CN106568765B

CN106568765B - 用于抗凝血酶iii活性测定的凝血酶发色底物液、凝血酶水溶液、方法以及试剂盒

Info

Publication number: CN106568765B
Application number: CN201510658480.5A
Authority: CN
Inventors: 艾峰; 朱斌斌
Original assignee: Shanghai Long Island Biotec Co Ltd
Current assignee: Shanghai Long Island Biotec Co Ltd
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2015-10-12
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2035-10-12
Also published as: CN106568765A

Abstract

本发明涉及一种用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶发色底物液、一种用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶水溶液、一种用于确定样本中抗凝血酶III活性的方法、一种用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒、山梨醇在制备凝血酶发色底物液中的用途以及蔗糖在发色底物法测定抗凝血酶III活性中的用途。用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶发色底物液，含有：凝血酶发色底物；山梨醇；以及水。该凝血酶发色底物液能有效地用于测定抗凝血酶III活性。

Description

用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶发色底物液、凝血酶水溶液、方法以及试剂盒

技术领域

本发明涉及生化检测领域，具体的，本发明涉及用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶发色底物液、凝血酶水溶液、方法以及试剂盒，更具体的，本发明涉及一种用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶发色底物液、一种用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶水溶液、一种用于确定样本中抗凝血酶III活性的方法、一种用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒、山梨醇在制备凝血酶发色底物液中的用途以及蔗糖在发色底物法测定抗凝血酶III活性中的用途。

背景技术

抗凝血酶III(antithrombin III，AT-III)是血浆生理性抑制物中最主要的抗凝物。AT-III抗凝系统是人体内抗凝血系统的重要组成部分，是体内主要的凝血酶抑制物，对其他丝氨酸蛋白酶也有抑制作用。

目前检测AT-III的试剂盒主要采用两类检测方法：免疫比浊法和发色底物法。

发色底物法的检测原理是采用过量的凝血酶与待测样本中的AT-III作用，形成无活性的复合物，发色底物与剩余的反应物反应能够生成产色基团，并且显色的深浅与AT-III活性成相关性，由此可以检测AT-III的活性。此方法灵敏度高，能准确反应AT-III在人体内的正常情况，并且检测方便、适用于各类自动化检测设备。

然而，目前的发色底物法检测抗凝血酶III活性的手段仍有待改进。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

首先，由于凝血酶和发色底物在水溶液中通常不稳定，不能长时间保存，所以通常凝血酶和发色底物是以冻干粉的形式提供的。对于冻干粉，在使用前需要进行复溶，因此，操作麻烦、瓶间差异大，且试剂复溶后质量稳定性差。发明人通过深入研究意外发现，通过在水溶液中采用特定的添加剂，能够有效地提高凝血酶和发色底物在水溶液中的稳定性。

第二，通常待测样本例如血液、血浆中含有肝素辅助因子II(HC II)，然而，肝素辅助因子II在肝素的催化作用下会与凝血酶发生反应，造成假阳性结果，从而干扰抗凝血酶III活性的测定，造成测定结果不能真实反映生物样品中的抗凝血酶III活性，造成了假阳性率升高。另外，发明人在进行研究过程中发现，通常提高凝血酶稳定性和降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰作用是难以同时实现的。发明人通过深入研究意外发现，蔗糖能够降低HC II对凝血酶活性的干扰，并且蔗糖能够单独作用或者与其他添加剂共同作用有效地提高凝血酶在水溶液中的稳定性。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。有鉴于此，本发明提出了能够有效地用于发色底物法测定抗凝血酶III活性的凝血酶发色底物液(在本文中有时也称为“试剂R2”或者“R2试剂”)和凝血酶水溶液(在本文中有时也称为“试剂R1”或者“R1试剂”)。根据本发明的实施例，这些试剂均为液体试剂，可以直接使用、储存有效期长达一年，能够有效解决试剂的稳定性和瓶间差异问题，或者能够有效地降低HC II对抗凝血酶III活性检测的干扰作用。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶发色底物液。根据本发明的实施例，该凝血酶发色底物液含有：凝血酶发色底物；山梨醇；以及水。

