰胺酶基因；

骨髓瘤细胞SP2/0基因；

细胞株是杂交瘤细胞株，是用SHV型β内酰胺酶免疫小鼠，用脾细胞中B细胞和SP2/0细胞融合得出。

分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

1)通过药敏分析筛选出产β-内酰胺酶的菌株；

2)利用分子生物学手段获得高产β-内酰胺酶的保守序列；

3)将β-内酰胺酶表达在细菌BLR中。

4)初步纯化表达蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠；

5)在化学物质PEG作用下，SP2/0细胞和免疫的脾细胞融合；

6)筛选、克隆获得能够分泌抗β-内酰胺酶抗体杂交瘤细胞株。

本发明利用β-内酰胺酶基因在大肠杆菌中能够表达特性，将β-内酰胺酶在大肠菌中大量表达，表达产物包涵体直接可以作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，当免疫抗体效价达到融合要求时，在融合前3d尾静脉加强注射免疫原，取免疫的Balb/c小鼠的脾脏与SP2/0细胞在PEG4000作用下，融合、筛选、克隆获得3株稳定分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Balb/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株，收集腹水初步纯化，获3株单克隆抗体，亚类鉴定分属IgG2a和IgM型抗体。

附图说明

图1：目的基因PCR图；图中：1.DL 2000Marker；2.PCR产物。

图2：构建的基因工程菌株质粒酶切图；图中：1：DL2000marker；2：pET-28a-SHV-12NdeI and BamH1酶切产物3：pEASY-T1 NdeI and BamH1酶切产物；4：pET-28a-SHV-12质粒

图3：纯化的蛋白质电泳图。图中：(a)M：低分子量标准markers；1，2，3：超声波破碎菌体上清；4：空载体菌体裂解；5，6：37℃，1mM IPTG诱导菌体经裂解液裂解(b)M：低分子量标准markers；1：包涵体；(c)1，Nitrocefin；2：空载体菌体裂解；3：超声波破碎菌体上清；

图4：包涵体免疫小鼠血清效价图。

图5：细胞融合后培养的杂交瘤细胞株。

具体实施方式

本发明是一种分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为：杂交瘤细胞Pshw-sp20，该细胞株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC №C201124，保藏日期：2011年4月13日；

所述的分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株由以下元件构成：

SHV型β内酰胺酶基因；

骨髓瘤细胞SP2/0基因；

细胞株是杂交瘤细胞株，是用SHV型β内酰胺酶免疫小鼠，用脾细胞中B细胞和SP2/0细胞融合得出。

上述细胞株的制备方法：

实验材料

大肠杆菌DH5α、BLR(DE3)、DH5α(pUC 19)、质粒pET-28a为本实验室保藏；限制性核酸内切酶、连接酶购自takara有限公司；BsrG I购自biolab有限公司；DNA回收试剂盒购自Promega公司；其余试剂均为国产纯；弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，RPMI-1640细胞培养基，HAT、HT培养基为Gibco公司产品；PEG4000为Promega公司产品；NTE缓冲液(0.13MNaCl、0.05M Tris-Cl、0.001M EDTA)配制1000mL。考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB-G-250100mL溶于50mL乙醇溶液，后加入100mL磷酸，加蒸馏水定容至1000mL。标准牛血清白蛋白的配置。羊抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM，IgA等免疫血清试剂盒为Sigma公司产品。

实验步骤

1通过药敏分析筛选出产β-内酰胺酶的菌株。

2利用分子生物学手段获得高产β-内酰胺酶的保守序列：

2.1引物的设计和PCR扩增SHV-12ESBLs目的基因：

以GenBank上的(序列号为EU418910.1)SHV-12型ESBLs为参考模板，用PrimerPremier6.0软件设计含Nde I和BamH I酶切位的正反向引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

Forward Primer：5′CCCATATGCGTTTTATTCGCCTGTGTATT3′

Reverse Primer：5′CGGATCCTTAGCGTTGCCAGTGCTCGATC3′

提取产ESBLs大肠杆菌耐药菌株质粒DNA。根据设计引物进行PCR扩增目的基因，PCR反应条件为：预变性95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃45s，共30个循环，再延伸72℃10min。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2SHV-12克隆载体的构建

切胶回收目的条带，将回收产物与pEASY-T1载体按3∶1进行15min、25℃快速连接，转化于DH5α感受态细胞中，菌落PCR和质粒酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。

