CN114689875B - 一种测定tat含量的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定TAT含量的试剂盒及其制备方法，试剂盒包括R1、R2、R3试剂，R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒，R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体，R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体；方法包括：取活化磁微粒、链霉亲和素混匀，得到偶联有链霉亲和素的磁性微粒；取活化后的凝血酶抗体、生物素混匀，得到生物素标记的凝血酶抗体；取活化后的抗凝血酶抗体、碱性磷酸酶混合，得到碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体；放至保存液中保存，得到试剂盒；本发明利用链霉亲和素、生物素的放大效应，采用磁微粒作为载体，碱性磷酸酶作为化学发光标记物，使得灵敏度高、特异性强、试剂稳定性好、结果准确可靠。

Description

一种测定TAT含量的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种测定TAT含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术
血栓性疾病是指血栓形成和栓塞2个过程所引起的一系列疾病，为常见病、多发病，其发病率在全球有逐年上升的趋势，早期诊断和积极预防可以降低其发病率和死亡率。血栓四项包括血栓调节蛋白、凝血酶-抗凝血酶复合物、纤溶酶-a2纤溶酶抑制物复合物和组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物，这4种物质均在凝血、纤溶系统的启动阶段明显升高。其中凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）是体内凝血酶原激活凝血酶后，迅速被抗凝血酶结合，生成共价键相连的无活性不可逆复合物，由此维持凝血-抗凝血之间的生理平衡，目前认为该复活物的形成是凝血酶生成的直接证据，标志凝血系统的激活。检测TAT的血浆水平可以监测凝血系统的激活情况，被认为是血栓性疾病的早起分子标志物，早期、准确得到检出对DIC、DVT、PE以及心房颤动等患者早期接受治疗至关重要。
目前临床上已有的检测TAT的方法很少，主要是RIA法和酶联免疫吸附法。RIA法和酶联免疫吸附法存在明显的缺陷，其中RIA法参考值高，灵敏度低，且有放射性污染；酶联免疫吸附法检测时间长、敏感度低、特异性差、批间差等多个问题，而化学发光免疫分析技术其灵敏度和精确度与传统的RIA法和酶联免疫吸附法高出几个数量级。其以灵敏度高、特异性强、试剂稳定、监测范围宽、操作简单等优点被广大研究人员所认可，并正逐渐替代传统的生物检测技术。
并且TAT试剂在储存过程中会受多方面因素的影响，例如经过冻融后，会破坏试剂的性能，使试剂体系不稳定，从而影响测试灵敏度，同时也影响到试剂后续的长期稳定性。考虑我国南北地域跨度之大，在冬季运输过程中，因温度较低、零下温度时间过长等情况，会有存在试剂冻融的现象出现，故对试剂的运输带来较大的考验与难度，也对试剂到达客户端后的稳定性带来干扰。综上所述，提出一种灵敏度高、特异性强、稳定、抗冻融的TAT试剂是目前我们亟需解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种测定TAT含量的试剂盒及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种测定TAT含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与R3试剂，所述R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒，所述R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体，所述R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体。
进一步地，在所述试剂盒中，优选所述磁微粒为超顺磁微粒，表面覆盖有羧基官能团，粒径为1.0-3.0µm。
进一步地，在所述试剂盒中，优选所述R1试剂还包括用于保存偶联有链霉亲和素的磁微粒的第一保存液，所述第一保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-2.0%丙三醇、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为200-600mM的Tris-HCl缓冲液，所述第一保存液的pH为7.2-7.4。
进一步地，在所述试剂盒中，优选所述R2试剂还包括用于保存生物素标记的凝血酶抗体的第二保存液，所述第二保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为30-100mM的HEPES缓冲液，所述第二保存液的pH为7.0-7.4。
进一步地，在所述试剂盒中，优选所述R3试剂还包括用于保存碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体的第三保存液，所述第三保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为20-70mM的HEPES缓冲液，所述第三保存液的pH为7.0-7.4。
一种上述所述的测定TAT含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将经过羧基修饰的微粒溶液在磁场作用下磁分离，去上清，用活化缓冲液清洗，然后洗涤后的磁微粒用活化缓冲液重悬后加入第一活化剂活化，得到活化磁微粒；
S2、取活化磁微粒、链霉亲和素按比例混匀，混合后加入封闭液，得到偶联有链霉亲和素的磁性微粒，放至第一保存液中保存，得到R1试剂；
S3、取凝血酶抗体、生物素分别与第二活化剂、第三活化剂进行活化，将活化后的凝血酶抗体、活化后的生物素按比例混匀，得到生物素标记的凝血酶抗体，放至到第二保存液中保存，得到R2试剂；
S4、取抗凝血酶抗体、碱性磷酸酶分别与第四活化剂、第五活化剂混合反应，得到活化后的抗凝血酶抗体、活化后的碱性磷酸酶，将两者按比例混合，得到活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，放至到第三保存液中保存，得到R3试剂；
S5、将R1试剂、R2试剂、R3试剂组装，得到试剂盒。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤S1中，所述活化缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸，浓度为10-100mM，pH为5.4-6.2；所述第一活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，浓度为8 -12mg/mL；所述磁微粒活化时间为40-100min。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤S2中，所述封闭液包括以下质量百分比的组分：0.1-3.0%BSA、0.1-1.0%海藻糖、0.1-1.0 %吐温80，余量为10-200mM磷酸盐缓冲液， 所述磷酸盐缓冲液的pH为6.8-7.3。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤S2中，所述链霉亲和素与所述活化磁微粒的配比为1：（5-20），两者的反应时间为1-4h。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤S3中，第二活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0-20.0mg/mL，活化时间为5-20min；
