CN115586179A

CN115586179A - 一种用于抗凝血酶ⅲ活性测定的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115586179A
Application number: CN202110757480.6A
Authority: CN
Inventors: 曹佳强; 郑剑通
Original assignee: Shenzhen Dymind Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Dymind Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2023-01-10

Abstract

本申请涉及生物医药技术领域，具体公开了一种用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂以及稀释液；第一试剂至少包括：第一缓冲剂、凝血酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及第一稳定剂；第二试剂至少包括：第二缓冲剂、发色底物以及第二稳定剂；第三试剂至少包括：第三缓冲剂、肝素、异丙醇以及第三稳定剂；稀释液至少包括：生理盐水以及第四稳定剂。通过上述方式，本申请的试剂盒成本低廉、抗干扰能力强、灵敏度高、稳定性好，具有较广的应用前景。

Description

一种用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，特别是涉及一种用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒及其应用。

背景技术

抗凝血酶III是一种单链糖蛋白，属于α2球蛋白，抗凝血酶III具有分解脂蛋白的作用，对凝血系统中几乎所有的活性丝氨酸蛋白酶都有抑制作用。抗凝血酶III作为血液中活性凝血因子最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解。血液中抗凝血酶III的水平根据各种疾病、症状而变化。在弥散性血管内凝血(DIC)、肝疾患、肾病综合征等中降低。血液中的抗凝血酶III水平降低可能会导致肝素治疗效果无法呈现。因此，掌握抗凝血酶III的活性作为对于此类疾病的监测、病态分析、预后判定以及肝素治疗或使用抗凝血酶III浓缩制剂投药时的指标具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本申请提供了一种用于抗凝血酶 Ⅲ活性测定的试剂盒及其应用，该试剂盒成本低廉、抗干扰能力强、灵敏度高、稳定性好，具有较广的应用前景。

为达此目的，本申请采用以下技术方案：

第一方面，本申请提供了一种用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂以及稀释液；第一试剂至少包括：第一缓冲剂、凝血酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及第一稳定剂；第二试剂至少包括：第二缓冲剂、发色底物以及第二稳定剂；第三试剂至少包括：第三缓冲剂、肝素、异丙醇以及第三稳定剂；稀释液至少包括：生理盐水以及第四稳定剂。

其中，凝血酶包括牛凝血酶，凝血酶的浓度为10～30IU/mL。

其中，第一试剂和第二试剂以冻干粉的形式装于试剂盒内，第三试剂和稀释液以液体的形式装于试剂盒内；第一试剂和第二试剂还包括：赋形剂，其中，赋形剂选自甘露醇、海藻糖、聚乙二醇、蔗糖、纤维素、糖原、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮及葡聚糖中的任意一种或几种。

其中，肝素为肝素钠，肝素的浓度为1～5IU/mL。

其中，第一缓冲剂和/或第二缓冲剂和/或第三缓冲剂选自Tris-HCl 缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-EDTA缓冲液、Mes缓冲液和HEPES缓冲液中的任意一种或几种；第一缓冲剂和/或第二缓冲剂和/或第三缓冲剂的浓度为20～80mmol/L。

其中，第一稳定剂和/或第二稳定剂和/或第三稳定剂和/或第四稳定剂选自牛血清白蛋白、Tween-20中的任意一种或几种。

其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂为抑肽酶、α2-抗纤溶酶、α2-巨球蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、赖氨酸类似物或其组合。

