CN115932239B - 一种氧化低密度脂蛋白保护剂、测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种氧化低密度脂蛋白保护剂、测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医学检验技术领域，具体公开了一种氧化低密度脂蛋白保护剂、测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其应用。所述氧化低密度脂蛋白保护剂包括以下重量百分数的组分：牛血清白蛋白0.5％～3％、吐温0.05～0.5％、甘露醇0.5％～3％、乙二胺四乙酸二钠0.1％～0.5％、环糊精0.5％～3％和防腐剂0.01％～0.2％，余量为缓冲液。本发明提供的氧化低密度脂蛋白保护剂，可以显著提高氧化低密度脂蛋白的热稳定性、开瓶稳定性和冻融稳定性。并且，通过样本处理液处理后的样本可以使结合位点充分暴露，提高抗原抗体的结合率，可以保证检测结果的准确性和可重复性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检验技术领域，尤其是涉及一种氧化低密度脂蛋白保护剂、测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其应用。
背景技术
氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是低密度脂蛋白(LDL)在体内发生氧化修饰而形成的，此反应与体内的氧化应激有关。氧化修饰后的LDL的理化性质和生物学特性均发生了一系列改变，ox-LDL可以通过细胞毒性作用、化学趋化作用、影响血管平滑肌增殖、加速泡沫细胞形成、影响纤溶和凝血等机制促进动脉粥样硬化的发生和发展。在早期动脉粥样硬化病变过程中，氧化低密度脂蛋白表现出促动脉粥样硬化的能力。研究发现内皮细胞的激活是动脉粥样硬化形成早期的一个重要事件，氧化低密度脂蛋白参与并促进了这个过程。氧化低密度脂蛋白在中性环境还容易被鞘磷脂酶水解，导致动脉壁上的LDL大量聚集，增加了巨噬细胞对LDL的摄取和动脉粥样硬化发生的风险。
经研究表明，氧化低密度脂蛋白是一种极不稳定的脂蛋白，国内外氧化低密度脂蛋白原料在2-8℃的保存期限一般为1个月，而且在开瓶后的使用效期将大大缩短；同时保存期间不能冻融，冻融后蛋白的性质发生明显变化。氧化低密度脂蛋白的不稳定对氧化低密度脂蛋白的研究影响很大，如原材料厂商将增加生产和保存的成本；客户使用中难以控制批间差，原料的利用率低；市场使用氧化低密度脂蛋白检测试剂盒的效期受校准品稳定性影响而大打折扣。
此外，氧化低密度脂蛋白中脂类含量远大于载脂蛋白B的含量且缠绕在载脂蛋白B表面，使得氧化低密度脂蛋白与抗体结合的位点暴露较少。因此在检测过程中容易受检测系统的影响导致检测结果的重复性差，检测结果的可靠性低。目前检测氧化低密度脂蛋白常用的方法有酶联免疫吸附法和免疫层析法。两种检测方法的灵敏度较低，检测时长较长，不能实现全自动检测，不利于临床的使用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种氧化低密度脂蛋白保护剂、测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒检测快速便捷，灵敏度高，抗干扰能力强，可以用于检测血清或血浆氧化低密度脂蛋白。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一种氧化低密度脂蛋白保护剂，包括以下重量百分数的组分：
牛血清白蛋白0.5％～3％、吐温0.05～0.5％、甘露醇0.5％～3％、乙二胺四乙酸二钠0.1％～0.5％、环糊精0.5％～3％和防腐剂0.01％～0.2％，余量为缓冲液。
本发明设计出一种含有上述组分及含量的氧化低密度脂蛋白保护剂，该氧化低密度脂蛋白保护剂可以显著提高氧化低密度脂蛋白的热稳定性、开瓶稳定性和冻融稳定性。将其应用到原材料和校准品能够提高储存稳定性从而降低原材料的生产和储存成本，能够保证检测试剂检测结果的准确可靠。
上述氧化低密度脂蛋白保护剂配方中，甘露醇、乙二胺四乙酸二钠和环糊精相互协同配比，以更好地提高氧化低密度脂蛋白的热稳定性、开瓶稳定性和冻融稳定性。
