CN109521003A

CN109521003A - 一种抗缪勒管激素磁微粒化学发光检测试剂盒

Info

Publication number: CN109521003A
Application number: CN201811391709.3A
Authority: CN
Inventors: 赵丽娜
Original assignee: Beijing Leadman Biochemistry Co Ltd
Current assignee: Beijing Leadman Biochemistry Co Ltd
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-03-26

Abstract

本发明公开了一种测定人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，试剂盒包括：抗缪勒氏管激素R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；抗缪勒氏管激素R1试剂是异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体稀释液，抗缪勒氏管激素R2试剂是碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗体稀释液，磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒稀释液，抗缪勒氏管激素校准品液是由合成的抗缪勒氏管激素和缓冲液组成，发光底物液是碱性磷酸酶催化的含二氧杂环乙烷的Tris‑HCl缓冲液。本发明极大地提高了免疫反应的信号强度和灵敏度，使低含量物质在进行免疫结合时也能产生很强的化学发光信号，为抗缪勒氏管激素的检测提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。

Description

一种抗缪勒管激素磁微粒化学发光检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医用诊断试剂领域，特别是涉及一种采用磁微粒化学发光技术和抗体结合技术检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光检测试剂盒及其制造方法。

背景技术

抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)是转化生长因子β超家族的成员之一，由Professor Alfred Jost于1974年首先发现。AMH是由两个相同的72KD亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，相对分子质量为140KD；人类AMH编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。

抗缪勒氏管激素AMH在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。在男性AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿的发育过程中，AMH导致缪勒氏管退化，形成正常发育的男性生殖管道。在女性AMH主要由卵巢颗粒细胞产生，血清AMH保持相对于男性较低的一个水平，从青春期开始，血清AMH水平随时间慢慢降低，并在更年期降低到ELISA法检测不到的水平。

AMH的表达合成受控于男性胎儿以及出生后睾丸内的赛尔托利细胞，和出生后女性卵巢内的颗粒细胞。在男性胚胎发育的过程中，塞尔托利细胞分泌的AMH引发苗勒氏管的不可逆退化。而女性胚胎发育早期不存在AMH，因此苗勒氏管得以继续发育，分化成为子宫、输卵管和阴道上部。男性出生以后，AMH在围产期会有短暂的下降，之后维持一个稳定的高水平直到青春期。青春期开始男性的AMH水平下降，标志着赛尔托利细胞的成熟。成年男性的AMH维持在较低水平。女性出生时的AMH水平很低，之后逐渐上升，青春期到达峰值，然后随着年龄的增长而下降。绝经后的AMH降低到极低的水平。女性的AMH主要由窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌，抑制卵泡的募集并降低卵泡对卵泡刺激素(FSH)的敏感性，从而抑制优势卵泡的形成，防止原始卵泡池的过快消耗。由此可见，女性的AMH水平反应了卵巢功能的储备。

综上所述，AMH对于男性性分化和女性卵泡发育都非常关键，血清中AMH浓度的检测为女性及男性生殖状态提供了非常重要的指标。可能导致AMH浓度偏高的因素有：男孩青春期延迟、非促性腺激素依赖的男性性早熟、睾酮中毒症、某些睾酮合成缺陷、双性儿童的睾丸发育不全或卵巢睾丸并存、Sertoli-Leydig氏细胞瘤、颗粒细胞瘤等。可能导致AMH浓度偏低的因素有：隐睾症、无睾症、某些性早熟、睾丸发育不全、过早绝经等。

临床上，血清AMH水平的检测可用于卵巢功能储备的评估、控制性超排卵(COH)效果的预测、卵巢过度刺激(OHSS)的预测、多囊卵巢综合征的诊断和预后、卵巢颗粒细胞瘤的诊断和管理、男性性早熟和青春期延迟的诊断和鉴别诊断、男童的隐睾症和无睾症的诊断和儿童双性状态的鉴别诊断。

目前已知的抗缪勒氏管激素(AMH)检测方法主要有RIA(radioimmunoassay放射免疫测定法)法、均相酶免疫检测法、酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法(GC-MS)。但是，这些方法都存在一定的缺陷，RIA法污染大、ELISA法自动化程度低且操作复杂繁琐，高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法不适合广泛用于临床检测。