第三活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺溶液，浓度为1.0-30.0mg/mL，活化时间为1-15min。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤S3中，活化后的凝血酶抗体与活化后的生物素配比为1:（5-20），两者的偶联时间为1h-5h。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤S4中，第四活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0 -20.0mg/mL，活化时间为5-20 min；
第五活化剂为琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，浓度为1.0-10.0mg/mL，活化时间为5-20 min。
进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤S4中，活化后抗凝血酶抗体与活化后的碱性磷酸酶配比为1:（5-20），标记时间为15-48h。
本发明的有益效果：本发明提供的一种测定TAT含量的试剂盒及其制备方法，试剂盒包括R1试剂、R2试剂与R3试剂， R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒， R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体， R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，本发明的试剂盒采用发光免疫分析两步法定量检测凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物（TAT），R2试剂中的生物素标记的凝血酶抗体与被检样本中的TAT发生特异性反应，再与R1试剂的偶联有链霉亲和素的磁微粒结合；去除未反应物质后，加入R3试剂，R3试剂的碱性磷酸酶（ALP）标记的抗凝血酶抗体与磁微粒上的TAT 发生特异性反应；再次去除未反应物质后，添加发光底物经磁微粒上的ALP 分解并发光，测定其发光强度，发光强度随被检样本中TAT浓度的增加而增加；本发明提供的试剂盒利用链霉亲和素和生物素的放大效应，采用磁微粒作为载体，碱性磷酸酶作为化学发光标记物，使得测定灵敏度高、特异性强、试剂稳定性更好，尤其是短时间冻融后稳定性好，结果准确可靠，在临床检验和用药指导等方面有广阔的应用前景。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1的试剂盒与对比试剂的检测结果的线性回归曲线。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。
一种测定TAT含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂与R3试剂，R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒，R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体，R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体。
进一步地，磁微粒为超顺磁微粒，磁微粒可为磁性聚苯乙烯微球，表面覆盖有羧基官能团，粒径为1.0-3.0µm。超顺磁微粒具有高生物相容性，高饱和磁化强度，与TM抗体的偶联效果好；羧基官能团提供的酸性环境，pH为5.4-6.2，在该pH范围内磁微粒的活化剂EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)的活化效果更好，在过低pH时，活化剂EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）与羧酸形成的中间体不稳定，容易分解，但pH值过高时，部分不稳定中间物水解可能会释放出EDC或者使半稳定的氨基反应活性中间物的产量减少从而造成蛋白质与中间物的取代反应速度下降，使与TM抗体偶联量下降，故而优选磁微粒表面覆盖有羧基官能团。磁微粒的粒径控制在1.0-3.0µm内能更好的满足R1试剂要求，粒径过小或过大，都会影响R1试剂性能，使得不能很好的满足试剂要求。
R1试剂还包括用于保存偶联有链霉亲和素的磁微粒的第一保存液，第一保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-2.0%丙三醇、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为200-600mM的Tris-HCl缓冲液，第一保存液的pH为7.2-7.4。本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制，根据本发明的具体实例，采用Tris-HCl缓冲液作为缓冲体系，通过采用该缓冲体系能够有效地将该偶联有链霉亲和素的磁微粒的pH维持在预定的范围内，即7.2-7.4，并且，通过采用该缓冲体系，不会对待检测样品中的TAT含量测定造成不利的影响；本发明添加有丙三醇、黄原胶、聚乙二醇6000、海藻糖、牛血清白蛋白、AFP134抗冻蛋白等稳定剂，添加牛血清白蛋白能起到保护蛋白稳定、减少非特异性吸附的作用；添加海藻糖可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，海藻糖有效保护抗体的活性，提高抗体的稳定性的作用。添加糖类黄原胶，一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致R1试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面黄原胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇6000、丙三醇等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于偶联有链霉亲和素的磁微粒匀的悬浮于缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用，其中以丙三醇为例，还可作为防冻剂，有效降低凝固点，从而达到较好的抗冻融效果；添加AFP134抗冻蛋白，该蛋白可吸附在水晶表面，改变冰晶的生长特性，从而抑制冰晶的生长，该蛋白在较低浓度便可起到明显的降低冰点和延缓结冰的效果，故可有效达到抗冻融效果，从而达到试剂稳定性高、运输稳定性好的需求；添加有防腐剂Proclin 300，达到防腐效果，延长储存周期；本发明还添加有氯化钠等无机盐，无机盐的加入可以用于调节该偶联有链霉亲和素的磁微粒的渗透压，从而可以提高该偶联有链霉亲和素的磁微粒在测定TAT含量时的效率。第一保存液可更好的保存偶联有链霉亲和素的磁微粒，使得R1试剂稳定性更好，尤其是使得短时间冻融后的稳定性更好。
R2试剂还包括用于保存生物素标记的凝血酶抗体的第二保存液，第二保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为30-100mM的HEPES缓冲液，第二保存液的pH为7.0-7.4；本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制，根据本发明的具体实例，采用HEPES缓冲液作为缓冲体系，通过采用该缓冲体系能够有效地将该生物素标记的凝血酶抗体的pH维持在预定的范围内，即7.0-7.4，并且，通过采用该缓冲体系，不会对TAT含量测定造成不利的影响；本发明添加有黄原胶、聚乙二醇6000、海藻糖、牛血清白蛋白、AFP134抗冻蛋白等稳定剂，添加牛血清白蛋白能起到保护蛋白稳定、减少非特异性吸附的作用；添加海藻糖可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，海藻糖有效保护抗体的活性，提高抗体的稳定性的作用。添加糖类黄原胶，一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致R2试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面黄原胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇6000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于生物素标记的凝血酶抗体均匀的悬浮于缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用；添加AFP134抗冻蛋白，该蛋白可吸附在水晶表面，改变冰晶的生长特性，从而抑制冰晶的生长，该蛋白在较低浓度便可起到明显的降低冰点和延缓结冰的效果，故可有效达到抗冻融效果，从而达到试剂稳定性高、运输稳定性好的需求；添加有防腐剂Proclin 300，达到防腐效果，延长储存周期；氯化钠等无机盐的加入可以用于调节该生物素标记的凝血酶抗体的渗透压，从而可以提高该生物素标记的凝血酶抗体在测定TAT含量时的效率。第二保存液可更好的保存生物素标记的凝血酶抗体，使得R2试剂稳定性更好，尤其是使得短时间冻融后的稳定性更好。