作为氧化低密度脂蛋白保护剂优选的实施方式，所述环糊精为甲基-β-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精或γ-环糊精中的至少一种。优选地，所述环糊精为甲基-β-环糊精，浓度为1％。
当环糊精采用上述种类及含量时，可以减少氧化低密度脂蛋白活性的损失，提高对氧化低密度脂蛋白的保护效果，尤其是在冷冻过程的保护作用。
作为氧化低密度脂蛋白保护剂优选的实施方式，所述氧化低密度脂蛋白保护剂选用1％的甘露醇，1％牛血清白蛋白，0.25％的乙二胺四乙酸二钠。
作为氧化低密度脂蛋白保护剂优选的实施方式，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris～HCl缓冲液或HEPES缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH为7.0～8.0。优选地，所述缓冲液为20mM磷酸盐缓冲液，pH为7.5。
作为氧化低密度脂蛋白保护剂优选的实施方式，所述吐温为吐温20或/和吐温80；所述防腐剂为ProClin300、KY100或硫酸庆大霉素中的至少一种。
优选地，所述吐温为0.15％的吐温80。所述防腐剂为0.05％的ProClin300。
第二目的，本发明提供了一种氧化低密度脂蛋白样本处理液，所述氧化低密度脂蛋白样本处理液包括所述的氧化低密度脂蛋白保护剂10％～50％、缓冲液5mM～50mM和表面活性剂0.02％～0.2％。
氧化低密度脂蛋白是一种大分子的脂蛋白，脂质的分子量是蛋白分子量的6倍以上，脂质分子缠绕在载脂蛋白B上，使得氧化低密度脂蛋白与抗体的结合位点不易暴露，通过氧化低密度脂蛋白样本处理液处理后的样本可以使结合位点充分暴露，提高抗原抗体的结合率，可以保证检测结果的准确性和可重复性。
本发明的样本处理液不仅能够使样本中氧化低密度脂蛋白的抗原位点暴露，而且还能保持稀释后样本的稳定性。从而保证检测结果的准确可靠。
作为氧化低密度脂蛋白样本处理液优选的实施方式，所述表面活性剂为去氧胆酸钠、曲拉通100、Pluronic F～68和NP～40中的至少一种。优选地，所述表面活性剂为浓度为0.08％的去氧胆酸钠。
去氧胆酸钠可以使样本中氧化低密度脂蛋白与抗体的结合位点充分暴露，同时添加一定浓度的氧化低密度脂蛋白保护剂能够使稀释后的样本维持一定时间的稳定，确保检测结果的重复性和可靠性。
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris～HCl缓冲液或HEPES缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH在7.0～8.0。更为优选地，所述缓冲液为30mM的Tris～HCl缓冲液，pH为7.8。
作为氧化低密度脂蛋白样本处理液优选的实施方式，所述氧化低密度脂蛋白样本处理液与样本的比例为100：1～800：1。
第三目的，本发明提供了一种测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，所述试剂盒包括校准品、试剂1、试剂2和所述的氧化低密度脂蛋白样本处理液；
所述试剂R1的组分及终浓度为：
缓冲液 5mM～50mM
吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体 2～6mg/L
稳定剂1 0.5～5w/v％
所述试剂R2的组分及终浓度为：
缓冲液 5mM～50mM
辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B单克隆抗体 0.2～2mg/L
稳定剂2 0.5～5w/v％。
作为检测试剂盒优选的实施方式，所述校准品的制备方法包括使用所述的氧化低密度脂蛋白保护剂稀释抗原获得；
所述校准品的制备方法还包括真空冷冻干燥，冻干参数如下：
预冻阶段：温度降至-4℃，维持1-2h后再降温至-40℃维持3-5h；
升华干燥：温度由-40℃升至-18℃，升温时间为1h，控制在-18℃干燥12～24h，真空度维持在15～30Pa；