其中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、稀释液中的至少一种还包括：防腐剂。

其中，第一试剂包括如下终浓度的组分：2％～4％甘露醇、1％～3％海藻糖、1％～3％聚乙二醇-6000、0.5～1.5％牛血清白蛋白、10～30IU/mL 牛凝血酶、1～5IU/mL抑肽酶、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第一试剂总体积的质量体积百分比，第一试剂的pH 值为7.2～7.6；第二试剂包括如下终浓度的组分：3％～5％甘露醇、0.5～1.5％海藻糖、0.5～1.5％聚乙二醇-6000、0.1～0.5％Tween-20、0.03～0.05％防腐剂、1～3mmol/L发色底物、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第二试剂总体积的质量体积百分比，第二试剂的pH 值为7.2～7.6；第三试剂包括如下终浓度的组分：1～3％异丙醇、 0.1～0.5％Tween-20、0.03～0.05％防腐剂、1～5IU/mL肝素钠、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第三试剂总体积的质量体积百分比，第三试剂的pH值为7.2～7.6；稀释液包括如下终浓度的组分：0.9％氯化钠、0.5～1.5％牛血清白蛋白、0.03～0.05％防腐剂，余量为水，其中的百分比为占稀释液总体积的质量体积百分比，稀释液的pH 值为7.2～7.6。

第二方面，本申请提供了前述的试剂盒在制备用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的医疗器械中的应用。

与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：

(1)本申请通过加入异丙醇，可减少肝素辅助因子II的干扰，并可提高线性范围；

(2)本申请通过加入稳定剂，不仅可以减少肝素辅助因子II的干扰，还对凝血酶有一定的稳定作用，并可提高线性范围；

(3)本申请通过加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，可减少丝氨酸蛋白酶的干扰，并可提高线性范围；

本申请的试剂盒成本低廉、抗干扰能力强、灵敏度高、稳定性好，提高可检测的范围，具有较广的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。其中：

图1是本申请实施例1的用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒的实测值与参比试剂的实测值之间的线性相关性图；

图2是本申请实施例2的用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒的实测值与参比试剂的实测值之间的线性相关性图；

图3是本申请实施例3的用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒的实测值与参比试剂的实测值之间的线性相关性图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请发明人在长期研究过程中，发现抗凝血酶III不仅具有抗凝血酶活性，还具有抗丝氨酸蛋白酶(如FXa、FIXa、FXIa、FXIIa等凝血因子以及纤溶酶、胰蛋白酶、激肽释放酶等)活性，抗凝血酶III上的精氨酸残基可以与丝氨酸蛋白酶的丝氨酸残基结合，因此，样本中的丝氨酸蛋白酶会干扰抗凝血酶III的活性测定结果；此外，本申请发明人还发现待测样本中存在具有抗凝血酶活性的肝素辅助因子II，导致在应用发色底物法测定的剩余凝血酶活性是凝血酶与抗凝血酶III和肝素辅助因子II反应后的剩余活性，这在肝素辅助因子II水平正常的病人，抗凝血酶III的缺乏将有可能由于肝素辅助因子II的抗凝血酶活性而掩盖。因此，该法易受样本中肝素辅助因子II的干扰而导致抗凝血酶III 的测定不准确，尤其是在抗凝血酶III缺乏的待测样本中。

为此，本申请提出一种用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒，该试剂盒基于发色底物法，该方法具有灵敏度高、准确性好、检测时间短的特点，且能够适用于多种自动化分析仪器。

具体而言，本申请的试剂盒包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂以及稀释液。第一试剂至少包括：第一缓冲剂、凝血酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及第一稳定剂。第二试剂至少包括：第二缓冲剂、发色底物以及第二稳定剂。第三试剂至少包括：第三缓冲剂、肝素、异丙醇以及第三稳定剂。稀释液至少包括：生理盐水以及第四稳定剂。

其中，生理盐水为0.8％～1％的氯化钠溶液，生理盐水可以用于调节第一试剂的渗透压，从而可以提高第一试剂在测定抗凝血酶III活性时的效率。

本申请试剂盒的检测原理为：第一试剂中的凝血酶相对于待测血浆中的抗凝血酶III为过量，在第三试剂的肝素催化下，第一试剂中的凝血酶可与待测血浆中的抗凝血酶III作用，形成无活性复合物，使凝血酶部分失活，剩余的凝血酶将作用于第二试剂中的发色底物，裂解出显色基团，显色深浅与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中抗凝血酶III 活性呈负相关。