R3试剂还包括用于保存碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体的第三保存液，第三保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为20-70mM的HEPES缓冲液，第三保存液的pH为7.0-7.4；本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制，根据本发明的具体实例，采用HEPES缓冲液作为缓冲体系，通过采用该缓冲体系能够有效地将该碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体的pH维持在预定的范围内，即7.0-7.4，并且，通过采用该缓冲体系，不会对TAT含量测定造成不利的影响；本发明添加有黄原胶、聚乙二醇6000、海藻糖、牛血清白蛋白、AFP134抗冻蛋白等稳定剂，添加糖类黄原胶，一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致R3试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面黄原胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇6000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体均匀的悬浮于缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用；添加AFP134抗冻蛋白，该蛋白可吸附在水晶表面，改变冰晶的生长特性，从而抑制冰晶的生长，该蛋白在较低浓度便可起到明显的降低冰点和延缓结冰的效果，故可有效达到抗冻融效果，从而达到试剂稳定性高、运输稳定性好的需求；添加有防腐剂Proclin 300，达到防腐效果，延长储存周期；氯化钠等无机盐的加入可以用于调节该碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体的渗透压，从而可以提高该碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体在测定TAT含量时的效率。第三保存液可更好的保存碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，使得R3试剂稳定性更好，尤其是使得短时间冻融后的稳定性更好。
本发明提供的一种测定TAT含量的试剂，包括R1试剂、R2试剂与R3试剂， R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒， R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体， R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，本发明的试剂盒的工作原理：采用发光免疫分析两步法定量检测凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物（TAT），R2试剂中的生物素标记的凝血酶抗体与被检样本中的TAT发生特异性反应，再与R1试剂的偶联有链霉亲和素的磁微粒结合；去除未反应物质后，加入R3试剂，R3试剂的碱性磷酸酶（ALP）标记的抗凝血酶抗体与磁微粒上的TAT 发生特异性反应；再次去除未反应物质后，添加发光底物经磁微粒上的ALP 分解并发光，测定其发光强度，发光强度随被检样本中TAT浓度的增加而增加。本发明提供的试剂盒利用链霉亲和素和生物素放大效应，采用磁微粒作为载体，碱性磷酸酶作为化学发光标记物，各试剂中加入了丙三醇、多羟基醇、海藻糖、AFP134抗冻蛋白等稳定剂，试剂稳定性更好，尤其是短时间冻融后稳定性好，灵敏度、特异性强、结果准确可靠，在临床检验和用药指导等方面有广阔的应用前景。
上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将经过羧基修饰的微粒溶液在磁场作用下磁分离，去上清，用活化缓冲液清洗，然后洗涤后的磁微粒用活化缓冲液重悬后加入第一活化剂活化，得到活化磁微粒。
S2、取活化磁微粒、链霉亲和素按比例混匀，混合后加入封闭液，得到偶联有链霉亲和素的磁性微粒，放至第一保存液中保存，得到R1试剂。
S3、取凝血酶抗体、生物素分别与第二活化剂、第三活化剂进行活化，将活化后的凝血酶抗体、活化后的生物素按比例混匀，得到生物素标记的凝血酶抗体，放至到第二保存液中保存，得到R2试剂。
S4、取抗凝血酶抗体、碱性磷酸酶分别与第四活化剂、第五活化剂混合反应，得到活化后的抗凝血酶抗体、活化后的碱性磷酸酶，将两者按比例混合，得到活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，放至到第三保存液中保存，得到R3试剂。
S5、将R1试剂、R2试剂、R3试剂组装，得到试剂盒。
进一步地，在步骤S1中，活化缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸，浓度为10-100mM，pH为5.4-6.2；第一活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，浓度为8 -12mg/mL；磁微粒活化时间为40-100min。
进一步地，在步骤S2中，封闭液包括以下质量百分比的组分：0.1-3.0%BSA、0.1-1.0%海藻糖、0.1-1.0 %吐温80，余量为10-200mM磷酸盐缓冲液， 磷酸盐缓冲液的pH为6.8-7.3。
进一步地，在步骤S2中，链霉亲和素与活化磁微粒的配比为1：（5-20），两者的反应时间为1-4h。
进一步地，在步骤S3中，第二活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0-20.0mg/mL，活化时间为5-20min；第三活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺溶液，浓度为1.0-30.0mg/mL，活化时间为1-15min。
进一步地，在步骤S3中，活化后的凝血酶抗体与活化后的生物素配比为1:（5-20），两者的偶联时间为1h-5h。
进一步地，在步骤S4中，第四活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0 -20.0mg/mL，活化时间为5-20 min；第五活化剂为琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，浓度为1.0 -10.0mg/mL，活化时间为5-20 min。
进一步地，在步骤S4中，活化后抗凝血酶抗体与活化后的碱性磷酸酶配比为1:（5-20），标记时间为15-48h。
通过以下具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种测定TAT含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂。
R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒和第一保存液；其中，偶联有链霉亲和素的磁微粒：链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:5；第一保存液：0.9% NaCl、3%牛血清白蛋白、1%丙三醇、0.5%聚乙二醇6000、0.1% AFP134抗冻蛋白、0.5%黄原胶、0.5%海藻糖、0.02% Proclin300、余量为300mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH调至7.3。