因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的抗缪勒氏管激素(AMH)检测试剂盒和使用方法。

发明内容

本发明旨在开发一种灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好并且成本低廉的一种测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。

基于上述目的，本发明提供一种测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；R1试剂为抗异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体稀释液，R2试剂为碱性磷酸酶(ALP)标记的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体稀释液，磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体包被的磁微粒稀释剂，校准品液系列为含有不同浓度抗缪勒氏管激素(AMH)抗体的稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液。

另一方案，所述R1试剂即异硫氰酸荧光素标记的抗抗缪勒氏管激素(AMH)多克隆抗体稀释液是浓度为1.0～3.0μg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体经缓冲液稀释配成。

另一方案，所述R1试剂缓冲液pH值为6.7～7.6，缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.01～0.06mol/L；其余为去离子水。

另一方案，所述R1试剂即异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体稀释液是浓度为1.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体经缓冲液稀释配成。

另一方案，所述R1试剂缓冲液pH值为7.0，缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05mol/L；其余为去离子水。

另一方案，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗体稀释液是由浓度为1.0～3.0μg/mL碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗原经缓冲液稀释而成。

另一方案，所述R2试剂缓冲液为pH值为6.7～7.6，缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.01～0.06mol/L；其余为去离子水。

另一方案，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体稀释液是由浓度为1.5μg/mL碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体经缓冲液稀释而成。

另一方案，所述R2试剂缓冲液为pH值为6.8，缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05mol/L；其余为去离子水。

另一方案，所述磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒悬浮于缓冲液配制成浓度为0.5～2mg/mL的磁微粒溶液。

另一方案，所述磁分离试剂缓冲液为pH值为7.5～9.0，缓冲液组分为包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05～0.2mol/L；其余为去离子水。

另一方案，所述磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒悬浮于缓冲液配制成浓度为1.0mg/mL的磁微粒溶液。

另一方案，所述磁分离试剂缓冲液为pH值为8.0，缓冲液组分为包括叠氮钠，浓度为0.989g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.025mol/L；其余为去离子水。

另一方案，所述校准品液系列为含有不同浓度抗缪勒氏管激素(AMH)抗原的稀释液。

另一方案，所述校准品液系列的缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.005～0.03mol/L；其余为去离子水。

另一方案，所述校准品液系列，浓度范围为0～30ng/mL，缓冲液pH值为7.6。

另一方案，所述校准品液系列的不同浓度为0ng/ml、0.2ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、30ng/ml。

另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度0.1～0.3M的碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，pH值为8～10的摩尔浓度0.2M的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。

另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度为0.2M，pH值为9.3的摩尔浓度0.2M的Tris-HCl缓冲液，并含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。

一种测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

配制试剂R1：1)按照试剂R1缓冲液组分含量配制缓冲液，调节pH；2)制备异硫氰酸荧光素标记的抗抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体；3)将异硫氰酸荧光素标记的抗抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体用R1缓冲液进行稀释。

配制试剂R2：1)按照试剂R2缓冲液组分含量配制缓冲液，调节pH；2)制备碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体；3)将碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体用R2缓冲液进行稀释。

配制磁微粒：1)按照磁微粒缓冲液组分含量配制缓冲液；2)制备抗异硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒；3)将磁微粒用Tris-HCl缓冲液进行稀释。

配制校准品：1)按照校准品缓冲液组分含量配制磷酸盐缓冲液；2)将抗缪勒氏管激素(AMH)抗体溶解于校准品缓冲液中配置成不同的浓度。

配制化学发光底物液：1)配制0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，并添加0.3mg/mL的二氧杂环乙烷；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于缓冲液中。

一种测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒使用方法包括如下步骤：

(1)将待测样本或校准品、试剂R1、试剂R2 37℃混合温育15min；

(2)将磁微粒加入上述反应体系后于37℃继续温育5min；

(3)洗涤，去除未结合的抗体和杂质后加入发光底物；

(4)加入发光底物，ALP催化底物发光后测定相对发光强度(RLU)；

在一定范围内RLΜ与抗缪勒氏管激素(AMH)抗体浓度呈反比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的抗缪勒氏管激素(AMH)含量。