其中，上述肝素能够增强抗凝血酶III的抗凝血酶活性，且降低肝素辅助因子II对抗凝血酶III活性测定的影响。

其中，上述第一试剂中的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有丝氨酸蛋白酶抑制活性且有较好的抑制特异性，可减少丝氨酸蛋白酶对抗凝血酶III的干扰。

其中，上述第三试剂中的异丙醇能够有效地降低肝素辅助因子II对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。

其中，上述各个稳定剂在降低肝素辅助因子II对抗凝血酶III活性测定的干扰的同时，可以稳定凝血酶，从而提高测量的准确性。

其中，上述各个缓冲剂用于调节对应试剂的pH值。

在一实施例中，凝血酶包括牛凝血酶，利用牛凝血酶取代人凝血酶可降低肝素辅助因子II对抗凝血酶Ⅲ检测的影响。

可选地，凝血酶的浓度为10～30IU/mL，例如凝血酶的浓度为10 IU/mL、20IU/mL或30IU/mL。

在一实施例中，肝素可以是以其盐的形式提供的，例如可以为肝素钠。

可选地，肝素的浓度为1～5IU/mL，在该浓度范围内，可以有效地促进凝血酶与抗凝血酶III之间的反应，而肝素辅助因子II得不到充分催化，从而降低肝素辅助因子II的干扰。例如肝素的浓度为1IU/mL、 3IU/mL或5IU/mL。由此，可以有效地促进凝血酶与抗凝血酶III之间的反应。

在一实施例中，第一缓冲剂和/或第二缓冲剂和/或第三缓冲剂选自 Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-EDTA缓冲液、Mes缓冲液和HEPES 缓冲液中的任意一种或几种。

可选地，第一缓冲剂和/或第二缓冲剂和/或第三缓冲剂的浓度为20mmol/L，第一缓冲剂和/或第二缓冲剂和/或第三缓冲剂的浓度为 50mmol/L，第一缓冲剂和/或第二缓冲剂和/或第三缓冲剂的浓度为 80mmol/L。

在一实施例中，第一稳定剂和/或第二稳定剂和/或第三稳定剂和/或第四稳定剂选自牛血清白蛋白、Tween-20中的任意一种或几种。

由于凝血酶在低浓度下不稳定或活性低，加入牛血清白蛋白后，加入牛血清白蛋白可起到保护或载体作用，使凝血酶的活性大幅度提高，因此，在第一试剂和用于稀释第一试剂的稀释液中，可选用牛血清白蛋白为稳定剂。

而吐温20具有稳定发色底物和肝素的作用，因此，在第二试剂和第三试剂中，可选用吐温20为稳定剂。

在发色底物法检测抗凝血酶III活性的过程中，作为凝血酶底物，要求具有较高的敏感性和较好的水溶性，才能有效提高检测的灵敏度，且具有较宽的线性范围，保证测试结果的准确性。如果发色底物的溶解度过低，试剂接近饱和状态，检测过程中易产生沉淀而导致测定结果的不准确。为此，本申请选用溶解度较好的发色底物： H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(S-2238)。

在一实施例中，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以为纤溶酶抑制剂，纤溶酶抑制剂具有强纤溶酶抑制活性且有较好的抑制特异性，能显著抑制纤溶酶的溶解纤维蛋白作用。

可选地，纤溶酶抑制剂为抑肽酶、α2-抗纤溶酶、α2-巨球蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、赖氨酸类似物或其组合。

在一实施例中，第一试剂、第二试剂、第三试剂、稀释液中的至少一种还包括：防腐剂。可选地，防腐剂为苯甲酸及其盐类、叠氮钠、山梨酸及其盐类、庆大霉素、硫柳汞、Proclin-300等中的任意一种或几种。由此，可以进一步提高该凝血酶水溶液的存储时间。

在一实施例中，第一试剂包括如下终浓度的组分：0.5～1.5％牛血清白蛋白、10～30IU/mL牛凝血酶、1～5IU/mL抑肽酶、20～80mmol/L Tris-HCl 缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第一试剂总体积的质量体积百分比，第一试剂的pH值为7.2～7.6。