3将β-内酰胺酶表达在细菌BLR中：

3.1SHV-12ESBLs表达载体的构建和表达

采用Nde I和BamH I双酶切SHV-12片段和pET-28a(+)质粒，切胶回收目的片段876bp和载体片段5329bp，按3∶1的分子数用T4连接酶16℃连接3h，转化于DH5α感受态细胞中，菌落PCR和质粒酶切鉴定，鉴定正确命名为pET-28a-SHV-12。将上述重组质粒转化与BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落培养12h后，取1ml菌液转接于100mlTM培养基中，37℃、250r/min震荡至为A600时0.6～0.8。向其中加入IPTG至终浓度分别为0.5mM、1mM、1.5mM。温度分别为28℃、33℃、37℃培养4h，6000r/min离心10min，弃上清。菌体20℃冻存。以超声破碎菌体法和细胞裂解液法破碎细胞后加等量的2×蛋白上样液煮沸5min进行12％SDS-PAGE电泳。同时用Nitrocefin试剂测试裂解上清，能使Nitrocefin由黄色变为血红色为有活性力的ESBLs。

3.2表达产物包涵体的提取

菌体沉淀重悬于5ml的50mmol/L Tris·HCL-2mmol/LEDTA中，加入溶菌酶至终浓度100ug/ml，再加入0.5ml 1％TritonX-100，30℃温育15min，超声波处理10min，然后12000r/min离心15min，收集的沉淀物即为包涵体粗提物。将该包涵体重溶于20ml的生理盐水中，超声破碎5min，然后10000rpm离心15min，收集沉淀，重溶于2ml生理盐水中，用紫外分光光度计波长A280测定蛋白质含量，SDS-PAGE电泳，分装冻存。

4初步纯化表达蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠：

4.1表达产物免疫Balb/c小鼠

第一周取包涵体100μg加等量的弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第二周取包涵体100μg加等量的弗氏不完全佐剂乳化肌肉注射；第三周取包涵体100μg腹腔注射，间接ELISA法测定免疫效价；第四周取包涵体100μg尾静脉注射加强免疫。

4.2检测SHV-12ESBLs的间接ELISA方法的建立

4.2.1间接ELISA方法的操作程序

(1)抗原包被：用SHV-12ESBLs最佳包被量包被板，100μl/孔加入，4℃过夜。

(2)洗涤：倾去孔内的液体，用洗涤液注满各孔(约300μl)，放置3min，然后去尽洗涤液，如此反复3次，最后一次在吸水纸上拍干。

(3)封闭：将5％牛血清PBS封闭液加入酶联板中，每孔200μl，37℃封闭2h后，然后倒掉封闭液，在吸水纸上拍干。

(4)洗涤：同(2)。

(5)加血清或抗体：每孔100ul，37℃反应60min。

(6)洗涤：同(2)。

(7)加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG：每孔100ul(10000倍稀释)，37℃反应60min。

(8)洗涤：同(2)。

(9)加底物：每孔加入新配制的底物溶液100μl，37℃显色15min。

(10)终止反应：每孔加入2mol/LH2S04终止液50μl终止反应。

(11)用酶联仪读出OD490nm值。

(12)检测结果的判：OD490nm值≥2.1时判为阳性；否判为阴性。

5在化学物质PEG作用下，SP2/0细胞和免疫的脾细胞融合：

5.1抗SHV-12ESBLs单抗杂交瘤细胞株的建立

5.1.1饲养细胞的制备

在融合前12h，取一只没有免疫的健康BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入75％的酒精中消毒10min，取出，移入超净工作台，无菌剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用10ml玻璃注射器注入腹腔10ml完全RPMI-1640培养基，按摩腹部后将液体重新吸回注射器，用5ml完全RPMI-1640培养基重复一次，合并两次吸出的液体，将合并液体补加到15ml并充分混匀细胞，将饲养细胞滴入3块96孔培养板，每孔50μl。放入37℃5％CO2培养箱中培养。

5.1.2免疫脾细胞的制备

将免疫好的小鼠眼球采血后放入75％酒清中10min后无菌取脾。在无菌橱内将小鼠放入平皿内，用灭过菌的外科器械将脾取出，除去脂肪和结缔组织，用洗液冲洗，放在无菌铜网上，用无菌的注射器内芯碾磨，碾磨完后静置2min，以使未碾碎的组织块沉淀。吸出上清1000rpm离心10min，去上清后即为制备好的免疫脾细胞。