采用本发明上述检测试剂盒测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量时的方法学鉴定数据可达到如下指标：

灵敏度－最小检出量为0.004ng/ml；

抗缪勒氏管激素(AMH)线性检测范围，0～30ng/ml；

精密度－分析内精密度平均为1.86％(n＝10)，分析间精密度平均为2.89％(n＝30)，精密度远低于国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；

交叉反应－配制一定浓度的交叉反应物作为样本用试剂盒进行检测，检测结果与样本配制浓度的比值(％)即为对该样本的交叉反应率，实验结果均＜1.0％；

抗干扰－干扰物存在测得值与干扰物不存在测得值的偏差≤15％。

稳定性—校准品放入37℃温箱7天，准确度符合要求，校准品降幅小于10％，试剂盒降幅小于50％。

上述步骤表明，本发明采用的竞争法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，定量检测人血清或血浆样品中的抗缪勒氏管激素(AMH)含量，确保了检测的灵敏度，由于实验采用竞争法不存在HOOK效应，无污染、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，便于临床试剂应用。本发明为临床检测人血清中的抗缪勒氏管激素(AMH)提供了一种更准确、精确、方便、快捷和简单的方法。

附图说明

图1为本发明实施例2的线性实验的理论浓度与测试浓度的线性相关图；

图2为本发明实施例2的比对某知名厂家试剂的测试结果比较图。

具体实施方式

测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的组成

一种测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒包括R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液。

R1试剂包括：1)R1抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体，浓度为1.0～3.0μg/mL；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.01～0.06mol/L；其余为去离子水。R1试剂的缓冲液pH值为6.7～7.6。

R2试剂包括：1)R2抗体：碱性磷酸酶(ALP)标记的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体，浓度为1.0～3.0μg/mL；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.01～0.06mol/L；其余为去离子水。R1试剂的缓冲液pH值为6.7～7.6。

磁分离试剂包括：1)磁微粒：抗异硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒，浓度为0.5～2mg/ml；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05～0.2mol/L；其余为去离子水。磁分离试剂的缓冲液pH值为7.5～9.0。

校准品液系列包括：1)抗缪勒氏管激素(AMH)抗原；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.005～0.03mol/L；其余为去离子水。校准品液系列的缓冲液pH值为7.6。AMH抗原和缓冲液配制成为含有不同浓度(0.00，0.20，1.00，5.00，10.00，30.00ng/ml)的校准品液系列。

底物液为摩尔浓度0.05～0.1M碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液中二氧杂环乙烷化合物(APCL)的浓度为0.02～0.04mg/mL，缓冲液为摩尔浓度为0.02M的Tris-HCl，pH值为8～10。

配制试剂R1：1)按照试剂R1缓冲液组分含量配制缓冲液，调节pH；2)制备异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体；3)将异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体用R1缓冲液进行稀释。

配制磁分离试剂：1)按照磁微粒缓冲液组分含量配制缓冲液；2)制备抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒；3)将磁微粒用缓冲液进行稀释。

配制校准品液系列：1)按照校准品缓冲液组分含量配制缓冲液；2)将不同浓度的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体分别溶解于校准品缓冲液中配置成不同浓度的校准品液。

配制化学发光底物液：1)配制Tris-HCl缓冲液，并添加二氧杂环乙烷化合物(APCL)；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于缓冲液中。

人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的测定方法和绘制标准曲线

(1)首先，将50μl的校准品系列(浓度分别为0.00，0.20，1.00，5.00，10.00，30.00ng/ml)分别与50μl试剂R1、50μl试剂R2依次加入反应管中，37℃条件下混合温育15min；

(2)将上述试剂系列分别再与25μl磁分离试剂结合后于37℃继续温育5min；

(3)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；

(4)加入发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)，获得抗缪勒氏管激素(AMH)浓度-发光值系列数值。