根据本发明的实施例，该凝血酶发色底物液中含有山梨醇，能够使得凝血酶发色底物稳定地溶解在水溶液中，从而避免了冻干粉剂所带来的缺陷，并且由于不需要冻干过程，因此生产工艺得到简化，生产设备简单，降低了生产成本。另外，由于凝血酶发色底物是以水溶液的形式提供的，因此，在应用于抗凝血酶III活性测定时，该凝血酶发色底物液属于即开即用型试剂，不需要复溶操作，操作简单，避免了因为复溶操作所用水的质量或者体积差异造成的结果偏差。根据本发明的实施例，发明人发现，该凝血酶发色底物液的稳定性高，瓶间一致性好，在37摄氏度下能够稳定保存15天以上，在2～8摄氏度密封储存条件下能够稳定地保存12个月以上。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶水溶液。根据本发明的实施例，该凝血酶水溶液含有：凝血酶；蔗糖；肝素或其盐；以及pH缓冲剂，其中，所述凝血酶水溶液的pH为7.0～9.0。

根据本发明的实施例，发明人意外地发现，通过在凝血酶水溶液中添加蔗糖，能够有效地降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于确定样本中抗凝血酶III活性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)在存在肝素和蔗糖的条件下，将所述样品与过量的凝血酶混合，以便获得测试混合物；(2)利用凝血酶发色底物，确定所述测试混合物中残留凝血酶的量；以及(3)基于所述残余凝血酶的量，确定所述样本中抗凝血酶III的活性。由于在测试混合物中存在肝素和蔗糖，因此，在利用肝素促进凝血酶与抗凝血酶III反应的同时，采用蔗糖能够能够有效地降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。

在本发明的另一个方面，本发明提出了一种用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括选自下列的至少之一：前面所描述的凝血酶水溶液；和前面所描述的凝血酶发色底物液。由此，利用该试剂盒，能够有效地提高抗凝血酶III活性测定的效率，有效地降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。另外，本领域技术人员能够理解的是，针对凝血酶水溶液和凝血酶发色底物液所描述的特征和优点同样适用该试剂盒，在此不再赘述。

在本发明的又一个方面，本发明提出了山梨醇在制备凝血酶发色底物液中的用途，所述凝血酶发色底物液用于抗凝血酶III测定。根据本发明的实施例，山梨醇可以用于制备凝血酶发色底物液，由于该凝血酶发色底物液中含有山梨醇，能够使得凝血酶发色底物稳定地溶解在水溶液中，从而避免了冻干粉剂所带来的缺陷，并且由于不需要冻干过程，因此生产工艺得到简化，生产设备简单，降低了生产成本。另外，由于凝血酶发色底物是以水溶液的形式提供的，因此，在应用于抗凝血酶III活性测定时，该凝血酶发色底物液属于即开即用型试剂，不需要复溶操作，操作简单，避免了因为复溶操作所用水的质量或者体积差异造成的结果偏差。根据本发明的实施例，发明人发现，该凝血酶发色底物液的稳定性高，瓶间一致性好，在37摄氏度下能够稳定保存15天以上，在2～8摄氏度密封储存条件下能够稳定地保存12个月以上。

在本发明的另一个方面本发明提出了蔗糖在发色底物法测定抗凝血酶III活性中的用途。根据本发明的实施例，发明人意外地发现，通过在抗凝血酶III活性测定中采用蔗糖，能够有效地降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。由此，蔗糖在发色底物法测定抗凝血酶III活性中有效地发挥了抗干扰剂的功能。

附图说明

图1显示了根据本发明一个实施例的线性测试结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行详细描述，需要说明的是，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的实施例，该凝血酶发色底物液中含有山梨醇，能够使得凝血酶发色底物稳定地溶解在水溶液中，从而避免了冻干粉剂所带来的缺陷，并且由于不需要冻干过程，只需要将山梨醇和凝血酶发色底物溶解溶解在水中即可，因此生产工艺得到简化，生产设备简单，降低了生产成本。另外，由于凝血酶发色底物是以水溶液的形式提供的，因此，在应用于抗凝血酶III活性测定时，该凝血酶发色底物液属于即开即用型试剂，不需要复溶操作，操作简单，避免了因为复溶操作所用水的质量或者体积差异造成的结果偏差。根据本发明的实施例，发明人发现，该凝血酶发色底物液的稳定性高，瓶间一致性好，在37摄氏度下能够稳定保存15天以上，在2～8摄氏度密封储存条件下能够稳定地保存12个月以上。