解析干燥：温度由-18℃升至40℃，升温时间为2h，在40℃干燥4-6h，真空度维持在10Pa以下；
冻干完毕后充入惰性气体，取出冻干样本，得到校准品。
在本发明的技术方案中，使用氧化低密度脂蛋白保护剂配制校准品，同时结合真空冷冻干燥技术可以显著提高校准品的热稳定性和开瓶复溶稳定性，确保检测结果的稳定可靠。
作为检测试剂盒优选的实施方式，所述试剂1或试剂2的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液中的一种；优选HEPES缓冲液，浓度为25mM；所述试剂1或试剂2的缓冲液的pH为6.5～8。
作为检测试剂盒优选的实施方式，所述稳定剂1或稳定剂2为牛血清白蛋白、酸水解酪蛋白、甘露醇、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、酶稳定剂中的一种或几种。
优选地，稳定剂1为酸水解酪蛋白，硫代硫酸钠，乙二胺四乙酸二钠中的一种或几种；稳定剂2为牛血清白蛋白、甘露醇和酶稳定剂中的一种或几种。
作为检测试剂盒优选的实施方式，所述氧化低密度脂蛋白样本处理液与样本的比例为400：1。
本发明的试剂盒利用吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体、抗原、辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B单克隆抗体形成抗体～抗原～抗体复合物，无需洗涤过程，加入底物后立即连续检测一段时间，每次间隔0.02～0.05S，计算峰面积，用已知浓度的氧化低密度脂蛋白与计算出的峰面积做出剂量～反应曲线，通过该曲线推算出待测样本中的氧化低密度脂蛋白含量。
本发明的试剂盒与商品化对比试剂测定样本中氧化低密度脂蛋白的相关性良好，具有很好的可比性。
第四目的，本发明提供了上述检测试剂盒在测定血清或血浆氧化低密度脂蛋白中的应用。
一种化学发光法测定氧化低密度脂蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)用氧化低密度脂蛋白样本处理液处理样本；
(2)按处理后样本/校准品：试剂R1：试剂R2＝1：8～12：8～12的比例加入试剂，孵育，加入底物液后立即连续检测2S内发光值，每次间隔0.02～0.05S，计算峰面积。
(3)检测获得校准品和样本的峰面积，以浓度为X坐标，以峰面积为Y坐标，做出剂量～反应曲线，根据该曲线计算样本中氧化低密度脂蛋白的浓度。
进一步地，样本/校准品：试剂R1：试剂R2的优选比例为1：10：10。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种氧化低密度脂蛋白保护剂，可以显著提高氧化低密度脂蛋白的热稳定性、开瓶稳定性和冻融稳定性。将其应用到原材料和校准品能够提高储存稳定性从而降低原材料的生产和储存成本，能够保证检测试剂检测结果的准确可靠。
2、本发明提供了一种氧化低密度脂蛋白样本处理液，表面活性剂可以使样本中氧化低密度脂蛋白与抗体的结合位点充分暴露，同时添加一定浓度的氧化低密度脂蛋白保护剂能够使稀释后的样本维持一定时间的稳定，确保检测结果的重复性和可靠性。
3、本发明提供了一种氧化低密度脂蛋白检测试剂盒，其中校准品采用氧化低密度脂蛋白保护剂配制，结合真空冷冻干燥技术能够增强校准品的热稳定性，避免运输过程的泄漏。使用一对单克隆抗体抗体检测氧化低密度脂蛋白减少交叉反应，配套样本处理液处理样本，使氧化低密度脂蛋白的抗原位点暴露，使检测结果准确可靠。该检测试剂盒采用化学发光法检测氧化低密度脂蛋白脂蛋白，具有灵敏度高，抗干扰能力强，检测速度快的有点。同时能够配套仪器实现全自动检测，便于使用的推广。
附图说明
图1为采用实施例17制备的试剂盒测定得到的标准曲线图，其中X轴表示峰面积，Y轴表示氧化低密度脂蛋白浓度值；
图2为实施例17制备的试剂盒与对比试剂Mercodia AB生产的氧化低密度脂蛋白检测试剂盒(酶联免疫吸附法)的相关性对比图，其中X轴表示Mercodia AB试剂盒测定的血清结果，Y轴表示的是本发明试剂盒测定的血清结果。