(5)根据抗缪勒氏管激素(AMH)浓度-发光值系列数值进行拟合，获得抗缪勒氏管激素(AMH)浓度-发光值标准曲线。

(6)根据拟合的抗缪勒氏管激素(AMH)浓度-发光值标准曲线计算测定待测样本的浓度值。

在一定范围内RLU与抗缪勒氏管激素(AMH)抗体浓度呈反比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的抗缪勒氏管激素(AMH)含量。

实施例1一种测定人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒包括R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和底物液。

本实施例中，R1试剂包括：1)R1抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗缪勒氏管激素(AMH)单克隆抗体，浓度为1.0～3.0μg/mL；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.989g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05mol/L；其余为去离子水。R1试剂的缓冲液pH值优选为7.0。

本实施例中，R2试剂包括：1)R2抗体：碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素(AMH)抗体，浓度为1.5μg/ml；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.989g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05mol/L；其余为去离子水。R2试剂的缓冲液pH值为6.8。

本实施例中，磁分离试剂包括：1)磁微粒：抗异硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒，浓度为1.0mg/ml；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.989g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05mol/L；其余为去离子水。磁分离试剂的缓冲液pH值为8.0。

本实施例中，校准品液系列包括：1)抗缪勒氏管激素(AMH)抗原；2)缓冲液：包括叠氮钠，浓度为0.989g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.025mol/L；其余为去离子水。校准品液系列的缓冲液pH值为7.6。AMH抗原和缓冲液配制成为含有不同浓度(0.00，0.20，1.00，5.00，10.00，30.00ng/ml)的校准品液系列。

本实施例中，底物液为碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液中二氧杂环乙烷化合物(APCL)的浓度为0.03mg/mL，缓冲液为摩尔浓度为0.02M的Tris-HCl，pH值为9.3。

实施例2本发明抗缪勒氏管激素(AMH)磁微粒化学发光检测试剂盒的各项性能评价

1、最低检测限

方法：用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的相对发光强度(RLU)值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD(正反应)或M-2SD(负反应)的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。

合格标准：<0.05ng/ml

结论：灵敏度不大于0.05ng/mL，满足设计要求。

2、线性实验

分析方法：

用试剂盒最高浓度点校准品(F点)用该项目校准品稀释液倍比稀释到接近该项目分析灵敏度，形成若干浓度点样本。试剂盒定标后测试梯度样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数(r)。

合格标准：1.0-200ng/ml内，r>0.9900。

基于上表所示的数据，进行理论浓度和测试浓度的比对，如图1所示，基本在一条直线上，线性很好。

结论：r>0.9900，线性符合设计要求。

3、精密度

试验方法：

分析方法(分析内)：用高、低两个水平浓度的质控血清或新鲜人血清检测试剂，重复测试10次，按以下公式计算测定结果的均值和变异系数(CV)。

式中：Xi──待测血清样本的测定结果；──待测血清样本的均值；n──测定次数，此处为10。

分析方法(分析间)：分三次实验，用高、低两个水平浓度的质控血清或新鲜人血清检测试剂，重复测试10次，没一样本均得到30个结果，按以下公式计算测定结果的均值和变异系数(CV)。

式中：Xi──待测血清样本的测定结果；──待测血清样本的均值；n──测定次数，此处为30。

合格标准：

分析内：不大于10％

分析间：不大于15％

分析内

分析间

结论：研制试剂盒精密度分析内和分析间均符合要求。

4、HOOK效应

试验方法：按照试剂盒产品标准要求配制HOOK检验试剂，将其作为样本检测。

合格标准：发光值超过校准品最高浓度点发光值。

AMH-STD浓度	RLU
		0	1938
0.2	28271
		1.0	128558
5	571072
		10	1094349
30	3022720

结论：样本浓度在2000ng/ml范围内，未出现测值低于检测范围上限的情况，符合设计要求。

5、交叉反应

试验方法：按试剂盒产品标准要求，配制一定浓度的交叉反应物作为样本用试剂盒进行检测，检测结果与样本配制浓度的比值(％)即为对该样本的交叉反应率。

试验数据及合格标准：＜1.0％

交叉反应物	实际浓度	测试浓度
			促卵泡生成素(FSH)	150mU/ml	≤0.05ng/ml
促黄体生成素(LH)	250mIU/ml	≤0.05ng/ml
			雌二醇(E2)	3000pg/ml	≤0.05ng/ml