R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体和第二保存液；其中，生物素标记的凝血酶抗体：凝血酶抗体与生物素的质量比为1:5；第二保存液：0.9% NaCl、3%牛血清白蛋白、0.5%甘露醇、0.5%聚乙二醇6000、0.1%AFP134抗冻蛋白、0.5%黄原胶、0.5%海藻糖、0.02%Proclin300、余量为60mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.2。
R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体和第三保存液；其中，抗凝血酶抗体与碱性磷酸酶的质量比为1：20；第三保存液：0.9% NaCl、3%牛血清白蛋白、0.5%甘露醇、0.5%聚乙二醇6000、0.1%AFP134抗冻蛋白、0.5%黄原胶、0.5%海藻糖、0.02% Proclin300、余量为60mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.2。
该试剂盒的制备方法包括以下步骤：
S1、取1mL羧基修饰微粒溶液在磁场作用下磁分离3分钟，去上清，分离的磁微粒用活化缓冲液50mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES），pH6.0缓冲液清洗3次。将洗涤后磁微粒用PH 6.0的活化缓冲液50mmol/L MES充分混匀及加入活化剂10mg/ml EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），室温混悬反应30分钟，得到活化磁微粒。
S2、往活化磁微粒中加入链霉亲和素，链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:5，室温震荡反应3h，磁分离3min，去上清，清洗，加入封闭液，封闭液（60mM 磷酸盐缓冲液、1.0% BSA、0.5%海藻糖、0.5% 吐温80、0.02% Proclin300 PH 7.25），室温震荡2h，磁分离3min去上清，得到偶联有链霉亲和素的磁微粒；然后将偶联有链霉亲和素的磁微粒加入到第一保存液中，第一保存液以300mmol/L Tris-HCl缓冲液为缓冲体系，将偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度稀释至0.1µg/ml，第一保存液中含有0.9% NaCl、3%牛血清白蛋白、1%丙三醇、0.5%聚乙二醇6000、0.1% AFP134抗冻蛋白、0.5%黄原胶、0.5%海藻糖、0.02%Proclin300，第一保存液pH调至7.3，得到R1试剂。
S3、取1mg凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为7.6mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应12min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的凝血酶抗体；取1mg生物素，浓缩至3.0mg/mL，加入浓度为10.0mg/mL的活化剂N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应15min。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的生物素；将活化后的凝血酶抗体和活化后的生物素按1:5的比例混合，最后加入60mM、pH7.2的HEPES缓冲液，充分混匀，室温反应1.5h得到生物素标记的凝血酶抗体；将标记后的抗体使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，得到生物素标记的凝血酶抗体；然后加入到第二保存液中进行保存，第二保存液以60mmol/L的HEPES缓冲液作为缓冲体系，将生物素标记的凝血酶抗体稀释至0.3µg/ml，第二保存液包括0.9% NaCl、3%牛血清白蛋白、0.5%甘露醇、0.5%聚乙二醇6000、0.1%AFP134抗冻蛋白、0.5%黄原胶、0.5%海藻糖、0.02% Proclin300，第二保存液pH调至7.2，得到R2试剂。
S4、取1.0mg 的抗凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为7.6mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应12min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的抗凝血酶抗体；取1.2mg碱性磷酸酶，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为5.0mg/mL的活化剂SMCC（琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）溶液，室温反应12min。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶；将活化后的抗凝血酶抗体与活化后的碱性磷酸酶(ALP)按1：20比例混合，放置4℃下反应20小时。使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的抗凝血酶抗体和碱性磷酸酶(ALP)，得到活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，放至到第三保存液中保存，第三保存液以60mmol/L的HEPES缓冲液作为缓冲体系，将活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体稀释至0.3µg/ml，第三保存液包括0.9% NaCl、3%牛血清白蛋白、0.5%甘露醇、0.5%聚乙二醇6000、0.1%AFP134抗冻蛋白、0.5%黄原胶、0.5%海藻糖、0.02% Proclin300，第三保存液pH调节至7.2，得到R3试剂。
S5、将R1试剂、R2试剂、R3试剂组装，得到试剂盒；含量测定时需搭配清洗液（清洗液：PH为7.4的Tris缓冲液，其中加入0.9%氯化钠，1%吐温80,0.02%Proclin）、发光底物液（发光底物液包括发光底物液1和发光底物液2，发光底物液1包括3% NaOH、1%硝酸；发光底物液2包括2%曲拉通100、2% 氢氧化钠）使用。
实施例2
一种测定TAT含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂。
R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒和第一保存液；其中，偶联有链霉亲和素的磁微粒：链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:20；第一保存液：1.0% NaCl、5.0%牛血清白蛋白、2.0%丙三醇、1.0%聚乙二醇6000、1.0% AFP134抗冻蛋白、1.0%黄原胶、1.0%海藻糖、0.05% Proclin300、余量为600mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH调至7.4。
R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体和第二保存液；其中，生物素标记的凝血酶抗体：凝血酶抗体与生物素的质量比为1:20；第二保存液：1% NaCl、5%牛血清白蛋白、2%甘露醇、1%聚乙二醇6000、1%AFP134抗冻蛋白、1%黄原胶、1%海藻糖、0.05% Proclin300、余量为100mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.4。
R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体和第三保存液；其中，抗凝血酶抗体与碱性磷酸酶的质量比为1：5；第三保存液：1% NaCl、5%牛血清白蛋白、2%甘露醇、1%聚乙二醇6000、1 %AFP134抗冻蛋白、1%黄原胶、1%海藻糖、0.05% Proclin300、余量为70mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.4。
该试剂盒的制备方法包括以下步骤：