图3为实施例17制备的试剂盒线性评估结果，X轴标示预测浓度，Y轴标示的本发明试剂盒测定的浓度。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例涉及的底物为全自动免疫检验系统用底物液，由广州市进德生物科技有限公司提供，抗氧化低密度脂蛋白抗体和抗载脂蛋白B抗体购自广州市泓飞生物科技有限公司。
实施例1
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白保护剂的一种实施例，本实施例的氧化低密度脂蛋白保护剂包括如下浓度或重量百分数的组分：
Tris～HCl缓冲液5mM(pH7.4)、牛血清白蛋白3wt％、甘露醇0.5wt％、吐温200.05wt％、乙二胺四乙酸二钠0.1wt％、2-羟丙基-β-环糊精0.5wt％、硫酸庆大霉素0.01wt％。
实施例2
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白保护剂的一种实施例，本实施例的氧化低密度脂蛋白保护剂包括如下浓度或重量百分数的组分：
磷酸盐缓冲液25mM(pH 7.5)、牛血清白蛋白0.5wt％、甘露醇1wt％、吐温800.15wt％、乙二胺四乙酸二钠0.25wt％、甲基-β-环糊精1wt％、ProClin3000.05wt％。
实施例3
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白保护剂的一种实施例，本实施例的氧化低密度脂蛋白保护剂包括如下浓度或重量百分数的组分：
磷酸盐缓冲液25mM(pH 7.0)、牛血清白蛋白1wt％、甘露醇3wt％、吐温800.5wt％、乙二胺四乙酸二钠0.5wt％、γ-环糊精3wt％、ProClin300 0.05wt％、KY1000.15wt％。
实施例4
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白保护剂的一种实施例，本实施例的氧化低密度脂蛋白保护剂包括如下浓度或重量百分数的组分：
HEPES缓冲液50mM(pH8.0)、牛血清白蛋白2wt％、甘露醇1.5wt％、吐温200.3wt％、乙二胺四乙酸二钠0.3wt％、甲基-β-环糊精1wt％、2-羟丙基-β-环糊精0.5wt％、KY100 0.10wt％、硫酸庆大霉素0.02wt％。
实施例5
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白保护剂的一种实施例，本实施例的氧化低密度脂蛋白保护剂包括如下浓度或重量百分数的组分：
磷酸盐缓冲液25mM(pH 7.5)、牛血清白蛋白0.5wt％、甘露醇1wt％、吐温800.15wt％、乙二胺四乙酸二钠0.25wt％、甲基-β-环糊精10wt％、ProClin3000.05wt％。
实施例6
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白保护剂的一种实施例，本实施例的氧化低密度脂蛋白保护剂包括如下浓度或重量百分数的组分：
磷酸盐缓冲液25mM(pH 7.5)、牛血清白蛋白0.5wt％、甘露醇1wt％、吐温800.15wt％、乙二胺四乙酸二钠0.25wt％、右旋糖酐401wt％、ProClin3000.05wt％。
实施例7
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白保护剂的一种实施例，本实施例的氧化低密度脂蛋白保护剂包括如下浓度或重量百分数的组分：
磷酸盐缓冲液25mM(pH 7.5)、牛血清白蛋白0.5wt％、甘露醇1wt％、吐温800.15wt％、乙二胺四乙酸二钠0.25wt％、ProClin300 0.05wt％。
实施例8
本实施例为氧化低密度脂蛋白校准品的制备方法，包括以下步骤：
将氧化低密度脂蛋白与实施例1～实施例7中保护剂混合，配制浓度为25mU/L、100mU/L和300mU/L。配制好后分成2部分，其中1部分进行进行真空冷冻干燥，另1部分以液体状态保存。
将需要冻干的校准品置于真空冷冻干燥机，设置冻干曲线，冷冻干燥；所述冷冻干燥包括预冻、升华干燥和解析干燥过程。
1)预冻阶段：温度降至-4℃，维持1-2h后再降温至-40℃维持3-5h；
2)升华干燥：温度由-40℃升至-18℃，升温时间为1h，控制在-18℃干燥12～24h，真空度维持在15～30Pa；
