CN117247989A - 一种液体型凝血酶时间测定试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种液体型凝血酶时间测定试剂及其制备方法，液体型凝血酶时间测定试剂包括以下组分：5U/mL‑10U/mL牛凝血酶；10mM‑500mM L‑还原型谷胱甘肽；5mM‑100mM葡萄糖酸钙；0.1％‑10％聚乙二醇‑4000；3％‑12％牛血清白蛋白；10‑150mM缓冲液；0.1％～5％防腐剂；余量为水。本发明解决了现有液体型凝血酶时间检测试剂稳定性不佳的技术问题，实现了提高液体型凝血酶时间检测试剂稳定性的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及医学体外诊断技术领域，具体而言，涉及一种液体型凝血酶时间测定试剂及其制备方法。
背景技术
凝血酶是一种内切丝氨酸蛋白酶(serine protease)，具有选择性地水解纤维蛋白原中的Arg-Gly键。通过裂解纤维蛋白原，凝血酶促使纤维蛋白的形成，并释放出两个肽段，即纤维蛋白肽A和纤维蛋白肽B。
凝血酶时间(Thrombin Time/TT)的技术原理是向枸橼酸纳抗凝的贫血小板血浆中加入凝血酶，能够反映纤维蛋白原转化纤维蛋白的能力，已作为一种临床上广泛应用的凝血功能筛查的重要指标。
凝血酶时间目前基本上采用冻干粉试剂，冻干粉试剂便于运输，且有较长的保质期。然而，它们也存在较多缺点，如需要冷冻工序和复溶液的使用导致的瓶间差。冻干粉试剂在使用前需要进行复溶，通常使用厂家提供的复溶液或去离子水来恢复试剂到冻干前的溶液状态。这个过程需要额外的操作步骤，并且可能会引入人为误差。此外，冻干粉试剂的复溶过程可能对试剂的活性产生影响。如果复溶不当或溶解过程中发生了变化，可能会影响试剂的准确性和可重复性。
但是，液体试剂能够克服干粉试剂复溶过程或冻干过程带来的缺陷，所有成分均匀分散在溶液中。这意味着液体试剂不需要复溶过程，可以直接使用，节省时间和操作步骤，并减少人为误差的风险。此外，液体试剂在灌装过程中能够保持成分和浓度的稳定性，不会引起变化。这确保了不同瓶子之间或同一批次内试剂有效成分的浓度完全相同，消除了瓶间和批内差异的问题。由于液体试剂具有更好的均一性，因此它们能够提供更准确和可靠的测定结果，对疾病的防治具有重要意义。但是，在液态环境中，凝血酶很容易失去活性，从而导致蛋白活性的丧失。
存在的问题是：现有液体型凝血酶时间检测试剂稳定性不佳。
发明内容
本发明解决了现有液体型凝血酶时间检测试剂稳定性不佳的技术问题，实现了提高液体型凝血酶时间检测试剂稳定性的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种液体型凝血酶时间测定试剂，包括以下组分：5U/mL-10U/mL牛凝血酶；10mM-500mM L-还原型谷胱甘肽；5mM-100mM葡萄糖酸钙；0.1％-10％聚乙二醇-4000；3％-12％牛血清白蛋白；10-150mM缓冲液；0.1％～5％防腐剂；余量为水。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：L-还原型谷胱甘肽是谷胱甘肽的还原形式，也是一种具有强大抗氧化功能的小分子化合物。它在细胞内起着重要的抗氧化作用，有助于恢复凝血酶的活性并保持其稳定性。通过L-还原型谷胱甘肽可以防止凝血酶受到自由基、过氧化物和其他氧化剂的损伤。葡萄糖酸钙在凝血酶时间测定中，可以起到辅助凝血的作用，而且葡萄糖酸钙提供了可溶性的钙离子，在血液凝固过程中，钙离子是必需的因子之一。聚乙二醇-4000是一种高分子多羟基化合物，具有良好的溶解性和稳定性，它可以在试剂中形成保护层，防止试剂成分与外部环境接触，提高试剂的稳定性。牛血清白蛋白是一种稳定剂，能够保持抗体分子结构和活性的稳定。缓冲液能够维持试剂的pH值相对稳定。防腐剂，能够防止试剂受到微生物的污染。本发明增加新的稳定剂，即L-还原型谷胱甘肽，可以改善液体凝血酶测定试剂的稳定性，并提高其在储存和使用过程中的性能表现，这些稳定剂具有保护试剂成分免受降解、氧化或其他不利因素影响的特性。
在本发明的一个实例中，液体型凝血酶时间测定试剂包括以下组分：10U/mL牛凝血酶；150mM L-还原型谷胱甘肽；31.46mM葡萄糖酸钙；0.5％聚乙二醇-4000；5％牛血清白蛋白；50mM缓冲液；1％防腐剂；余量为水。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：上述组分为本发明提供的液体型凝血酶时间测定试剂的优选组分，通过优化稳定剂的选择和配比，可以提高试剂的耐热性、耐湿性和长期稳定性。
在本发明的一个实例中，缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、柠檬酸、磷酸、乙酸、咪唑、3-(N-吗啡啉)丙磺、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷、三羟甲基氨基甲烷、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二醋酸、2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用以上任一缓冲液或其组合，能够维持试剂的pH值相对稳定。