S1、取1mL羧基修饰微粒溶液在磁场作用下磁分离3分钟，去上清，分离的磁微粒用活化缓冲液100mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES），pH6.2缓冲液清洗3次；将洗涤后磁微粒用pH6.2的活化缓冲液100mmol/L MES充分混匀及加入活化剂12mg/ml EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），室温混悬反应40分钟，得到活化磁微粒。
S2、往活化磁微粒中加入链霉亲和素，链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:20，室温震荡反应1h，磁分离3min，去上清，清洗，加入封闭液，封闭液（0.1% BSA、0.1%海藻糖、0.1%吐温80、0.02% Proclin300、余量为200mM的磷酸盐缓冲液、缓冲液的pH为6.8），室温震荡1h，磁分离3min，去上清，得到偶联有链霉亲和素的磁微粒；然后将偶联有链霉亲和素的磁微粒加入到第一保存液中，第一保存液以600mmol/L Tris-HCl缓冲液为缓冲体系，将偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度稀释至0.1µg/ml，第一保存液中含有1.0% NaCl、5.0%牛血清白蛋白、2.0%丙三醇、1.0%聚乙二醇6000、1.0% AFP134抗冻蛋白、1.0%黄原胶、1.0%海藻糖、0.05% Proclin300，第一保存液pH 7.4，得到R1试剂。
S3、取1mg凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为20mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应5min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的凝血酶抗体；取1mg生物素，浓缩至3.0mg/mL，加入浓度为30mg/mL的活化剂N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应1min。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的生物素；将活化凝血酶抗体和活化的生物素按1:20的比例混合，最后加入60mM、pH7.2的HEPES缓冲液，充分混匀，室温反应1h，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，得到生物素标记的凝血酶抗体；然后加入到第二保存液中进行保存，第二保存液以100mmol/LHEPES缓冲液为缓冲体系，将生物素标记的凝血酶抗体稀释到0.3µg/ml，第二保存液包括1% NaCl、5%牛血清白蛋白、2%甘露醇、1%聚乙二醇6000、1%AFP134抗冻蛋白、1%黄原胶、1%海藻糖、0.05% Proclin300，第二保存液pH调节至7.4，得到R2试剂。
S4、取1.0mg 的抗凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为20mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应5min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的抗凝血酶抗体；取1.2mg碱性磷酸酶，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为10mg/mL的活化剂SMCC（琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）溶液，室温反应5min；使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶；将活化后的抗凝血酶抗体与活化后的碱性磷酸酶(ALP)按1：5比例混合，放置4℃下反应48小时。使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的抗凝血酶抗体和碱性磷酸酶(ALP)，得到活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，放至到第三保存液中保存，第三保存液以70mmol/LHEPES缓冲液为缓冲体系，将活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体稀释到0.3µg/ml，第三保存液包括1% NaCl、5%牛血清白蛋白、2%甘露醇、1%聚乙二醇6000、1 %AFP134抗冻蛋白、1%黄原胶、1%海藻糖、0.05% Proclin300，第三保存液pH调节至7.4，得到R3试剂。
S5、将R1试剂、R2试剂、R3试剂组装，得到试剂盒；含量测定时需搭配清洗液（清洗液：PH为7.4的Tris缓冲液，其中加入0.9%氯化钠，1%吐温80,0.02%Proclin）、发光底物液（发光底物液包括发光底物液1和发光底物液2，发光底物液1包括3% NaOH、1%硝酸；发光底物液2包括2%曲拉通100、2% 氢氧化钠）使用。
实施例3
一种测定TAT含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂。
R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒和第一保存液；其中，偶联有链霉亲和素的磁微粒：链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:5；第一保存液：0.5% NaCl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%丙三醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05% AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01% Proclin300、余量为200mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH调至7.0。
R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体和第二保存液；其中，生物素标记的凝血酶抗体：凝血酶抗体与生物素的质量比为1:5；第二保存液：0.5% NaCl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%甘露醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05%AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01%Proclin300、余量为30mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.0。
R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体和第三保存液；其中，抗凝血酶抗体与碱性磷酸酶的质量比为1：20；第三保存液：0.5% NaCl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%甘露醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05%AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01% Proclin300、余量为20mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.0。
该试剂盒的制备方法包括以下步骤：
S1、取1mL羧基修饰微粒溶液在磁场作用下磁分离3分钟，去上清，分离的磁微粒用活化缓冲液10mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES），pH5.4缓冲液清洗3次；将洗涤后磁微粒用pH5.4的活化缓冲液50mmol/L MES充分混匀及加入活化剂8mg/ml EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），室温混悬反应100分钟，得到活化磁微粒。