3)解析干燥：温度由-18℃升至40℃，升温时间为2h，在40℃干燥4-6h，真空度维持在10Pa一下；
冻干完毕后充入惰性气体，取出冻干样本，得到氧化低密度脂蛋白冻干校准品。
实施例9
对氧化低密度脂蛋白保护剂作用效果进行考察。将实施例8中制备的冻干校准品进行37℃加速30天和开瓶复溶2-8℃放置6个月稳定性考察。液体校准品进行2-8℃放置6个月和-20℃冻融1次稳定性考察，以PBS缓冲液配制的校准品添加3％BSA作为赋形剂，冻干后作为对照。用对比试剂盒测定各校准品的浓度，按照说明书进行操作，计算保留率。结果如表1、表2、表3和表4所示。
表1实施例1-实施例8中与对照组的液体校准品-20℃冻融1次稳定性评估
表2实施例1-实施例8中与对照组的液体校准品2-8℃放置6个月稳定性评估
表3实施例1-实施例8中与对照组的冻干校准品37℃加速30天稳定性评估
表4实施例1-实施例8中与对照组的冻干校准品复溶2-8℃放置6个月稳定性评估
表1所示对照组在-20℃冻融1次后活性有明显下降，与原料声称不能冻融一致。可能原因是冻融后氧化低密度脂蛋白的结构发生了明显的变化，导致活性下降。实施例1～实施例4的氧化低密度脂蛋白保护剂能够有效保护氧化低密度脂蛋白的结构，减少冻融过程对氧化低密度脂蛋白的破坏。表2所示，实施例1～实施例4的氧化低密度脂蛋白保护剂配制的氧化低密度脂蛋白在2-8℃放置6个月稳定，与原有1个月的效期有显著提高。
表3和表4所示实施例1～实施例4的氧化低密度脂蛋白保护剂配制的氧化低密度脂蛋白校准品冻干后37℃放置30天，复溶2-8℃放置6个月活性下降在10％以内，能够长时间维持稳定。实施例5中环糊精的使用过高在冻融后会出现析出现象，在2-8℃放置时间长后同样可能出现环糊精浓缩析出问题，虽然在室温放置一段时间后能够完全溶解，但在析出过程中可能导致氧化低密度脂蛋白活性的损失。故实施例5对氧化低密度的保护作用弱于实施例1～实施例4，但强于对照组。实施例6用右旋糖酐40替换环糊精，对氧化低密度脂蛋白的保护效果显著下降，尤其是在冷冻过程的保护作用。但其保护作用也明显强于对照组，说明本发明氧化低密度脂蛋白脂蛋白保护剂中其它组分对氧化低密度脂蛋白稳定性共同发挥了作用。实施例7中不加入环糊精对氧化低密度脂蛋白的各条件的保护作用明显低于实施例1～实施例4，与实施例6的保护作用基本一致。
实施例10
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白样本处理液的一种实施例，本实施例的样本处理包括如下浓度或重量百分数的组分：
磷酸盐缓冲液5mM(pH7.0)、实施例1中氧化低密度脂蛋白保护剂10wt％、曲拉通100 0.02wt％。氧化低密度脂蛋白样本处理液：样本＝100：1。
实施例11
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白样本处理液的一种实施例，本实施例的样本处理包括如下浓度或重量百分数的组分：
Tris～HCl缓冲液30mM(pH7.8)、实施例2中氧化低密度脂蛋白保护剂20wt％、去氧胆酸钠0.08wt％。氧化低密度脂蛋白样本处理液：样本＝400：1。
实施例12
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白样本处理液的一种实施例，本实施例的样本处理包括如下浓度或重量百分数的组分：
HEPES缓冲液50mM(pH8.0)、实施例3中氧化低密度脂蛋白保护剂50wt％、PluronicF～68 0.1wt％、NP～40 0.1wt％。氧化低密度脂蛋白样本处理液：样本＝800：1。
实施例13
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白样本处理液的一种实施例，本实施例的样本处理包括如下浓度或重量百分数的组分：
HEPES缓冲液50mM(pH8.0)、实施例4中氧化低密度脂蛋白保护剂30wt％、NP～400.2wt％。氧化低密度脂蛋白样本处理液：样本＝200：1。
实施例14
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白样本处理液的一种实施例，本实施例的样本处理包括如下浓度或重量百分数的组分：