第二试剂包括如下终浓度的组分：0.1～0.5％Tween-20、0.03～0.05％防腐剂、1～3mmol/L发色底物、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第二试剂总体积的质量体积百分比，第二试剂的 pH值为7.2～7.6。

第三试剂包括如下终浓度的组分：1～3％异丙醇、0.1～0.5％Tween-20、 0.03～0.05％防腐剂、1～5IU/mL肝素钠、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第三试剂总体积的质量体积百分比，第三试剂的pH值为7.2～7.6。

稀释液包括如下终浓度的组分：0.9％氯化钠、0.5～1.5％牛血清白蛋白、0.03～0.05％防腐剂，余量为水，其中的百分比为占稀释液总体积的质量体积百分比，稀释液的pH值为7.2～7.6。

作为对上述方案的进一步改进，第一试剂和第二试剂以冻干粉的形式装于试剂盒内，第三试剂和稀释液以液体的形式装于试剂盒内。因此，第一试剂和第二试剂还包括：赋形剂，其中，赋形剂选自甘露醇、海藻糖、聚乙二醇、蔗糖、纤维素、糖原、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮及葡聚糖中的任意一种或几种。

在一实施例中，上述第一试剂和第二试剂采用的聚乙二醇的分子量可以为2000～20000(例如2000、6000、10000、20000)，由此，可以进一步提高冻干粉形式的第一试剂和第二试剂的稳定性。

具体地，第一试剂的冻干粉的制备方法为：1)制备第一试剂，第一试剂包括如下终浓度的组分：2％～4％甘露醇、1％～3％海藻糖、1％～3％聚乙二醇-6000、0.5～1.5％牛血清白蛋白、10～30IU/mL牛凝血酶、 1～5IU/mL抑肽酶、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第一试剂总体积的质量体积百分比，第一试剂的pH值为7.2～7.6；2)将步骤1)中的第一试剂进行低温预冻和冷冻干燥，即得第一试剂冻干粉。

第二试剂的冻干粉的制备方法为：1)制备第二试剂，第二试剂包括如下终浓度的组分：3％～5％甘露醇、0.5～1.5％海藻糖、0.5～1.5％聚乙二醇-6000、0.1～0.5％Tween-20、0.03～0.05％防腐剂、1～3mmol/L发色底物、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第二试剂总体积的质量体积百分比，第二试剂的pH值为7.2～7.6；2)将步骤1)中的第二试剂进行低温预冻和冷冻干燥，即得第二试剂冻干粉。

第一试剂和第二试剂以冻干粉的形式装于试剂盒内，可有效地保护了凝血酶、抑肽酶、牛血清白蛋白、发色底物的活性，稳定性好，在临床应用中能有效的监控试剂的性能。此方法具有成本低、操作简便、可以大批量生产且长期保存的优点。

本申请还提出一种基于前述用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒的抗凝血酶III活性测定方法，该方法包括：取待测样本，加入稀释液稀释，在37℃孵育；取稀释后样本，加入用稀释液复溶的第一试剂在37℃ 孵育；再加入用稀释液复溶的第二试剂、第三试剂在37℃孵育；采用凝血分析仪在405nm下测定第一时间点和第二时间点的吸光度差值(△ OD)。将测得的吸光度差值(△OD)代入标准曲线(五点定标获得)，即可以计算出待测样本中抗凝血酶III的活性(％)。

本申请还提出了前述的试剂盒在制备用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的医疗器械中的应用。

下面通过具体实施例对本申请的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本申请的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。

实施例1

本申请实施例1的用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒包括以下组分：

第一试剂，其经过低温预冻和冷冻干燥后以冻干粉的形式装于试剂盒内，第一试剂包括如下终浓度的组分：3％甘露醇、2％海藻糖、2％聚乙二醇-6000、1％牛血清白蛋白、20IU/mL牛凝血酶、3IU/mL抑肽酶、 50mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第一试剂总体积的质量体积百分比，第一试剂的pH值为7.4。

