CN103048475A

CN103048475A - 游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备和检测方法

Info

Publication number: CN103048475A
Application number: CN2012105501712A
Authority: CN
Inventors: 于大为; 程晓蕾
Original assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SUZHOU HAOOUBO BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2013-04-17

Abstract

本发明涉及一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备和检测方法，试剂盒包括：第一试剂：含异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的溶液；第二试剂：含碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的溶液；磁分离试剂：含包被着抗异硫氰酸荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法和采用该试剂进行游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的检测方法。相对于现有技术，本发明准确性更好、精密度更高、灵敏度更高，而且待测样本无需预稀释，操作简单省时，检测范围宽，并且成本低。

Description

游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备和检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的检测方法，检测用试剂盒以及该试剂盒的制备方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素（HCG）是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生的一种糖蛋白，由α和β二个单位通过离子键和疏水键结合在一起。α亚单位是垂体前叶激素所共有，它与FSH、LH、TSH的α亚单位结构相似。β亚单位的结构与LH等的β亚单位不同，在免疫活性上可予区别。血中β亚单位大部分以全分子形式存在，游离态的β亚单位（F-β-HCG）占HCG的1～5%左右。血中游离态的β亚单位是在受孕后6～8天产生，50～80天达到高峰，以后平稳下降，直至孕18周左右稳定于一定浓度。

唐氏综合征又称先天愚型，21-三体综合征，是最常见的染色体疾病和弱智的病因，新生儿中发病率约为1/700左右。根据染色体核型的不同，唐氏综合征分为单纯21三体型、嵌合型和易位型三种类型。唐氏综合征的发生起源于卵子或精子发生的减数分裂过程中染色体的不分离现象，通常是随机发生的，约95%的不分离现象来源于母亲，仅5%左右发生在精子发生期。其结果是21号染色体多了一条，多出的一条染色体因剂量效应破坏了正常基因组遗传物质间的平衡，导致患儿智力低下，颅面部畸形及特殊面容，肌张力低下，多并发先天性心脏病，患者白血病的发病率为普通人群的10-20倍。生活难以自理，患者预后一般较差，50%左右于5岁前死亡。

目前对唐氏综合征缺乏有效的治疗方法。通过孕早、中期检测孕妇血中PAPP-A,游离β-HCG,AFP等，结合B超检查，可将约90%的唐氏综合征检测出来。对高风险胎儿，通过绒毛活检或羊水穿刺或脐血穿刺等技术作染色体核型分析可以确诊，然后流产处理。

怀有唐氏综合征（DS）胎儿的孕妇，一部分人其血清F-β-HCG水平呈强直性升高，平均MOM值为2.3～2.4MOM。F-β-HCG在孕早期和孕中期都处于高水平。妊娠中期DS孕妇血清F-β-HCG浓度比正常至少高2倍。F-β-HCG用于DS风险的评估，敏感期可从孕早期到孕中期（7～20周）。

目前用于检测游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位（F-β-HCG）的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。酶联免疫分析法存在灵敏度低，线性范围窄、不易实现全自动化等方法学限制因素。化学发光免疫分析法是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术，具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。目前化学发光免疫分析技术因其有上述诸多有点得到了广泛的应用。

然而，在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，是的某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的第一个目的是提供一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光定量检测试剂盒，其能够以较低的成本制备得到，且能够实现游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位准确和高精准地定量测定。

本发明的第二个目的是提供一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光定量检测试剂盒的简便和低成本的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光定量检测方法，该方法不仅准确性好、灵敏度高，且精密度特别是分析间精密度高，此外该方法成本低。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：

第一试剂：含荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为7.0-9.0的缓冲溶液，所述的荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为0.5～1μg/mL；

第二试剂：含碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为7.0-9.0的缓冲溶液，所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为0.5～1μg/mL；

磁分离试剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

根据本发明，所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体由碱性磷酸酶与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。

根据本发明，所述包被有荧光素抗体的磁微粒的制备也是较为容易的，且现有技术已有成熟的制备工艺可以参照。例如可以通过常规的物理吸附或化学偶联包被方式制备，没有特别限制。作为本发明的一种优选实施方案：该包被有荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间相化学偶联。

本领域技术人员应知晓，本发明的试剂盒还可以进一步包括有其它检测所需的试剂，例如底物溶液。但是诸如底物溶液等其它试剂可以另行购买或配制，因此，虽然试剂盒中可以包括这些试剂，但它们对于本发明试剂盒来说并非必不可少。

本发明采取的又一技术方案是：一种用于游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述的第一试剂、所述的第二试剂以及所述的磁分离试剂的步骤，其中：所述的第二试剂的制备方法如下：

（1）使游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与交联剂2-亚氨基四氢噻吩在甘氨酸溶液中，室温静置反应，生成游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物，于2-8℃下保存备用；

（2）使碱性磷酸酶溶液与交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物溶液混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，将收集到的碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物于2-8℃下保存备用；