根据本发明的实施例，可以采用的凝血酶发色底物的类型并不受特别限制，只要能够通过与凝血酶反应产生可检测的颜色变化即可。根据本发明的具体实例，可以采用的凝血酶发色底物可以为H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(S-2238)、Bz-Phe-Val-Arg-pNA(S-2160)、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(Chromozym TH)，这些凝血酶发色底物均是市售可得的。由此，可以有效地提高抗凝血酶III活性测定的效率。

根据本发明的实施例，基于1mmol凝血酶发色底物，山梨醇的用量可以为1～16克。另外，根据本发明的具体实例，在凝血酶发色底物液中，凝血酶发色底物的含量为5～50mmol/L，山梨醇的含量为30～80g/L。由此，可以进一步提高凝血酶发色底物液的稳定性。

根据本发明的实施例，可以采用的pH缓冲剂的类型并不受特别限制。根据本发明的具体实例，pH缓冲剂为Tris缓冲体系。发明人发现，通过采用该缓冲体系能够有效地将该凝血酶水溶液的pH维持在预定的范围内。并且，通过采用该缓冲体系，不会对抗凝血酶III活性测定造成不利的影响。

根据本发明的实施例，该凝血酶水溶液中含有10000～15000IU/L凝血酶；和10～30g/L蔗糖。由此，可以进一步增强蔗糖消除肝素辅助因子(HC II)干扰凝血酶活性的能力，同时该浓度范围内的蔗糖，能够有效地结合其他保护剂使得凝血酶稳定地存在于水溶液中。

根据本发明的实施例，肝素可以是以其盐的形式提供的，例如可以为肝素钠。其中，肝素的含量并不受特别限制，根据本发明的实施例，肝素的用量可以为1～10IU/ml。由此，可以有效地促进凝血酶与抗凝血酶III之间的反应。

根据本发明的实施例，本发明的发明人还进一步研究了能够与蔗糖共同作用有效地使凝血酶稳定存在于水溶液中的添加剂。具体的，进一步含有选自氨基酸、明胶、血清白蛋白和聚乙二醇的至少一种。发明人发现，这些添加剂能够与蔗糖匹配共同作为保护剂使得凝血酶稳定地存在于水溶液中。另外，根据本发明的实施例，优选在该凝血酶水溶液中含有氨基酸、明胶、血清白蛋白和聚乙二醇。根据本发明的具体实施例，该凝血酶水溶液含有：10000～15000IU/L凝血酶；10～30g/L蔗糖；10～20g/L氨基酸，所述氨基酸包括甘氨酸和丙氨酸的至少之一；1～10g/L明胶；20～80g/L血清白蛋白；或者0.5～2.0重量％聚乙二醇。根据本发明的具体示例，该凝血酶水溶液含有：10000～15000IU/L凝血酶；10～30g/L蔗糖；10～20g/L氨基酸，所述氨基酸包括甘氨酸和丙氨酸的至少之一；1～10g/L明胶；20～80g/L血清白蛋白；以及0.5～2.0重量％聚乙二醇。

另外，根据本发明的实施例，在该凝血酶水溶液中可以采用的聚乙二醇的分子量可以为2000～20000，由此，可以进一步提高该凝血酶水溶液的稳定性。

另外，根据本发明的实施例，在该凝血酶水溶液中还可以进一步含有其他的添加剂与蔗糖、氨基酸、血清白蛋白(可以为牛血清白蛋白)、聚乙二醇和明胶匹配，并且提高凝血酶水溶液的稳定性和用于检测抗凝血酶III活性时的效率。例如，根据本发明的实施例，还可以进一步包含无机盐，例如30～50g/L的氯化钠或者氯化钾。这些无机盐可以用于调节该凝血酶水溶液的渗透压，从而可以提高该凝血酶水溶液在测定抗凝血酶III活性时的效率。另外，根据本发明的实施例，还可以进一步含有防腐剂，例如0.9g/L的叠氮钠。由此，可以进一步提高该凝血酶水溶液的存储时间。

该凝血酶水溶液的制备方法并不受特别限制，只要最终得到的水溶液中存在预定的组分即可。

根据本发明的具体实例，可以通过下列步骤制备凝血酶水溶液：

首先，将三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、肝素钠、明胶、氨基酸、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇、蔗糖、无机盐、叠氮钠溶解在水中得到凝血酶保护液，调节pH值7.0～9.0。