在本发明的一个实例中，缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：优选地，缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，其是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，且对细胞无毒性作用。
在本发明的一个实例中，防腐剂为ProClin300、叠氮化钠、环丙沙星、丙酸或苯甲酸钠中的一种或多种。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用以上任一防腐剂或其组合，能够防止试剂受到微生物的污染，从而延长试剂的有效期并减少质量变异。
在本发明的一个实例中，防腐剂为ProClin300。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：优选地，防腐剂为ProClin300，其可在更长时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长试剂的储存时间。而且其水溶性佳，可轻易溶于所需试剂中。
在本发明的一个实例中，液体型凝血酶时间测定试剂的pH为7.2-7.5。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：凝血酶在弱碱性环境下更易生存，为了保障凝血酶的活性，因此，需要对试剂的pH进行调控，以维持蛋白活性。
在本发明的一个实例中，液体型凝血酶时间测定试剂的pH为7.3。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：优选地，液体型凝血酶时间测定试剂的pH为7.3，凝血酶的活性更佳，更易被长久储存，且检测结果更为准确。
本发明还提供一种上述实例的液体型凝血酶时间测定试剂的制备方法，包括：采用蒸馏水将10mM-500mM L-还原型谷胱甘肽，5mM-100mM葡萄糖酸钙，0.1％-10％聚乙二醇-4000，3％-12％牛血清白蛋白，10-150mM缓冲液，0.1％～5％防腐剂溶解，并用蒸馏水定容至1L，混合均匀后，加入5U/mL-10U/mL牛凝血酶，混合均匀后即获得液体型凝血酶时间测定试剂。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用以上方法制备液体型凝血酶时间测定试剂，操作方便快捷，而且各个组分均匀分散在溶液中，具有更好的均一性，因此能够提供更准确和可靠的测定结果。制备得到得液体试剂在检测过程中，不需要复溶过程，可以直接使用，进而节省时间和操作步骤，并减少人为误差的风险。
在本发明的一个实例中，在用蒸馏水定容之前还包括：采用氢氧化钠将溶液的pH调节至7.2-7.5。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用氢氧化钠调节pH，操作方便，高效便捷。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例提供的液体型凝血酶时间测定试剂与西门子凝血酶时间测定试剂(冻干粉型)分别进行凝血酶时间检测的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
本发明提供一种液体型凝血酶时间测定试剂，包括以下组分：5U/mL-10U/mL牛凝血酶；10mM-500mM L-还原型谷胱甘肽；5mM-100mM葡萄糖酸钙；0.1％-10％聚乙二醇-4000；3％-12％牛血清白蛋白；10-150mM缓冲液；0.1％～5％防腐剂；余量为水。
优选地，液体型凝血酶时间测定试剂包括以下组分：10U/mL牛凝血酶；150mM L-还原型谷胱甘肽；31.46mM葡萄糖酸钙；0.5％聚乙二醇-4000；5％牛血清白蛋白；50mM缓冲液；1％防腐剂；余量为水。
进一步地，缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、柠檬酸、磷酸、乙酸、咪唑、3-(N-吗啡啉)丙磺、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷、三羟甲基氨基甲烷、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二醋酸、2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。
优选地，缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