S2、往活化磁微粒中加入链霉亲和素，链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:5，室温震荡反应4h，磁分离3min，去上清，清洗，加入封闭液，封闭液（0.1% BSA、0.1%海藻糖、0.1%吐温80、0.02% Proclin300、余量为10mM的磷酸盐缓冲液、缓冲液的pH为6.8），室温震荡4h，磁分离3min，去上清，得到偶联有链霉亲和素的磁微粒；然后将偶联有链霉亲和素的磁微粒加入到第一保存液中，第一保存液以200mmol/L Tris-HCl缓冲液为缓冲体系，将偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度稀释至0.1µg/ml，第一保存液以Tris缓冲液为缓冲体系，第一保存液中含有0.5% NaCl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%丙三醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05%AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01% Proclin300，第一保存液调节pH至7.0，得到R1试剂。
S3、取1mg凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为5mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应20min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的凝血酶抗体；取1mg生物素，浓缩至3.0mg/mL，加入浓度为1mg/mL的活化剂N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应15min。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的生物素；将活化后的凝血酶抗体和活化的生物素按1:5的比例混合，最后加入60mM、pH7.2的HEPES缓冲液，充分混匀，室温反应5h，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，得到生物素标记的凝血酶抗体；然后加入到第二保存液中进行保存，第二保存液以30mmol/LHEPES缓冲液为缓冲体系，将生物素标记的凝血酶抗体稀释到0.3µg/ml，第二保存液包括0.5% NaCl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%甘露醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05%AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01% Proclin300，第二保存液pH调节至7.0，得到R2试剂。
S4、取1.0mg 的抗凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为5mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应20min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的抗凝血酶抗体；取1.2mg碱性磷酸酶，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为1.0mg/mL的活化剂SMCC（琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）溶液，室温反应20min。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶；将活化后抗凝血酶抗体与碱性磷酸酶(ALP)按1：20比例混合，放置4℃下反应48小时；使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的抗凝血酶抗体和碱性磷酸酶(ALP)，得到活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，放至到第三保存液中保存，第三保存液以20mmol/LHEPES缓冲液为缓冲体系，将活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体稀释到0.3µg/ml，第三保存液包括0.5% NaCl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%甘露醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05%AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01%Proclin300，第三保存液pH调节至7.0，得到R3试剂。
S5、将R1试剂、R2试剂、R3试剂组装，得到试剂盒；含量测定时需搭配清洗液（清洗液：PH为7.4的Tris缓冲液，其中加入0.9%氯化钠，1%吐温80,0.02%Proclin）、发光底物液（发光底物液包括发光底物液1和发光底物液2，发光底物液1包括3% NaOH、1%硝酸；发光底物液2包括2%曲拉通100、2% 氢氧化钠）使用。
实施例4
一种测定TAT含量的试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂。
R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒和第一保存液；其中，偶联有链霉亲和素的磁微粒：链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:8；第一保存液：0.75% NaCl、0.7%牛血清白蛋白、0.1%丙三醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05% AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01% Proclin300、余量为400mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH调至7.3。
R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体和第二保存液；其中，生物素标记的凝血酶抗体：凝血酶抗体与生物素的质量比为1:8；第二保存液：0.75% NaCl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%甘露醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52%AFP134抗冻蛋白、0.55%黄原胶、0.55%海藻糖、0.03% Proclin300、余量为65mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.2。
R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体和第三保存液；其中，抗凝血酶抗体与碱性磷酸酶的质量比为1：8；第三保存液：0.75% NaCl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%甘露醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52%AFP134抗冻蛋白、0.55%黄原胶、0.55%海藻糖、0.03%Proclin300、余量为45mmol/L的HEPES缓冲液，pH调至7.2。
S1、取1mL羧基修饰微粒溶液在磁场作用下磁分离3分钟，去上清，分离的磁微粒用活化缓冲液55mmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES），pH5.8缓冲液清洗3次；将洗涤后磁微粒用pH5.8的活化缓冲液55mmol/L MES充分混匀及加入活化剂10mg/ml EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），室温混悬反应70分钟，得到活化磁微粒。