第二试剂，其经过低温预冻和冷冻干燥后以冻干粉的形式装于试剂盒内，第二试剂包括如下终浓度的组分：4％甘露醇、1％海藻糖、1％聚乙二醇-6000、0.3％Tween-20、0.04％Proclin-300、2mmol/L发色底物 S-2238、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第二试剂总体积的质量体积百分比，第二试剂的pH值为7.4。

第三试剂，包括如下终浓度的组分：2％异丙醇、0.3％Tween-20、 0.04％Proclin-300、3IU/mL肝素钠、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第三试剂总体积的质量体积百分比，第三试剂的 pH值为7.4。

稀释液包括如下终浓度的组分：0.9％氯化钠、1％牛血清白蛋白、 0.04％Proclin-300，余量为水，其中的百分比为占稀释液总体积的质量体积百分比，稀释液的pH值为7.4。

实施例2

本申请实施例2的用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒包括以下组分：

第一试剂，其经过低温预冻和冷冻干燥后以冻干粉的形式装于试剂盒内，第一试剂包括如下终浓度的组分：2％甘露醇、1％海藻糖、1％聚乙二醇-6000、0.5％牛血清白蛋白、10IU/mL牛凝血酶、1IU/mL抑肽酶、 20mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第一试剂总体积的质量体积百分比，第一试剂的pH值为7.2。

第二试剂，其经过低温预冻和冷冻干燥后以冻干粉的形式装于试剂盒内，第二试剂包括如下终浓度的组分：3％甘露醇、0.5％海藻糖、0.5％聚乙二醇-6000、0.1％Tween-20、0.03％Proclin-300、1mmol/L发色底物 S-2238、20mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第二试剂总体积的质量体积百分比，第二试剂的pH值为7.2。

第三试剂，包括如下终浓度的组分：1％异丙醇、0.1％Tween-20、 0.03％Proclin-300、1IU/mL肝素钠、20mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第三试剂总体积的质量体积百分比，第三试剂的 pH值为7.4。

稀释液包括如下终浓度的组分：0.9％氯化钠、0.5％牛血清白蛋白、 0.03％Proclin-300，余量为水，其中的百分比为占稀释液总体积的质量体积百分比，稀释液的pH值为7.4。

实施例3

本申请实施例3的用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒包括以下组分：

第一试剂，其经过低温预冻和冷冻干燥后以冻干粉的形式装于试剂盒内，第一试剂包括如下终浓度的组分：4％甘露醇、3％海藻糖、3％聚乙二醇-6000、1.5％牛血清白蛋白、30IU/mL牛凝血酶、5IU/mL抑肽酶、 80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第一试剂总体积的质量体积百分比，第一试剂的pH值为7.6。

第二试剂，其经过低温预冻和冷冻干燥后以冻干粉的形式装于试剂盒内，第二试剂包括如下终浓度的组分：5％甘露醇、1.5％海藻糖、1.5％聚乙二醇-6000、0.5％Tween-20、0.05％Proclin-300、3mmol/L发色底物 S-2238、80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第二试剂总体积的质量体积百分比，第二试剂的pH值为7.4。

第三试剂，包括如下终浓度的组分：3％异丙醇、0.5％Tween-20、 0.05％Proclin-300、5IU/mL肝素钠、80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占第三试剂总体积的质量体积百分比，第三试剂的 pH值为7.6。

稀释液包括如下终浓度的组分：0.9％氯化钠、1.5％牛血清白蛋白、 0.05％Proclin-300，余量为水，其中的百分比为占稀释液总体积的质量体积百分比，稀释液的pH值为7.6。