进一步地，防腐剂为ProClin300、叠氮化钠、环丙沙星、丙酸或苯甲酸钠中的一种或多种。
优选地，防腐剂为ProClin300。
进一步地，液体型凝血酶时间测定试剂的pH为7.2-7.5。
优选地，液体型凝血酶时间测定试剂的pH为7.3。
进一步地，本发明还提供一种上述实例的液体型凝血酶时间测定试剂的制备方法，包括：采用蒸馏水将10mM-500mM L-还原型谷胱甘肽，5mM-100mM葡萄糖酸钙，0.1％-10％聚乙二醇-4000，3％-12％牛血清白蛋白，10-150mM缓冲液，0.1％～5％防腐剂溶解，并用蒸馏水定容至1L，混合均匀后，加入5U/mL-10U/mL牛凝血酶，混合均匀后即获得液体型凝血酶时间测定试剂。
进一步地，在用蒸馏水定容之前还包括：采用氢氧化钠将溶液的pH调节至7.2-7.5。
优选地，在用蒸馏水定容之前还包括：采用氢氧化钠将溶液的pH调节至7.3。
本发明的以下实施例中使用的各组分来源分别为：来自北京默克有限公司的L-还原型谷胱甘肽(货号：V900456)、来自北京默克有限公司的葡萄糖酸钙(货号：G4625)、来自北京索莱宝科技有限公司的牛血清白蛋白(货号：A8020)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(货号：H8090)、聚乙二醇PEG 4000(货号：P8240)，来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司的ProClin 300(货号：P406395)，来自上海冠东生物科技有限公司的凝血酶冻干粉。
实施例1：
液体型凝血酶时间测定试剂1的配制：
称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸11.9g，L-还原型谷胱甘肽30.73g，葡萄糖酸钙13.54g，聚乙二醇-4000 5g，牛血清白蛋白50g，ProClin 300 10ml，加入蒸馏水溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至7.3，定容至1L。加入10U/mL牛凝血酶，经搅拌均匀后，即获取液体型凝血酶时间测定试剂1。
使用希森美康CS2400全自动凝血分析仪进行凝血酶时间检测，操作步骤如下：
取50uL血液样本37℃温育1分钟，加入100uL液体型凝血酶时间测定试剂混合后，凝固反应启动，仪器自动测定凝固时间。
重复性检测：
选择两个枸橼酸纳抗凝的临床血浆，分别重复测定10次，计算平均值，标准差和CV％。结果如表1所示。
表1
| 重复次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 平均值 | 标准差 | CV％ |
| 样本1 | 17.9 | 18.3 | 17.6 | 18 | 17.9 | 17.9 | 17.9 | 17.8 | 17.9 | 17.9 | 17.91 | 0.173 | 0.97％ |
| 样本2 | 24.6 | 24.1 | 24.4 | 24.6 | 24.9 | 24.8 | 25.1 | 24.6 | 24.8 | 24.6 | 24.65 | 0.276 | 1.12％ |
结果表明，检测两个样本的凝血酶时间结果CV％＜2％，符合行业标准。
对比例1：
未加入L-还原型谷胱甘肽的液体型凝血酶时间测定试剂2的配制：
称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸11.9g，葡萄糖酸钙13.54g，聚乙二醇-4000 5g，牛血清白蛋白50g，ProClin 300 10ml，加入蒸馏水中溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至7.3，定容至1L。加入10U/mL牛凝血酶，经搅拌均匀后即获取液体型凝血酶时间测定试剂2。
将实施例1与对比例1配制完成的各试剂放置于4℃和37℃环境下，于第7天、第14天使用希森美康CS2400测定参考品的数值，比较其秒数偏移情况，第7天和第14天的测定结果的对比结果如表2所示。
表2
根据表2可知，由于实施例1的测定试剂中加入了L-还原型谷胱甘肽，因而，其检测结果的秒数偏移明显小于对比例1的测定试剂，说明添加L-还原型谷胱甘肽可有效提升试剂的稳定性。
实施例2：
液体型凝血酶时间测定试剂3的配制：
称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸11.9g，L-还原型谷胱甘肽15.73g，葡萄糖酸钙13.54g，聚乙二醇-4000 5g，牛血清白蛋白50g，ProClin 300 10ml，加入蒸馏水溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至7.3，定容至1L。加入10U/mL牛凝血酶，经搅拌均匀后，即获取液体型凝血酶时间测定试剂3。
实施例3：
液体型凝血酶时间测定试剂4的配制：
