CN103091306B - 一种纳米磁微粒的封闭保存液 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种纳米磁微粒的封闭保存液，以水为溶剂，每1L所述封闭保存液含有：Tris 0.01mol；牛γ球蛋白0.5-5g；鱼皮凝胶1-10g；新生牛血清1-10mL；吐温型乳化剂0.2-5g；硫酸新霉素0.01-0.5g。相较于现有技术，采用本发明提供的纳米磁微粒的封闭保存液用于封闭保存包被有抗原或抗体的纳米磁微粒，能够有效减少纳米磁微粒在免疫反应过程中的非特异性吸附，提高了纳米磁微粒化学发光测定试剂的灵敏度。

Description

一种纳米磁微粒的封闭保存液

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳米磁微粒的封闭保存液。

背景技术

磁性分离技术是以纳米或微粒级的磁性微粒为载体，利用结合于磁性微粒表面的蛋白质所提供的特异的亲和特性，在加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗、解吸操作，可以进一步从复杂的生物体系中分离到目标物分子，具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。应用于磁性分离技术的磁性载体应具备以下特点：①粒径比较小，比表面积较大，具有较大的吸附容量；②物理和化学性能稳定，有较高机械强度，使用寿命长；③含有可活化的反应基团，以用于亲和配基的固定化；④粒径均一，能形成单分散体系；⑤悬浮性好，便于反应的有效进行。

纳米技术的出现，促进了磁性微粒的应用。纳米磁微粒粒径小，加至反应液中呈悬浮状态，加磁场后可迅速分离。纳米磁微粒还可通过免疫反应与标记有荧光素、化学发光物质、酶等物质连接，建立各种免疫分析方法。

纳米磁微粒化学发光免疫诊断试剂综合采用了目前国际上的两大主流免疫分析尖端技术——悬浮纳米磁微粒载体技术、化学发光检测技术，能够准确定量的检测人类血清中的免疫抗原或抗体，可用于过敏、自身免疫、甲状腺功能、肿瘤、性激素、传染病等相关标志物的检测。然而，包被了抗原或抗体的纳米磁微粒在反应过程中会导致非特异性吸附，导致纳米磁微粒应用到试剂中，试剂的灵敏度降低，因此，保证纳米磁微粒的稳定性成为该平台发展的关键技术之一。

因此，实有必要开发一种纳米磁微粒的封闭保存液，以确保纳米磁微粒的稳定性，避免纳米磁微粒包被抗原或抗体后在保存过程中产生非特异性吸附而导致试剂的灵敏度降低的缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种纳米磁微粒的封闭保存液，以避免纳米磁微粒包被抗原或抗体后在保存过程中产生非特异性吸附而导致试剂的灵敏度降低的缺陷。

为了达到上述目的，本发明提供一种纳米磁微粒的封闭保存液，其特征在于：以水为溶剂，每1L所述封闭保存液含有：

Tris            0.01mol；

牛γ球蛋白      0.5-5g；

鱼皮凝胶        1-10g；

新生牛血清      1-10mL；

吐温型乳化剂    0.2-5g；

硫酸新霉素      0.01-0.5g。

较佳地，所述的Tris（三羟甲基氨基甲烷）的pH为7-9。最佳地，所述

Tris的pH为8.0。

较佳地，所述的吐温型乳化剂为吐温-20（TWEEN-2 0）。

相较于现有技术，采用本发明提供的纳米磁微粒的封闭保存液用于封闭保

存包被有抗原或抗体的纳米磁微粒，能够有效减少纳米磁微粒在免疫反应过程

中的非特异性吸附，提高了纳米磁微粒化学发光测定试剂的灵敏度。

附图说明

图1为本发明实施例一中CEA试剂的灵敏度评价拟合曲线。

图2为本发明实施例二中CEA试剂的灵敏度评价拟合曲线。

图3为本发明实施例三中CEA试剂的灵敏度评价拟合曲线。

具体实施方式

在以下实施例中，以癌胚抗原单克隆抗体包被的纳米磁微粒化学发光测试试剂（CEA试剂）为例对“O”浓度的待测血清样本进行检测，CEA试剂中的纳米磁微粒采用本发明提供的封闭保存液封闭保存，然后采用化学发光免疫分析仪通过计算和拟合曲线测定灵敏度。