对比例1

对比例1第一试剂与实施例1的区别在于，对比例1第一试剂中第一试剂中不含抑肽酶，第二试剂、第三试剂以及稀释液均与实施例1相同。

对比例2

对比例2第一试剂、稀释液与实施例1的区别在于，对比例2第一试剂、稀释液中均不含牛血清白蛋白，第二试剂以及第三试剂均与实施例1相同。

对比例3

对比例3第二试剂、第三试剂与实施例1的区别在于，对比例3第二试剂、第三试剂中均不含Tween-20，第一试剂以及稀释液均与实施例 1相同。

对比例4

对比例4第三试剂与实施例1的区别在于，对比例4第三试剂不含异丙醇，第一试剂、第二试剂以及稀释液均与实施例1相同。

对比例5

对比例5第三试剂与实施例1的区别在于，对比例4第三试剂中肝素钠的浓度为10IU/mL，第一试剂、第二试剂以及稀释液均与实施例1 相同。

对比例6

对比例6第一试剂与实施例1的区别在于，对比例4第一试剂中含 20IU/mL人凝血酶且不含牛凝血酶，第二试剂、第三试剂以及稀释液均与实施例1相同。

实施例4

将实施例1-3以及对比例1-4的抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒进行准确度、空白限、最低检测限、线性范围、重复性、稳定性、抗肝素辅助因子II 干扰能力以及相关性测试。

(1)准确度测试及其结果

按照前述的抗凝血酶III活性测定方法，采用实施例1-3以及对比例 1-6的抗凝血酶III测定试剂盒测定WHO国际标准物质(WHO International StandardNIBSC code:08/258d)的抗凝血酶III活性(％)，重复测试3次，按照以下公式(1)和(2)计算相对偏差，测试结果如表 1所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±8％范围内。

公式(1)：

公式(2)：

式中：

x_i为每次测试的抗凝血酶III活性的实测值(％)；

为实测值的平均值；

n为测试的次数；

i为测试的序号；

B为相对偏差；

T为WHO国际标准品标示值。

表1实施例1-3以及对比例1-6的抗凝血酶III测定试剂盒的准确度测试结果

从表1的测试结果发现，实施例1-3的相对偏差比较低，证明实施例1-3都具有很好的准确性。对比例1-6的相对偏差均不在±8％范围内，对比例1受待测样本中的丝氨酸蛋白酶的干扰，对比例2-3不含稳定剂导致凝血酶、发色底物和肝素的活性下降，对比例4-6受待测样本中的肝素辅助因子II的干扰，因此，对比例1-6的准确性不如实施例1-3。

(2)空白限测试及其结果

按照前述的抗凝血酶III活性测定方法，采用实施例1-3的抗凝血酶III测定试剂盒测定空白样本20次，按照前述的公式(1)和公式(3) 计算平均值

标准差(SD)以及空白限

测试结果如表 2所示。测试结果应符合要求：空白限

应≤5％。

公式(3)：

式中：SD为标准差。

表2实施例1-3的抗凝血酶III测定试剂盒的空白限测试结果

从表2的测试结果发现，实施例1-3均符合≤5％的空白限要求。

(3)最低检测限测试及其结果

按照前述的抗凝血酶III活性测定方法，采用实施例1-3的抗凝血酶 III测定试剂盒对5份浓度近似8％的低值样本进行检测，每份样本检测 5次，对实测值x_i按大小进行排序，测试结果如表3所示。测试结果应符合：①实测值x_i低于5％的数量应≤2个；②实测值x_i均≤80％。

表3实施例1-3的抗凝血酶III测定试剂盒的最低检测限测试结果

从表3的测试结果发现，实施例1-3均符合上述最低检测限要求。

(4)线性范围测试及其结果

将接近线性范围上限的高浓度样本稀释成6个不同浓度的样本，按照前述的抗凝血酶III活性测定方法，采用实施例1-3的抗凝血酶III测定试剂盒对每个浓度的样本重复测定3次，计算3次测试结果的平均值。以样本理论值(xi)为自变量，以样本实际测定结果平均值(yi)为因变量做线性回归。并按公式(4)计算线性回归相关系数r，测试结果如表4所示。测试结果应符合要求：线性范围在10％～170％区间内，线性相关系数r≥0.98。

公式(4)