S2、往活化磁微粒中加入链霉亲和素，链霉亲和素与活化磁微粒的质量比为1:8，室温震荡反应2.5h，磁分离3min，去上清，清洗，加入封闭液，封闭液（1.55% BSA、0.55%海藻糖、0.55%吐温80、0.02% Proclin300、余量为105mM的磷酸盐缓冲液、缓冲液的pH为7.05，室温震荡2.5h，磁分离3min，去上清，得到偶联有链霉亲和素的磁微粒；然后将偶联有链霉亲和素的磁微粒加入到第一保存液中，第一保存液以400mmol/LTris-HCl缓冲液为缓冲体系，将偶联有链霉亲和素的磁微粒的浓度稀释至0.1µg/ml，第一保存液中含有0.75% NaCl、0.7%牛血清白蛋白、0.1%丙三醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05% AFP134抗冻蛋白、0.1%黄原胶、0.1%海藻糖、0.01% Proclin300，调节pH至7.3，得到R1试剂。
S3、取1mg凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为12.5mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应12min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的凝血酶抗体；取1mg生物素，浓缩至3.0mg/mL，加入浓度为15.5mg/mL的活化剂N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温反应8min。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的生物素；将活化后的凝血酶抗体和活化的生物素按1:8的比例混合，最后加入60mM、pH7.2的HEPES缓冲液，充分混匀，室温反应3h，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，得到生物素标记的凝血酶抗体；然后加入到第二保存液中进行保存，第二保存液以65mmol/LHEPES缓冲液为缓冲体系，将生物素标记的凝血酶抗体稀释到0.3µg/ml，第二保存液包括0.75% NaCl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%甘露醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52%AFP134抗冻蛋白、0.55%黄原胶、0.55%海藻糖、0.03%Proclin300，第二保存液pH调节至7.2，得到R2试剂。
S4、取1.0mg 的抗凝血酶抗体，浓缩至2.0mg/mL，加入浓度为12mg/mL的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应12min，使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的抗凝血酶抗体；取1.2mg碱性磷酸酶，浓缩至2.5mg/mL，加入浓度为5.5mg/mL的活化剂SMCC（琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）溶液，室温反应12min。使用Sephadex G25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶；将活化后抗凝血酶抗体与碱性磷酸酶(ALP)按1：8比例混合，放置4℃下反应31小时。使用Supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的抗凝血酶抗体和碱性磷酸酶(ALP)，得到活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，放至到第三保存液中保存，第三保存液以45mmol/LHEPES缓冲液为缓冲体系，将活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体稀释到0.3µg/ml，第三保存液包括0.75% NaCl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%甘露醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52%AFP134抗冻蛋白、0.55%黄原胶、0.55%海藻糖、0.03%Proclin300，第三保存液pH调节至7.2，得到R3试剂。
S5、将R1试剂、R2试剂、R3试剂组装，得到试剂盒；含量测定时需搭配清洗液（清洗液：PH为7.4的Tris缓冲液，其中加入0.9%氯化钠，1%吐温80,0.02%Proclin）、发光底物液（发光底物液包括发光底物液1和发光底物液2，发光底物液1包括3% NaOH、1%硝酸；发光底物液2包括2%曲拉通100、2% 氢氧化钠）使用。
对实施例1的试剂盒进行性能评估：
1、准确度
将使用校准品定标后的实施例1的试剂盒进行准确度检测，在血栓调节蛋白检测系统上对低浓度水平校准品（2.4ng/mL）和高浓度水平校准品（60.8ng/mL）进行测定，每个标准品测定5次，实测浓度和标示值的相对偏差应在±10%范围内，（由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，所用的标准品为第三方购买的标准品试剂盒）检测结果见下表：
Figure 929730DEST_PATH_IMAGE001
式中：T-标准品标示值；
Figure 947364DEST_PATH_IMAGE002
-平均值；B-相对偏差。
表1.实施例1的试剂盒的准确度测试结果
序号 低浓度水平校准品（ng/mL） 高浓度水平校准品（ng/mL）
1 2.42 62.0
2 2.46 61.3
3 2.48 60.9
4 2.44 62.2
5 2.42 62.1
平均值（
Figure 769827DEST_PATH_IMAGE003
）		 2.44 61.70
标示值（T） 2.40 60.8
相对偏差（B） 1.83% 1.48%
由结果表明，本发明的试剂盒检测标准品偏差均小于5％，满足性能要求。
2、重复性
采用实施例1的试剂盒测试浓度为2.5ng/mL的样品1、25.2ng/mL的样品2，每个样 本检测10次，计算测试结果的平均值（
Figure 302439DEST_PATH_IMAGE003
）和标准差（SD）、计算变异系数（CV），测试结果如表 19~21 所示。测试结果应符合要求：低值质控品（样品1）变异系数（CV）≤10%；高值质控品 （样品2）变异系数（CV）≤8%，检测结果见下表：
Figure 501339DEST_PATH_IMAGE004
，式中：CV为变异系数，
Figure 373480DEST_PATH_IMAGE002
为平均值；SD为标准差。
表2：本发明实施例1的试剂盒重复性测试结果
序号 样本1（ng/mL ） 样本2（ng/mL）
1 2.51 25.5
2 2.46 25.7
3 2.49 25
4 2.46 25
5 2.47 25.7
6 2.49 24.8
7 2.46 25.2
8 2.51 24.6
9 2.49 25.6
10 2.46 25.7
平均值（
Figure 366844DEST_PATH_IMAGE003
）		 2.48 25.28
SD 0.02 0.41
CV 0.83% 1.63%
由上表可知，该试剂盒的变异系数CV均小于2％，符合性能要求。
3、稳定性
将实施例1的试剂盒在未开封状态下置于37℃的加速条件下储存，于第0、8、12、14、16天取样检测；测试结果应符合要求：试剂盒在未开封状态下置于37℃储存可以稳定16天，即相对偏差应在±10%范围内；检测结果见下表：
表3.本发明实施例1的试剂盒加速稳定性（37℃）测试结果
Figure 386753DEST_PATH_IMAGE005
由上表可知，该试剂盒在开瓶状态下置于37℃储存16天内相对偏差在±10%范围内，试剂盒的试剂稳定性好。
将实施例1的试剂盒以及第三方购买的对比试剂在未开瓶状态下置于-20℃的加速条件下储存，放置5天后取样检测；测试结果应符合要求：试剂盒在未开瓶状态下置于-20℃储存可以稳定5天，即相对偏差应在±10%范围内；检测结果见下表：
表4.本发明实施例1的试剂盒的试剂加速稳定性（-20℃）测试结果