以下实施例中除特别说明外，Tris、牛γ球蛋白、鱼皮凝胶、新生牛血清、Tween-20及硫酸新霉素均为市售获得。所述的封闭保存液通过常规混合溶液的制备方法调制。

实施例一

材料与仪器：

癌胚抗原单克隆抗体包被的纳米磁微粒化学发光测试试剂（CEA试剂），所述试剂中的纳米磁微粒的悬浮液为包被有FITC（异硫氰酸荧光素）抗体的纳米磁微粒（即CEA纳米磁微粒）的悬浮液；Maglia60化学发光免疫分析仪，市售。

其中，所述的CEA试剂包括：

该CEA试剂包括含有荧光素标记的CEA抗体的溶液（简称第一试剂）和包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液（简称磁分离试剂），碱性磷酸酶（ALP）标记的CEA抗体的溶液（简称第二试剂）。

所述的CEA试剂通过以下方法制备得到：

第一试剂的制备

（1）材料与仪器：以磷酸盐缓冲液保存的CEA抗体（纯度超过95wt%，浓度为1mg/ml）；异硫氰酸荧光素（FITC），碳酸氢钠等试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱采购自GE公司。

（2）制备步骤：

①用0.2mol/L pH9.0的碳酸盐缓冲液配制0.5mg/ml的FITC溶液；

②按照CEA抗体与FITC分子比为1:20的比例在抗体溶液中加入步骤①所配FITC溶液，混合均匀，室温静置12h小时，反应生成CEA抗体-FITC连接物；

③将经过步骤②的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的FITC，得到含有CEA抗体-FITC连接物（即FITC标记的CEA抗体）的溶液；

④将步骤③所得含有CEA抗体-FITC连接物的溶液用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）pH8.0的0.1mol/L的Tris缓冲液稀释到CEA抗体-FITC连接物浓度为1μg/ml，pH为8，即为第一试剂。

第二试剂的制备

（1）材料与仪器：以磷酸盐缓冲液保存的CEA单克隆抗体（纯度超过95wt%，浓度为1mg/ml，下称CEA抗体溶液）；以磷酸缓冲液保存的碱性磷酸酶（ALP溶液，ALP纯度为约99%，比活性为约1500U/mg，浓度为10mg/ml）；5mg/ml SMCC（4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）溶液、10mg/ml2-IT（2-亚氨基硫烷盐酸盐）溶液(交联剂SMCC和2-IT为固体粉末，用DMF（二甲基甲酰胺）配成上述溶液使用；SMCC、2-IT购自THERMO公司）；Tris等化学试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱、AKTA-purifier100蛋白纯化仪和Supperdex200凝胶纯化柱均为GE公司产品。

（2）制备步骤：

①取1mg CEA抗体溶液，加入10mg/ml的2-IT溶液2~4μl，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μl，室温静置5min；用G-25凝胶柱除盐，收集活化的抗体，2-8℃保存备用；

②取1.5mg ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液20μl，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化的ALP抗体，2-8℃保存备用；

③将上述活化的CEA抗体与活化的ALP抗体混合，2-8℃条件下静置15h，通过Supperdex200凝胶纯化柱进行纯化，获得含有抗体CEA-ALP连接物（ALP标记的CEA抗体）的溶液，2-8℃保存备用；

④将抗体CEA-ALP连接物的溶液用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）pH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到1μg/ml，pH8，即为第二试剂。

磁分离试剂的制备

（1）材料与仪器：

磁微粒的悬浮液：磁微粒含量5wt%，磁微粒含羧基（COOH）活性集团，每克（g）磁微粒（干重）羧基含量0.7毫摩尔（mmol），具有超顺磁性，直径在1μm；

抗FITC抗体：多克隆抗体，纯度为90wt%以上，稀释效价超过1:100万；

2-吗啉乙磺酸（MES）、碳二亚胺（EDC）、Tris和其他试剂应达到化学纯。

（2）制备步骤：

①取100mg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用0.05mol/L,pH4.5MES缓冲液10ml重悬；

②加入4mg的抗FITC抗体，室温混悬60min；

③加入0.5ml新鲜配制的10mg/ml的EDC水溶液，室温混悬2h；

④磁分离，去上清，用封闭保存液将磁微粒重悬为10mg/ml，2-8℃保存24小时；

⑤用含0.5%牛血清白蛋白（BSA）pH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到1mg/ml，pH8.0，即为磁分离试剂。