表4实施例1-3的抗凝血酶III测定试剂盒的线性范围测试结果

从表4的测试结果发现，实施例1-3均符合上述线性范围要求。

(5)重复性测试及其结果

按照前述的抗凝血酶III活性测定方法，采用实施例1-3的抗凝血酶 III测定试剂盒对高浓度(80～120％)、中浓度(30～50％)、低浓度(＜ 30％)的样本进行测定，各测试10次，按照公式(1)和(3)计算测试结果平均值

)和标准差(SD)，按照公式(5)计算变异系数，测试结果如表5所示。测试结果应符合要求：高浓度样本变异系数(CV)应 ≤6％，中浓度样本变异系数(CV)应≤6％，低浓度样本变异系数(CV) 应≤8％。

公式(5)：

式中：CV为变异系数。

表5实施例1-3的抗凝血酶III测定试剂盒的重复性测试结果

从表4的测试结果发现，实施例1-3均符合上述重复性要求。

(6)稳定性测试及其结果

①复溶稳定性：将实施例1-3及对比例2-3的抗凝血酶III测定试剂盒中的第一试剂和第二试剂用稀释液复溶后置于2～8℃储存，在第0天、第10天、第20天、第25天、第30天、第33天、第35天，使用复溶后的抗凝血酶III测定试剂盒进行准确度测试，测试结果如表6所示。测试结果应符合要求：第一试剂和第二试剂复溶后置于2～8℃储存可以稳定30天，即相对偏差应在±8％范围内。

表6实施例1-3以及对比例2-3的抗凝血酶III测定试剂盒的复溶稳定性测试结果

从表6的测试结果发现，实施例1-3符合上述复溶稳定性要求，未添加稳定剂的对比例2-3不符合上述复溶稳定性要求，相比于对比例2-3，实施例1-3的试剂盒具有更高的复溶稳定性。

②加速稳定性：将实施例1-3及对比例2-3的抗凝血酶III测定试剂盒在未开封状态下置于37℃储存，在第0天、第8天、第12天、第16 天、第20天、第22天、第24天，使用加速后复溶的抗凝血酶III测定试剂盒进行准确度测试，测试结果如表7所示。测试结果应符合要求：未开封状态下置于37℃储存可以稳定20天，即相对偏差应在±8％范围内。

表7实施例1-3以及对比例2-3的抗凝血酶III测定试剂盒的加速稳定性测试结果

从表7的测试结果发现，实施例1-3符合上述加速稳定性要求，未添加稳定剂的对比例2-3不符合上述加速稳定性要求，相比于对比例2-3，实施例1-3的试剂盒具有更高的加速稳定性。

(7)抗肝素辅助因子II干扰能力测试及其结果

按照前述的抗凝血酶III活性测定方法，采用实施例1-3以及对比例 4-6的抗凝血酶III测定试剂盒对肝素辅助因子II浓度为0U/mL、1U/mL、 2U/mL、4U/mL、6U/mL的待测血浆样本进行测定，测试结果如表8所示。测试结果应符合要求：对肝素辅助因子II浓度小于等于6U/ml的待测血浆样本，其测试结果的相对偏差在±8％以内。

表7实施例1-3以及对比例4-6的抗凝血酶III测定试剂盒的抗肝素辅助因子II干扰能力测试结果

从表7的测试结果发现，实施例1-3对肝素辅助因子II浓度小于等于6U/ml的待测血浆样本，其测试结果的相对偏差在±8％以内，证明实施例1-3都具有抗肝素辅助因子II干扰能力；而对比例4-6对肝素辅助因子II浓度大于1U/ml且小于等于6U/ml的待测血浆样本，其测试结果的相对偏差均不在±8％范围内，对比例4-6受待测样本中的肝素辅助因子II的干扰。

(8)相关性测试及其结果

采用参比试剂盒(抗凝血酶Ⅲ(AT-III)测定试剂盒(发色底物法)， DIAGNOSTICASTAGO思塔高诊断股份有限公司，国械注进 20162405280)和实施例1-3的抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒同时测试一组覆盖线性范围的临床样本(40例)，以参比试剂盒的实测值为x轴，实施例 1-3试剂盒的实测值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表8和附图 1-3所示。测试结果应符合要求：线性回归分析应符合线性回归方程的斜率k在0.9～1.1之间且相关系数r≥0.975。