接下来，取凝血酶冻干粉溶解在所得到的凝血酶保护液中，得到凝血酶水溶液，其中，该凝血酶水溶液中凝血酶的酶活性可以为10000～15000IU/L。

另外，也可以通过下列步骤制备凝血酶水溶液：

首先，取凝血酶冻干粉溶解在凝血酶保护液中得到凝血酶母液；

接下来，将凝血酶母液用凝血酶保护液分别稀释，获得若干稀释度溶液并滴定，根据滴定结果选择预定的稀释度；

根据所得到的稀释度，用凝血酶保护液稀释凝血酶母液，得到最终用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶水溶液。

由于该凝血酶水溶液属于即开即用型试剂，不需要复溶操作，操作简单，不存在因为复溶所用水的质量或者体积差异造成的结果偏差。根据本发明的实施例，发明人发现，该凝血酶水溶液的稳定性高，瓶间一致性好，在37摄氏度下能够稳定保存15天以上，在2～8摄氏度密封储存条件下能够稳定地保存12个月以上。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于确定样本中抗凝血酶III活性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)在存在肝素和蔗糖的条件下，将所述样品与过量的凝血酶混合，以便获得测试混合物；(2)利用凝血酶发色底物，确定所述测试混合物中残留凝血酶的量；以及(3)基于所述残余凝血酶的量，确定所述样本中抗凝血酶III的含量。

根据本发明的实施例，由于在测试混合物中存在肝素和蔗糖，因此，在利用肝素促进凝血酶与抗凝血酶III反应的同时，蔗糖能够有效地降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。

另外，根据本发明的实施例，在所得到的测试混合物中，所述蔗糖的含量为10～30g/L。由此，可以进一步降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。根据本发明的实施例，肝素可以是以其盐的形式提供的，例如可以为肝素钠。其中，肝素的含量并不受特别限制，根据本发明的实施例，肝素的用量可以为1～10IU/ml。由此，可以有效地促进凝血酶与抗凝血酶III之间的反应。

另外，根据本发明的实施例，凝血酶是以前面所述的凝血酶水溶液的形式提供的。根据本发明的实施例，凝血酶发色底物是以前面所述的凝血酶发色底物液的形式提供的。由于这些试剂是水溶液的形式属于即开即用型试剂，不需要复溶操作，操作简单，不存在因为复溶所用水的质量或者体积差异造成的结果偏差。根据本发明的实施例，发明人发现，这些试剂的稳定性高，瓶间一致性好，在37摄氏度下能够稳定保存15天以上，在2～8摄氏度密封储存条件下能够稳定地保存12个月以上。

在本发明的另一个方面，本发明提出了一种用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括选自下列的至少之一：前面所描述的凝血酶水溶液；和前面所描述的凝血酶发色底物液。由此，利用该试剂盒，能够有效地提高抗凝血酶III活性测定的效率。另外，本领域技术人员能够理解的是，针对凝血酶水溶液和凝血酶发色底物液所描述的特征和优点同样适用该试剂盒，在此不再赘述。

在本发明的又一个方面，本发明提出了山梨醇在制备凝血酶发色底物液中的用途，所述凝血酶发色底物液用于抗凝血酶III测定。根据本发明的实施例，山梨醇可以用于制备凝血酶发色底物液，由于该凝血酶发色底物液中含有山梨醇，能够使得凝血酶发色底物稳定地溶解在水溶液中，从而避免了冻干粉剂所带来的缺陷，并且由于不需要冻干过程，因此生产工艺得到简化，生产设备简单，降低了生产成本。另外，由于凝血酶发色底物是以水溶液的形式提供的，因此，在应用于抗凝血酶III活性测定时，该凝血酶发色底物液属于即开即用型试剂，不需要复溶操作，操作简单，不存在因为复溶所用水的质量或者体积差异造成的结果偏差。根据本发明的实施例，发明人发现，该凝血酶发色底物液的稳定性高，瓶间一致性好，在37摄氏度下能够稳定保存15天以上，在2～8摄氏度密封储存条件下能够稳定地保存12个月以上。