称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸11.9g，L-还原型谷胱甘肽46.1g，葡萄糖酸钙13.54g，聚乙二醇-4000 5g，牛血清白蛋白50g，ProClin 300 10ml，加入蒸馏水溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至7.3，定容至1L。加入10U/mL牛凝血酶，经搅拌均匀后，即获取液体型凝血酶时间测定试剂4。
实施例4：
液体型凝血酶时间测定试剂3的配制：
称取4-羟乙基哌嗪乙磺酸11.9g，L-还原型谷胱甘肽61.46g，葡萄糖酸钙13.54g，聚乙二醇-4000 5g，牛血清白蛋白50g，ProClin 300 10ml，加入蒸馏水溶解，用氢氧化钠调节溶液pH至7.3，定容至1L。加入10U/mL牛凝血酶，经搅拌均匀后，即获取液体型凝血酶时间测定试剂5。
实施例1至4提供的液体型凝血酶时间测定试剂的各组分，L-还原型谷胱甘肽含量不同，实施例1为100mM L-还原型谷胱甘肽，实施例2为50mM L-还原型谷胱甘肽，实施例3为150mM L-还原型谷胱甘肽，实施例4为200mM L-还原型谷胱甘肽。
将实施例1至4配制完成的各测定试剂放置于4℃和37℃环境下，于第7天使用希森美康CS2400测定参考品的数值，比较其秒数偏移情况，第7天的测定结果的对比结果如表3所示。
表3
根据表3可知，当L-还原型谷胱甘肽为150mM时，凝血酶时间测定试剂检测偏差最小，稳定性最佳，故选用150mM作为L-还原型谷胱甘肽的优选浓度。
实施例5：
选用实施例3提供的液体型凝血酶时间测定试剂，与市场上占有率最大的西门子凝血酶时间测定试剂(冻干粉型)，分别检测50个临床样本凝血酶时间，检测结果参见图1。
根据图1可知，相比于该冻干粉试剂，本发明提供的液体型凝血酶时间测定试剂，稳定性好，重复性高，并且能保持检测结果基本一致，因此能够广泛应用于临床检测，使凝血酶时间检测更加准确。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，包括以下组分：
5U/mL-10U/mL牛凝血酶；
10mM-500mM L-还原型谷胱甘肽；
5mM-100mM葡萄糖酸钙；
0.1％-10％聚乙二醇-4000；
3％-12％牛血清白蛋白；
10-150mM缓冲液；
0.1％～5％防腐剂；
余量为水。
2.根据权利要求1所述的液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，包括以下组分：
10U/mL牛凝血酶；
150mM L-还原型谷胱甘肽；
31.46mM葡萄糖酸钙；
0.5％聚乙二醇-4000；
5％牛血清白蛋白；
50mM缓冲液；
1％防腐剂；
余量为水。
3.根据权利要求1或2所述的液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、柠檬酸、磷酸、乙酸、咪唑、3-(N-吗啡啉)丙磺、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷、三羟甲基氨基甲烷、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二醋酸、2-吗啉乙磺酸中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
5.根据权利要求1或2所述的液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述防腐剂为ProClin300、叠氮化钠、环丙沙星、丙酸或苯甲酸钠中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述防腐剂为ProClin300。
7.根据权利要求1所述的液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述液体型凝血酶时间测定试剂的pH为7.2-7.5。
8.根据权利要求7所述的液体型凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述液体型凝血酶时间测定试剂的pH为7.3。
9.一种如权利要求1所述的液体型凝血酶时间测定试剂的制备方法，其特征在于，包括：
采用蒸馏水将10mM-500mM L-还原型谷胱甘肽，5mM-100mM葡萄糖酸钙，0.1％-10％聚乙二醇-4000，3％-12％牛血清白蛋白，10-150mM缓冲液，0.1％～5％防腐剂溶解，并用蒸馏水定容至1L，混合均匀后，加入5U/mL-10U/mL牛凝血酶，混合均匀后即获得所述液体型凝血酶时间测定试剂。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在用蒸馏水定容之前还包括：
采用氢氧化钠将溶液的pH调节至7.2-7.5。
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