表8实施例1-3的相关性测试结果

从表8的测试结果发现，实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒测试临床样本的结果做线性回归分析，线性回归方程的斜率k及相关性r均符合要求，证明实施例1-3的试剂盒与参比试剂盒具有良好的相关性。

综上所述，本申请具有如下有益效果：

另外，本申请要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本申请要求保护的范围内；同时本申请方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本申请精神作举例说明。本申请所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本申请的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims

1.一种用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的试剂盒，其特征在于，包括：第一试剂、第二试剂、第三试剂以及稀释液；

所述第一试剂至少包括：第一缓冲剂、凝血酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及第一稳定剂；

所述第二试剂至少包括：第二缓冲剂、发色底物以及第二稳定剂；

所述第三试剂至少包括：第三缓冲剂、肝素、异丙醇以及第三稳定剂；

所述稀释液至少包括：生理盐水以及第四稳定剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶包括牛凝血酶，所述凝血酶的浓度为10～30IU/mL。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂和所述第二试剂以冻干粉的形式装于所述试剂盒内，所述第三试剂和所述稀释液以液体的形式装于所述试剂盒内；

所述第一试剂和第二试剂还包括：赋形剂，其中，所述赋形剂选自甘露醇、海藻糖、聚乙二醇、蔗糖、纤维素、糖原、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮及葡聚糖中的任意一种或几种。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述肝素为肝素钠，所述肝素的浓度为1～5IU/mL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述第一缓冲剂和/或所述第二缓冲剂和/或所述第三缓冲剂选自Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-EDTA缓冲液、Mes缓冲液和HEPES缓冲液中的任意一种或几种；

所述第一缓冲剂和/或所述第二缓冲剂和/或所述第三缓冲剂的浓度为20～80mmol/L。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一稳定剂和/或所述第二稳定剂和/或所述第三稳定剂和/或所述第四稳定剂选自牛血清白蛋白、Tween-20中的任意一种或几种。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为抑肽酶、α2-抗纤溶酶、α2-巨球蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2、赖氨酸类似物或其组合。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂、所述第二试剂、所述第三试剂、所述稀释液中的至少一种还包括：防腐剂。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，

所述第一试剂包括如下终浓度的组分：2％～4％甘露醇、1％～3％海藻糖、1％～3％聚乙二醇-6000、0.5～1.5％牛血清白蛋白、10～30IU/mL牛凝血酶、1～5IU/mL抑肽酶、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占所述第一试剂总体积的质量体积百分比，所述第一试剂的pH值为7.2～7.6；

所述第二试剂包括如下终浓度的组分：3％～5％甘露醇、0.5～1.5％海藻糖、0.5～1.5％聚乙二醇-6000、0.1～0.5％Tween-20、0.03～0.05％防腐剂、1～3mmol/L发色底物、20～80mmol/L Tris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占所述第二试剂总体积的质量体积百分比，所述第二试剂的pH值为7.2～7.6；

所述第三试剂包括如下终浓度的组分：1～3％异丙醇、0.1～0.5％Tween-20、0.03～0.05％防腐剂、1～5IU/mL肝素钠、20～80mmol/LTris-HCl缓冲液，余量为水，其中的百分比为占所述第三试剂总体积的质量体积百分比，所述第三试剂的pH值为7.2～7.6；

所述稀释液包括如下终浓度的组分：0.9％氯化钠、0.5～1.5％牛血清白蛋白、0.03～0.05％防腐剂，余量为水，其中的百分比为占所述稀释液总体积的质量体积百分比，所述稀释液的pH值为7.2～7.6。

10.一种如权利要求1～9任一项权利要求所述的试剂盒在制备用于抗凝血酶Ⅲ活性测定的医疗器械中的应用。