Figure 123765DEST_PATH_IMAGE006
由上表结果可知，试剂盒在未开瓶状态下置于-20℃储存可以稳定5天，相对偏差在±10%范围内，冻存5天后试剂盒的试剂仍可使用，即试剂盒的抗冻融稳定性好，且优于对比试剂的抗冻融稳定性。
将实施例1的试剂盒在开封状态下置于2-8℃的加速条件下储存，于第0、20、30、35、40天取样检测；测试结果应符合要求：试剂盒在开瓶状态下置于2-8℃储存可以稳定30天，即相对偏差应在±10%范围内；检测结果见下表：
表5.本发明实施例1的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 647150DEST_PATH_IMAGE007
由上表可知，该试剂盒在开瓶状态下置于2-8℃储存40天内相对偏差在±10%范围内，试剂盒的试剂稳定性好。
4、相关性
由于不同免疫分析所选的抗体对和方法学等因素的不同，可能会导致检测时受到病人体内干扰物的干扰程度不同，因此无法直接从检测结果的数值来判断两种试剂盒的检测结果是否准确。因此，对已上市的TAT试剂(Sysmex公司HISCL 5000血栓调节蛋白分析系统参比系统）与本发明校准品校准的血栓调节蛋白检测系统进行相关性分析，分别测试不同浓度的TM样本时，测试结果应保持一致，即斜率k=1.00±0.10，相关系数r≥0.975；测试结果见下表：
表6.对比试剂与本发明的试剂盒的相关性测试结果
Figure 529524DEST_PATH_IMAGE008
根据上表测试结果对参比试剂的检测结果和实施例1中提供的试剂盒的检测结果进行相关性分析，构建回归方程，所得曲线如图1所示，所得方程为y=1.0038x-0.046，r =0.996，由此可知，本发明提供的TAT含量检测试剂盒的检测结果与市售的TAT试剂盒检测结果相近，检测结果准确可靠。
综上，本发明提供的试剂盒利用链霉亲和素和生物素放大效应，采用磁微粒作为载体，碱性磷酸酶作为化学发光标记物，试剂中加入了丙三醇、多羟基醇、海藻糖、AFP134抗冻蛋白等稳定剂，试剂稳定性更好，尤其是短时间冻融后稳定性相比第三方的更好，结果准确可靠，在临床检验和用药指导等方面有广阔的应用前景。
并且通过上述具体的实施例选择来验证本发明的可行性与合理性，仅为本发明的部分解释与说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明申请的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本专利的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。

Claims (10)

1.一种测定TAT含量的试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂与R3试剂，所述R1试剂包括偶联有链霉亲和素的磁微粒，所述R2试剂包括生物素标记的凝血酶抗体，所述R3试剂包括碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体；
所述R1试剂还包括用于保存偶联有链霉亲和素的磁微粒的第一保存液，所述第一保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-2.0%丙三醇、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为200-600mM的Tris-HCl缓冲液，所述第一保存液的pH为7.2-7.4；
所述R2试剂还包括用于保存生物素标记的凝血酶抗体的第二保存液，所述第二保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为30-100mM的HEPES缓冲液，所述第二保存液的pH为7.2-7.4；
所述R3试剂还包括用于保存碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体的第三保存液，所述第三保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%AFP134抗冻蛋白、0.1-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.1-1.0%海藻糖、0.01-0.05% Proclin 300，余量为20-70mM的HEPES缓冲液，所述第三保存液的pH为7.2-7.4。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为超顺磁微粒，表面覆盖有羧基官能团，粒径为1.0-3.0µm。
3.一种权利要求1-2任意一项所述的测定TAT含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将经过羧基修饰的微粒溶液在磁场作用下磁分离，去上清，用活化缓冲液清洗，然后洗涤后的磁微粒用活化缓冲液重悬后加入第一活化剂活化，得到活化磁微粒；
S2、取活化磁微粒、链霉亲和素按比例混匀，混合后加入封闭液，得到偶联有链霉亲和素的磁性微粒，放至第一保存液中保存，得到R1试剂；
S3、取凝血酶抗体、生物素分别与第二活化剂、第三活化剂进行活化，将活化后的凝血酶抗体、活化后的生物素按比例混匀，得到生物素标记的凝血酶抗体，放至到第二保存液中保存，得到R2试剂；
S4、取抗凝血酶抗体、碱性磷酸酶分别与第四活化剂、第五活化剂混合反应，得到活化后的抗凝血酶抗体、活化后的碱性磷酸酶，将两者按比例混合，得到活化碱性磷酸酶标记的抗凝血酶抗体，放至到第三保存液中保存，得到R3试剂；
S5、将R1试剂、R2试剂、R3试剂组装，得到试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述活化缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸，浓度为10-100mM，pH为5.4-6.2；所述第一活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，浓度为8 -12mg/mL；所述磁微粒活化时间为40-100min。
5.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述封闭液包括以下质量百分比的组分：0.1-3.0%BSA、0.1-1.0%海藻糖、0.1-1.0 %吐温80，余量为10-200mM磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.8-7.3。
6.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述链霉亲和素与所述活化磁微粒的配比为1：（5-20），两者的反应时间为1-4h。
7.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，第二活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0-20.0mg/mL，活化时间为5-20min；
第三活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺溶液，浓度为1.0-30.0mg/mL，活化时间为1-15min。
8.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，活化后的凝血酶抗体与活化后的生物素配比为1:（5-20），两者的偶联时间为1h-5h。
9.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，第四活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0 -20.0mg/mL，活化时间为5-20 min；
第五活化剂为琥珀酰亚胺 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，浓度为1.0 -10.0mg/mL，活化时间为5-20 min。
10.根据权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，活化后抗凝血酶抗体与活化后的碱性磷酸酶配比为1:（5-20），标记时间为15-48h。
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