在本发明的另一个方面本发明提出了蔗糖在发色底物法测定抗凝血酶III活性中的用途。

根据本发明的实施例，发明人意外地发现，通过在抗凝血酶III活性测定中采用蔗糖，能够有效地降低肝素辅助因子(HC II)对抗凝血酶III活性测定的干扰，从而提高抗凝血酶III活性测定的准确度，降低了抗凝血酶III活性测定的假阳性率。由此，蔗糖在发色底物法测定抗凝血酶III活性中有效地发挥了抗干扰剂的功能。

下面通过具体的实施例，对本发明进行描述。这些实施例仅仅为了说明的目的，而不以任何方式限制本发明。需要说明的是，除非特别说明，在下面的实施例中所采用的试剂和设备均为市售可得的。

一般方法

除非特别说明，在后面的实施例中采用下面的方法制备AT-III测定试剂R1(凝血酶水溶液)、AT-III测定试剂R2(凝血酶发色底物液)，以及对血浆样品进行抗凝血酶III(AT-III)活性测定。

1、制备AT-III测定试剂R1(凝血酶水溶液)

称取预订量的Tris、肝素钠、蔗糖以及可选的组分(叠氮钠、明胶、甘氨酸、丙氨酸、牛血清蛋白BSA、氯化钠、氯化钾、PEG)，用纯净水定容至1升，搅拌充分溶解后用盐酸调节至预定pH值，作为凝血酶保护液。

用水润湿0.45微米三醋酸纤维素，紧贴放在抽滤过滤器砂芯上对所得到的凝血酶保护液进行抽滤除菌，收集滤液得到滤清的凝血酶保护液。

取1支1g规格、130IU/mg的凝血酶冻干品，加入1mL凝血酶保护液，室温10分钟，间隔上下颠倒使其充分溶解，然后转移至装有9mL凝血酶保护液的小烧杯中，混匀得到10mL凝血酶母液。

用凝血酶保护液对凝血酶母液进行稀释，得到凝血酶活性在预定范围内的AT-III活性测定试剂R1，例如1:800～1:1200的比例(即1体积份凝血酶母液与800或者1200体积份凝血酶保护液混合)。

2、制备AT-III活性测定试剂R2(凝血酶发色底物液)

称取预定量的凝血酶发色底物和山梨醇，用纯化水定容至1升，搅拌使其充分溶解，以便得到AT-III测定试剂R2。

3、抗凝血酶III活性测定方法

采用Sysmex CA 1500全自动凝血分析仪，按照制造商所提供的说明书进行抗凝血酶III活性测定，其中，将Sysmex CA 1500全自动凝血分析仪样品处理参数设置为：

将15微升血浆样品与105微升水混合，并从所得到的混合物中取20微升与150微升试剂R1(凝血酶水溶液)和25微升试剂R2(凝血酶发色底物液)混合。

实施例1制备AT-III活性测定试剂R1(凝血酶水溶液)

按照一般方法的步骤，以及按照下表中所列出的组分和终浓度，制备AT-III活性测定试剂凝血酶水溶液R1-1、R1-2、R1-3、R1-4、R1-5、R1-6、R1-7以及R1-8，其中，R1-8作为对照品。

表1试剂R1的组成

实施例2制备AT-III测定试剂R2(凝血酶发色底物液)

按照一般方法的步骤，以及按照下表中所列出的组分和终浓度，制备AT-III活性测定试剂凝血酶发色底物液R2-1、R2-2、R2-3、R2-4、R2-5、R2-6、R2-7和R2-8，其中，R2-8作为对照品。

表2试剂R2的组成

实施例3抗凝血酶III(AT-III)测定试剂的性能检测

在后面的实施例中，按照列组合，将实施例1中制备的试剂R1和试剂R2组合，按照一般方法中所描述的步骤，测定抗凝血酶III活性，其中，组合11～14作为对照：

表3试剂组合

1、准确度检测

采用组合1～10，按照一般方法中描述的步骤(区别在于利用已知浓度的标准品替换血浆样品)，测定国际标准物质WHO International Standard NIBSC code：08/258的抗凝血酶III活性，结果发现组合1～10的相对偏差较低，其中，检测结果总结在下表4中。检测结果证明组合1～10具有很好的准确性。