Tris～HCl缓冲液30mM(pH7.8)、去氧胆酸钠0.08wt％。氧化低密度脂蛋白样本处理液：样本＝400：1。
实施例15
选取10例临床新鲜样本，使用实施例10～实施例14配制的氧化低密度脂蛋白样本处理液及对应处理比例处理样本，选取生理盐水和对比试剂盒中的样本稀释液作为对照。使用对比试剂盒分别在处理后的0h和24小时检测。在0h时，计算生理盐水及实施例10-实施例14样本检测结果与样本稀释液检测结果的相对偏差。在24h时，计算第24h检测结果与第0h检测结果的相对偏差(B)。结果如表5和表6所示。
表5实施例10-实施例14样本处理后0h检测结果单位：U/L
表6实施例10-实施例14样本处理后24h检测结果单位：U/L
表5和表6显示实施例10～实施例14样本处理液处理样本后检测结果与对比试剂盒样本稀释液检测结果基本一致，而生理盐水处理样本因抗原位点未暴露出来检测结果明显偏低，从而检测结果不准确。样本处理后在2-8℃放置24小时后再次检测，实施例10～实施例13的样本处理液检测结果与0小时检测结果的相对偏差均在±10.00％以内，实施例14的样本处理结果与0小时检测结果出现明显降幅，说明不添加氧化低密度脂蛋白保护剂的样本处理液处理后的样本不稳定。对比试剂盒样本处理液处理24时后也出现明显的降幅。故本发明的样本处理液不仅能够使样本中氧化低密度脂蛋白的抗原位点暴露，而且还能保持处理后样本的稳定性。从而保证检测结果的准确可靠。
实施例16
吖啶酯标记抗标记抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B单克隆抗体的浓度选定标准：
采用方阵法将吖啶酯标记抗标记抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B单克隆抗体以不同稀释度进行配对，以最低信噪比大于5，最高信噪比大于70为基准，优选成本最低的配比关系。
将吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体以1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600的不同稀释度，与辣根过氧化物酶标记的抗载脂蛋白B单克隆抗体1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200的不同稀释度进行方阵法考察。两组比例交叉配比，最终选取最优的配比比例为吖啶酯标记抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体1：200和辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B单克隆抗体1：800。
实施例17
作为本发明所述氧化低密度脂蛋白检测试剂盒的一种实施例，检测试剂包括校准品、试剂R1、试剂R2和样本处理液。校准品制备以实施例2配方配制，按实施例8冻干工艺制备。样本处理液以实施例11配制。
试剂R1：pH7.5
试剂R2：pH7.5
实施例18
本发明所述的氧化低密度脂蛋白检测试剂盒，需配套全自动化学发光分析仪(型号HomoG 100)和全自动免疫检验系统用底物液检测，其参数如表7。
分析方法：仪器按照表7流程检测。测定后以校准品浓度为X坐标，以峰面积作为Y坐标，作出剂量-反应曲线如图1所示，方程为Y＝1156.8+213.89X，R2＝0.9994.根据该剂量-反应曲线计算出样本中氧化低密度脂蛋白的浓度。
表7反应流程
试验例一、准确度试验
使用本发明试剂(具体配方同实施例17)和Mercodia AB的氧化低密度脂蛋白测定试剂盒(酶联免疫法)，分别对40例新鲜人血清按各自的参数同时进行测定，对测定值进行相关性回归分析，测定结果见图2。
由图2的结果看出，两种试剂的相关系数R2＝0.9948，回归方程y＝0.0097+1.0085x，结果表明本试剂与商品化对比试剂测定样本中氧化低密度脂蛋白的相关性良好，具有很好的可比性。
试验例二、精密度试验
试剂：本发明试剂(具体配方同实施例17)。
仪器：全自动化学发光分析仪，型号：HomoG 100.