以前述方法制备得到的CEA试剂为例，该试剂中的CEA纳米磁微粒用下面的封闭保存液进行封闭保存，并使用Maglia60化学发光免疫分析仪测定试剂的灵敏度。

本实施例中CEA纳米磁微粒的封闭保存液为：以水为溶剂，每1L所述封闭保存液含有：

Tris             0.01mol pH8.0；

牛γ球蛋白       0.5g；

鱼皮凝胶         1g；

新生牛血清       1mL；

TWEEN-20         0.2g；

硫酸新霉素       0.01g。

采用该CEA试剂检测“0”浓度血清样本，检测步骤为：

灵敏度评价

检测“0”浓度血清样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU）的平均值（M）和标准差（SD），并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。由于采用本实施例的封闭保存液封闭保存所述CEA纳米磁微粒，本实施例中CEA试剂的灵敏度远高于行业标准（YY/T1160-2009癌胚抗原(CEA)定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)）的1ng/mL。其中：A点发光值参见表1。

表1

A点发光均值X=845；

SD=74；

X+2SD=993。

B点发光值参见表2。

B点发光均值X=10621。

B点浓度4ng/mL。

表2

CEA-STD-B(RLU)
	10256
10986

A,B点连点拟合曲线参见图1。灵敏度=0.06ng/mL。

实施例二

本实施例中所采用的CEA试剂与实施例一相同，区别在于将CEA试剂中的CEA纳米磁微粒用下面的封闭保存液进行封闭保存，并使用Maglia60化学发光免疫分析仪测定试剂的灵敏度。本实施例中采用CEA试剂检测“0”浓度血清样本的检测步骤也与实施例一相同。

本实施例中CEA纳米磁微粒的封闭保存液为：以水为溶剂，每1L所述封闭保存液含有：

Tris                0.01mol pH8.0；

牛γ球蛋白          2.5g；

鱼皮凝胶            5g；

新生牛血清          5mL；

TWEEN-20            2.5g；

硫酸新霉素          0.25g。

灵敏度评价

检测“0”浓度血清样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU）的平均值（M）和标准差（SD），并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。由于采用本实施例的封闭保存液封闭保存所述CEA纳米磁微粒，本实施例中CEA试剂的灵敏度远高于行业标准（YY/T1160-2009癌胚抗原(CEA)定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)）的1ng/mL。其中：A点发光值参见表3。

表3

A点发光均值X=875；

SD=65；

X+2SD=1006。

B点发光值参见表4。

B点发光均值X=10117。

B点浓度4ng/mL。

表4

CEA-STD-B(RLU)
	9968
10265

A,B点连点拟合曲线参见图2。灵敏度=0.057ng/mL。

实施例三

本实施例中所采用的CEA试剂与实施例一相同，区别在于将CEA试剂中的CEA纳米磁微粒用下面的封闭保存液进行封闭保存，并使用Maglia60化学发光免疫分析仪测定试剂的灵敏度。本实施例中采用CEA试剂检测“0”浓度血清样本的检测步骤也与实施例一相同。

本实施例中CEA纳米磁微粒的封闭保存液为：以水为溶剂，每1L所述封闭保存液含有：

Tris             0.01mol pH8.0；

牛γ球蛋白       5g；

鱼皮凝胶         10g；

新生牛血清       10mL；

TWEEN-20         5g；

硫酸新霉素       0.5g。

灵敏度评价

检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU）的平均值（M）和标准差（SD），并计算M+2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。由于采用本实施例的封闭保存液封闭保存所述CEA纳米磁微粒，本实施例中CEA试剂的灵敏度远高于行业标准（YY/T1160-2009癌胚抗原(CEA)定量测定试剂(盒)(化学发光免疫分析法)）的1ng/mL。其中：A点发光值参见表5。

表5

A点发光均值X=944；

SD=140；

X+2SD=1224。

B点发光值参见表6。

B点发光均值X=11482。

B点浓度4ng/mL。

表6

CEA-STD-B(RLU)
	11265
11698

A,B点连点拟合曲线参见图3。灵敏度=0.106ng/mL。

从以上实施例可见，本发明的封闭保存液用于封闭保存包被有抗体或抗原的纳米磁微粒在保存中具有较好的稳定性，将其应用到试剂中非特异性吸附较少，提高了试剂的灵敏度。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种纳米磁微粒的封闭保存液，其特征在于：以水为溶剂，每1L所述封闭保存液含有：

Tris         0.01mol；

牛γ球蛋白    0.5-5g；

鱼皮凝胶      1-10g；

新生牛血清    1-10mL；

吐温型乳化剂  0.2-5 g；

硫酸新霉素    0.01-0.5g；

所述的Tris的pH为8.0；

所述的吐温型乳化剂为吐温-20。