表4准确度测试结果

项目	组合1	组合2	组合3	组合4	组合5	组合6	组合7	组合8	组合9	组合10
											测定值1	97.3	94.7	96.7	95.8	93.2	94.5	96.8	97.2	95.7	96.3
测定值2	96.7	93.6	96.1	94.3	93.1	97.3	96.4	96.8	96.1	96.8
											测定值3	97.3	93.7	95.8	96.2	94.6	96.5	96.1	96.1	96.7	95.4
均值	97.1	94.0	96.2	95.4	93.6	96.1	96.4	96.7	96.2	96.2
											靶值	95	95	95	95	95	95	95	95	95	95
相对偏差	2.2％	-1.1％	1.2％	0.5％	-1.5％	1.1％	1.5％	1.8％	1.2％	1.2％

2、线性范围测试

采用组合1～10，按照一般方法中描述的步骤，区别在于用接近线性范围上限的高活性样品和接近线性范围下限的低活性样品，按0/5，1/5，2/5，3/5，4/5，5/5(原倍)稀释，以每个浓度水平的溶液替换血浆样品作为测定样本，其中，每种组合各测定两次，取测定结果平均值，以测定结果平均值为纵坐标，理论值为横坐标，计算线性回归值(图1显示了组合2的线性关系图)，发现组合1～10均具有接近1的相关系数。说明组合1～10在测试范围0-150％内均具有较好的线性关系。其中，具体结果总结在下表5中。

表5线性范围测试结果

综上所述，本发明的试剂准确性相对偏差较低，线性范围为0～150％，满足检测抗凝血酶III活性的要求。

实施例4瓶间一致性检测：

采用组合2，按试剂R1:8*4ml试剂试剂R2:2*2ml每支分装于7mL洁净玻璃瓶中，加盖密封，随机抽取5对(命名为瓶1～5)，按照一般方法中所描述的步骤，分别对AT-III质控品水平1、质控品水平2和新鲜正常血浆、异常血浆各1例样本进行检测，结果总结在下表6中。

表6一致性测试结果

上述结果显示5瓶试剂测试各样本的一致性很好，瓶间差异最大为2.0％。

实施例5对肝素辅助因子II的抗干扰研究

将血浆样本分别与干扰物质，80U/ml的肝素辅助因子II(HCII)(采购自HYPHENBioMed)，按如下表所示的比例混合(具体浓度及混合方法见下表7)：

表7含有HCII干扰物质的血浆样品

采用组合2、阴性对照(与组合2基本相同，区别在于在试剂R1中不采用蔗糖)以及SIEMENS公司生产的冻干粉型抗凝血酶III(AT-III)测定试剂盒(发色底物法)，按照一般方法中所描述的步骤，分别对表7中所列出的含有HCII干扰物质的血浆样品进行抗凝血酶活性检测，其中，分别求出测定结果的均值作为实测值，以实测值除以理论值得回收率。抗干扰测试结果表明，组合2在HCII浓度在4U/ml以下时，本试剂具有很好的抗干扰效果，明显优于组合13SIEMENS公司生产的冻干粉型抗凝血酶III(AT-III)测定试剂盒(发色底物法)。具体结果总结在下表8中：

表8抗HCII干扰检测结果(单位：％)

HCII浓度(U/ml)	0	0.5	1	2	4
						SIEMENS试剂实测值	80.9	80.5	80.9	83.5	88.6
相对偏差	0.0％	-0.5％	0.0％	3.2％	9.5％
						组合2实测值	81.0	80.6	80.2	81.4	81.9
相对偏差	0.0％	-0.5％	-1.0％	0.5％	1.1％
						阴性对照实测值	80.5	80.6	82.3	84.4	89.3
相对偏差	0.0％	0.1％	2.2％	4.8％	10.9％

实施例6热稳定性检测

在本实施例中，采用组合4～7和作为对照的组合11～13进行37℃热稳定性准确度检测。具体步骤如下：

采用组合4～7和作为对照的组合11～13进行平行试验，按R1:8*4ml试剂R2:2*2ml每支分装于7mL洁净玻璃瓶中，加盖密封，各30支置37℃烘箱中进行热破坏，每天各取一支对国际标准物质WHO International Standard NIBSC code：08/258按照前面所描述的方法进行进行准确度检测，并在第一天和最后一天进行线性范围检测，检测方法如前所述。结果如下表9和表10：

表9 37℃热稳定性准确度检测结果(单位：％)

表10 37℃热稳定性线性范围检测结果(单位：％)

上表结果显示，在37℃热破坏15天后，组合4～7对样本的检测结果准确性最大偏差只有3.4％，线性范围0～150％，相关性大于0.99，说明试剂在37℃高温下可以稳定15天以上。