5.1.3细胞融合

将已制备好的骨髓瘤细胞与脾细胞的混合(两种细胞比例为脾细胞：sp2/0细胞是5∶1)悬液900rpm离心10min。倒去上清液，用力振动离心瓶，振散细胞，立起离心瓶，在1min内滴加0.5ml 50％PEG，边加边摇动，加完后静置90秒，在2min内滴加2ml无血清1640培养液，在2min内加4ml无血清1640培养液，补充液体至30ml，静置10min后，1000rpm离心10min，倒去上清液轻轻振散细胞，加入15ml含20％新生牛血清的HAT1640培养液混合成细胞悬液。然后将融合细胞逐孔加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，在37℃5％CO2的培养箱中培养。在第4、6、8、10天每孔吸去50μl培养液上清，加入50μl HAT培养液，第11天改换含20％新生牛血清的HT1640培养液。

6筛选、克隆获得能够分泌抗β-内酰胺酶抗体杂交瘤细胞株：

6.1阳性孔细胞克隆化

经间接ELISA法检测为阳性的孔，将细胞吹打成细胞悬液，进行细胞计数，然后按照1.5、3个/孔两个稀释度稀释细胞悬液，加入96孔培养板上培养。培养一段时间后对有细胞克隆生长的培养孔，待其生长至一个视野的1/2以上时即可按抗体阳性孔检测的方法进行检测。检测为阳性的孔再次按同样的方法进行克隆、筛选，直至克隆细胞生长的细胞孔全部都为阳性为止，挑选生长良好且阳性较强细胞孔的细胞移入12孔板、6孔板、5ml培养瓶、10ml培养瓶、50ml培养瓶逐步扩大培养，换液时收集培养上清冻存备用。

6.2细胞的冻存与复苏：

将新生牛血清与二甲基亚砜(DMSO)按9∶1的比例混合配制冻存液。

将克隆扩大培养且处于对数生长期的杂交瘤细胞倒掉上清培养液，用1640洗液将其吹散，完全悬浮于液体中。将细胞放入离心瓶，800rpm离心10min，倒掉上清，按每瓶细胞(10ml培养瓶)加入1ml冻存液，与细胞混匀后分装于1ml冻存管中，并作好标记。

用10层厚度的纱布将标记好的细胞包好，按4℃30min，-20℃2h，-80℃2h，最后放入液氮中的顺序冻存细胞。

复苏细胞时，将细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中融化1min，然后1000rpm离心10min，无菌条件下打开冻存管，用完全1640培养基5ml将细胞移入5ml细胞培养瓶中，12h后待细胞贴壁后，换液一次。

6.3抗SHV-12ESBLs单克隆抗体生产

取成年BALB/c雌性小鼠，提前一周每只腹腔注射0.5ml石蜡油。另取处在对数生长期的杂交瘤细胞，倒掉培养上清，用无血清1640培养液悬浮细胞，进行计数，并调整细胞数到6×105个/ml。将其注入经石蜡油处理过的小鼠腹腔内，每只注入0.5ml。待小鼠腹腔明显胀大后，用75％酒精消毒皮肤，用注射器刺入腹腔下部，采集腹水，三天后再采一次。收集到的腹水置37℃温箱2h，4000rpm离心10min。吸取上清液，56℃水浴灭活30min后，用间接ELISA法测其效价。

6.4抗SHV-12ESBLs单克隆抗体IgG的提纯

以硫酸钠盐法粗提抗体球蛋白。取单抗腹水3000rpm离心30min，弃沉淀物；上清液用0.8um滤膜过滤；取滤液加入等量36％的硫酸钠溶液，混合均匀后，37℃水浴2h，并不断摇动，3000rpm室温离心30min；弃上清，沉淀用去离子水溶解，再加入等量32％的硫酸钠溶液，室温作用1h，并不断摇动，3000rpm离心30min；沉淀溶于去离子水中，加入等量28％的硫酸钠溶液，室温作用1h，并不断摇动，3000rpm离心25min；沉淀溶于一定量的重蒸水中，4℃透析24h，用紫外法测定含量后，分装，-80℃保存备用。

 <110>宁夏兽药饲料监察所吴彦虎、徐薇薇、周学章

<120>分泌抗β内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株及其制备方法

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cccatatgcg ttttattcgc ctgtgtatt 29

 

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Claims (1)

1.分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为：Pshw –sp20，该细胞株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC №C201124；

分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

1）通过药敏分析筛选出产β-内酰胺酶的菌株；

2）利用分子生物学手段获得高产β-内酰胺酶的保守序列；

3）将β-内酰胺酶表达在细菌BLR中；

4）初步纯化表达蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠；

5）在化学物质PEG作用下，SP2/0细胞和免疫的脾细胞融合；

6）筛选、克隆获得能够分泌抗β-内酰胺酶抗体杂交瘤细胞株。

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