操作步骤：选用2个不同浓度的血清样本，各测试10次，计算测试的均值、SD和CV。结果如表8所示。
表8结果显示，本发明试剂检测2个血清的CV值均小于2％，精密度较好。
表8精密度试验评估结果
| 测定次数 | 样本1 | 样本2 |
| 1 | 24.67 | 57.41 |
| 2 | 24.49 | 59.78 |
| 3 | 24.29 | 59.98 |
| 4 | 24.45 | 59.45 |
| 5 | 24.59 | 59.23 |
| 6 | 23.78 | 59.59 |
| 7 | 24.62 | 57.92 |
| 8 | 24.18 | 58.14 |
| 9 | 23.89 | 59.47 |
| 10 | 24.21 | 57.28 |
| 均值 | 24.32 | 58.83 |
| SD | 0.31 | 1.03 |
| CV | 1.26％ | 1.74％ |
试验例三、线性试验
采用本发明试剂(具体配方同实施例17)，高值样本、低值样本。
仪器：全自动化学发光分析仪，型号：HomoG 100.
操作步骤：将高低值样本按照5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L配制6个线性样本，各样本重复测定结果如表9。
表9结果标识，本发明试剂在10-140U/L范围内线性良好，线性范围宽，如图3。
表9线性评估结果
试验例四抗干扰试验
取新鲜混合血清，分成8等份，按照表10浓度加入不同的干扰物质，取本发明实施例15的试剂测定血清中氧化低密度脂蛋白的含量，测定结果如表11所示。添加表10相应浓度的干扰物质对样本检测结果没有影响。
表10干扰物质浓度
表11抗干扰试验检测结果
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (6)
1.一种氧化低密度脂蛋白保护剂，其特征在于，包括以下浓度或重量百分数的组分：
磷酸盐缓冲液25mM、牛血清白蛋白0.5 wt%、甘露醇1wt%、吐温80 0.15wt%、乙二胺四乙酸二钠0.25wt%、甲基-β-环糊精1wt%、ProClin3000.05wt%，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5。
2.一种氧化低密度脂蛋白样本处理液，其特征在于，所述氧化低密度脂蛋白样本处理液包括如权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白保护剂10%~50%、缓冲液 5mM~50mM和表面活性剂 0.02%~0.2%。
3.如权利要求2所述的氧化低密度脂蛋白样本处理液，其特征在于，所述表面活性剂为去氧胆酸钠、曲拉通100、Pluronic F~68和NP~40中的至少一种；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris~HCl缓冲液或HEPES缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH在7.0~8.0。
4.一种测定氧化低密度脂蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括校准品、试剂1、试剂2和如权利要求2或3所述的氧化低密度脂蛋白样本处理液；
所述试剂R1的组分及终浓度为：
缓冲液5mM~50mM
吖啶酯标记的抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体2~6mg/L
稳定剂10.5~5w/v%
所述试剂R2的组分及终浓度为：
缓冲液5mM~50mM
辣根过氧化物酶标记抗载脂蛋白B单克隆抗体0.2~2mg/L
稳定剂20.5~5w/v%。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，校准品的制备方法包括使用如权利要求1所述的氧化低密度脂蛋白保护剂稀释抗原获得；
所述校准品的制备方法还包括真空冷冻干燥，冻干参数如下：
预冻阶段：温度降至-4℃，维持1-2h后再降温至-40℃维持3-5h；
升华干燥：温度由-40℃升至-18℃，升温时间为1h，控制在-18℃干燥12~24h，真空度维持在15~30Pa；
解析干燥：温度由-18℃升至40℃，升温时间为2h，在40℃干燥4-6h，真空度维持在10Pa以下；
冻干完毕后充入惰性气体，取出冻干样本，得到校准品。
6.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1或试剂2的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液中的一种；所述试剂1或试剂2的缓冲液的pH为6.5~8；所述稳定剂1或稳定剂2为牛血清白蛋白、酸水解酪蛋白、甘露醇、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、酶稳定剂中的一种或几种。
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