实施例7长期稳定性检测

在本实施例中，采用组合10和组合13(对照)进行长期稳定性检测。具体步骤如下：

按R1:8*4ml试剂R2:2*2ml每支分装于7mL洁净玻璃瓶中，加盖密封，各30支置2～8℃冰箱中进行储存，每天各取一支对国际标准物质WHO International Standard NIBSCcode：08/258(按照靶值95％，进行准确度检测，并在第一月和最后一月进行线性范围检测，检测方法如前所述。结果总结在下表11和表12中：

表11长期稳定性准确度检测结果(单位：％)

结果显示组合13在第三月最大相对偏差已达到-22.9％，故停止后续实验。

表12AT-III检测试剂长期稳定性线性范围检测结果(单位：％)

结果显示组合13在第3个月时，比对试剂线性已缩短为0-120％，故停止后续实验。

上表结果显示，在2～8℃储存12个月后，本发明中的组合10对样本的检测结果最大偏差为2.1％，线性范围0-150％，相关性大于0.99，说明试剂在2～8℃下可以稳定12个月以上。

结论

蔗糖能够提高凝血酶对HCII的抗干扰能力，同时结合其他保护剂能保护凝血酶在液体试剂中的稳定性。山梨醇可以很好地保持发色底物在液体试剂中的稳定性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种用于抗凝血酶III活性测定的凝血酶水溶液，其特征在于，含有：

凝血酶；

蔗糖；

肝素或其盐；以及

pH缓冲剂，其中，所述凝血酶水溶液的pH为7.0～9.0，所述蔗糖浓度为10～30g/L，

还含有无机盐。

2.根据权利要求1所述的凝血酶水溶液，其特征在于，所述pH缓冲剂为Tris。

3.根据权利要求1所述的凝血酶水溶液，其特征在于，含有：

10000～15000IU/L凝血酶。

4.根据权利要求1所述的凝血酶水溶液，其特征在于，进一步含有选自氨基酸、明胶、血清白蛋白和聚乙二醇的至少一种。

5.根据权利要求4所述的凝血酶水溶液，其特征在于，所述凝血酶水溶液含有：

10000～15000IU/L凝血酶；

10～30g/L蔗糖；

10～20g/L氨基酸，所述氨基酸包括甘氨酸和丙氨酸的至少之一；

1～10g/L明胶；

20～80g/L血清白蛋白，或者

0.5～2.0重量％聚乙二醇。

6.根据权利要求1所述的凝血酶水溶液，其特征在于，含有30～50g/L的氯化钠或者氯化钾。

7.一种用于抗凝血酶III活性测定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～6任一项所述的凝血酶水溶液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：凝血酶发色底物液，所述凝血酶发色底物液含有：

凝血酶发色底物；

山梨醇；以及

水。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶发色底物液在37摄氏度下稳定保存至少15天。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶发色底物液在2～8摄氏度下密封稳定保存至少12个月。

11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶发色底物为选自S2238、S-2160和Chromozym TH的至少一种。

12.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，基于1mmol所述凝血酶发色底物，所述山梨醇的用量为1～16克。

13.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶发色底物的含量为5～50mmol/L，所述山梨醇的含量为30～80g/L。

14.一种用于确定样本中抗凝血酶III活性的方法，其特征在于，包括：

(1)将所述样本与过量的凝血酶混合，以便获得测试混合物，所述凝血酶是以权利要求1～6任一项所述的凝血酶水溶液的形式提供的；

(2)利用凝血酶发色底物，确定所述测试混合物中残留凝血酶的量，所述凝血酶发色底物是以凝血酶发色底物液的形式提供的；以及

(3)基于所述残留凝血酶的量，确定所述样本中抗凝血酶III的活性。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述凝血酶发色底物液含有：

凝血酶发色底物；

山梨醇；以及

水。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述凝血酶发色底物液在37摄氏度下稳定保存至少15天。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述凝血酶发色底物液在2～8摄氏度下密封稳定保存至少12个月。

18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述凝血酶发色底物为选自S2238、S-2160和Chromozym TH的至少一种。

19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，基于1mmol所述凝血酶发色底物，所述山梨醇的用量为1～16克。

20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述凝血酶发色底物的含量为5～50mmol/L，所述山梨醇的含量为30～80g/L。