结论：与其他常用性腺激素交叉反应均＜1.0％，符合要求。

6、抗干扰

试验方法：用同一批号的试剂和接近正常值的病人血清，向该血清中加干扰物配制成如下几种浓度的物质做标本，每个标本测两次。检测试剂特异性。干扰物存在测得值与干扰物不存在测得值的偏差≤15％被视为无干扰。

试验数据及合格标准：≤15％

7、稳定性

试剂盒及标品加速破坏性实验

验证方法：新配制并检验合格的试剂(包括STD，R1，R2，M)放入37℃温箱共放置7天(可超过7天)。若干天取出试剂，定标后(用4℃保存合格校准品)检测试剂准确性，质控偏差小于20％。

合格标准：校准品降幅小于10％，试剂盒降幅小于50％，准确度符合要求。

试剂盒整体37℃加速

校准品37℃加速

质控品

结论：校准品放入37℃温箱7天，准确度符合要求，校准品降幅小于10％，试剂盒降幅小于50％，符合要求。

8、试剂盒临床性能评价

检测200例血清，比对某知名厂家试剂测值，如图2所示，相关系数为R²＝0.9535，一致性较好。

灵敏度－最小检出量为0.004ng/ml；

抗缪勒氏管激素(AMH)线性检测范围，0～30ng/ml；

本发明提供的人体抗缪勒氏管激素(AMH)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，操作步骤极大简化，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，同时避免了人为操作导致的误差。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品液系列和化学发光底物液；

R1试剂为异硫氰酸荧光素标记的抗抗缪勒氏管激素单克隆抗体稀释液，R2试剂为碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗体稀释液，磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒稀释剂，校准品液系列为含有不同浓度抗缪勒氏管激素抗原的稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液。

2.根据权利要求1所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述R1试剂即异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体稀释液是浓度为1.0～3.0μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体经缓冲液稀释配成。

3.根据权利要求2所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述R1试剂即异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体稀释液是浓度为1.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的抗缪勒氏管激素单克隆抗体经缓冲液稀释配成。

4.根据权利要求3所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述R1试剂缓冲液pH值为7.0，缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05mol/L；其余为去离子水。

5.根据权利要求1所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗体稀释液是由浓度为1.0～3.0μg/mL碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗原经缓冲液稀释而成。

6.根据权利要求5所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗原稀释液是由浓度为1.5μg/mL碱性磷酸酶标记的抗缪勒氏管激素抗原经缓冲液稀释而成。

7.根据权利要求6所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述R2试剂缓冲液为pH值为6.8，缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.05mol/L；其余为去离子水。

8.根据权利要求1所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒悬浮于缓冲液配制成浓度为0.5～2mg/mL的磁微粒溶液。

9.根据权利要求8所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂为抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒悬浮于缓冲液配制成浓度为1.0mg/mL的磁微粒溶液。

10.根据权利要求9所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂缓冲液为pH值为8.0，缓冲液组分为包括叠氮钠，浓度为0.989g/L；牛血清白蛋白，浓度为4.5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.025mol/L；其余为去离子水。

11.根据权利要求1所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述校准品液系列为含有不同浓度抗缪勒氏管激素抗原的稀释液。

12.根据权利要求11所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述校准品液系列的缓冲液包括叠氮钠，浓度为0.98～0.99g/L；牛血清白蛋白，浓度为4～5g/L；三羟甲基氨基甲烷，摩尔浓度为0.005～0.03mol/L；其余为去离子水。

13.根据权利要求12所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述校准品液系列，浓度范围为0～30ng/mL，缓冲液pH值为7.6。

14.根据权利要求13所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述校准品液系列的不同浓度为0ng/ml、0.2ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、30ng/ml。

15.根据权利要求1所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液是摩尔浓度0.1～0.3M的碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，pH值为8～10的摩尔浓度0.2M的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。

16.根据权利要求15所述的检测人体抗缪勒氏管激素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液是摩尔浓度为0.2M，pH值为9.3的摩尔浓度0.2M的Tris-HCl缓冲液，并含有0.3mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。