（3）将步骤（1）所得溶液与步骤（2）所得溶液按照游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:1~2混合，在2-8℃下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体，反应结束，将反应液通过Supp erdex200凝胶纯化柱纯化，选择合适的pH缓冲液调整浓度和pH值即得所述的第二试剂。

进一步地，所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、所述的碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度超过5mg/ml。

根据一个具体方面，所述的第一试剂的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为9~10的缓冲液，然后按照荧光素与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9~10的缓冲液与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，获得荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的溶液，接着用具有适当的pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述第一试剂。

根据又一具体方面，所述的磁分离试剂的制备方法如下：使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应2~12小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。

优选地，所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2微米，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0.4mmol；所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万；所述的偶联剂为碳二亚胺。

本发明以上所述的缓冲液可以是本领域常用的那些，例如碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液。实际实施过程中，可选择最适合的缓冲液。例如，在第一试剂、第二试剂以及磁分离试剂的制备的最后阶段，通常采取含0.5%牛血清蛋白（BSA）、pH 8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液。

本发明所述的荧光素可以是已知的各种荧光素，常用的有例如异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明等。

本发明采取的又一技术方案是：一种定量检测血清或血浆样本中游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的检测方法，该方法是基于磁微粒分离技术的化学发光免疫检测法，所述检测方法包括依次进行的免疫反应步骤、使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤，其中，该检测方法包括以下步骤：

（1）、免疫反应：在检测管中加入待测样本原液，然后加入第一试剂，混匀，2540℃条件下进行第一次温育；

（2）、加入磁分离试剂，混匀，25-40℃条件下进行第二次温育；

（3）、多次洗涤；

（4）、加入第二试剂，混匀，25-40℃条件下进行第三次温育；

（5）、多次洗涤；

（6）、加底物溶液检测发光强度；

所述的底物溶液为碱性磷酸酶化学发光底物溶液。

进一步地，所述的第一次温育的时间为5-15min，第二次温育的时间为3-10min，第三次温育的时间为5-15min。

上述的使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤均可参照常规方法实施，所用的设备以及装置也是常规的。其中，碱性磷酸酶化学发光底物溶液对于本领域人员来说也是已知的，可商购获得。

本发明的有益效果在于：

1、采用本发明的试剂盒以及结合传统的化学发光免疫检测方法和设备就可以实现游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位准确，精密的检测；

2、本发明的试剂盒中的第一试剂、磁分离试剂均可以通过成熟、稳定的制备工艺制备得到，生产成本低，且由于制备工艺的稳定性，试剂盒分析批间差小，检测的分析间精密度提高；

3、本发明的试剂盒中的第二试剂的制备方法，能够有效将游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与碱性磷酸酶偶联，偶联效率高，进一步降低试剂盒的成本低和确保试剂盒的检测效果。

4、本发明的检测方法检测的准确度好，精密度高，灵敏度高，检测范围宽，样品无序预稀释，操作简单省时。与采用进口试剂盒进行检测的方法相比，本发明的检测方法在成本上具有显著的优势。

附图说明

图1为采用本发明游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光定量检测试剂盒的测试校准品检测相对发光值的标准曲线，横坐标为浓度，单位为ng/mL，纵坐标为发光值。

图2为为本发明灵敏度测试中A,B点连点拟合曲线。

图3为本发明的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光定量检测试剂盒的血清检测结果与PerkinElmer公司试剂盒检测结果的相关性，横坐标x为实施例1制备得的试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL，纵坐标y为PerkinElmer公司试剂盒样本测值，浓度单位为ng/mL。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1、磁分离试剂的制备。

材料与仪器

磁微粒的悬浮液：磁微粒含量5wt%，含羧基（COOH）活性基团，每克（g）磁微粒（干重）羧基含量不低于0.4毫摩尔（mmol），具有超顺磁性，直径在0.5-2μm之间。

抗FITC抗体：可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，纯度应超过90wt%，稀释效价应超过1:100万。

2-吗啉乙磺酸（MES）、碳二亚胺（EDC）、TRIS和其他试剂应达到化学纯。

操作步骤

1、取100mg磁微粒的悬浮液，磁分离去上清，用0.05mol/L,PH4.5-5MES缓冲液10ml重悬；

2、加入2-4mg的抗FITC抗体，室温混悬30-60min；

3、加入0.5-1ml，新鲜配制的10mg/ml，EDC水溶液，室温混悬2-12h；

4、磁分离，去上清，用含质量百分比为0.5%牛血清白蛋白（BSA）pH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液重悬到1mg/ml，pH8.0，即为磁分离试剂。

实施例2、第一试剂的制备。

材料与仪器

抗F-β-HCG单克隆抗体，由北京利德曼生化股份有限公司制备，纯度超过95wt%，浓度为2mg/ml,以磷酸盐缓冲液保存；

异硫氰酸荧光素（FITC），碳酸钠等试剂应达到化学纯，

G-25凝胶纯化柱采购自GE公司。

操作步骤

1、用0.1-0.2mol/L PH9.0-10.0的碳酸盐缓冲液配制0.5mg/ml的FITC溶液；

2、按照抗F-β-HCG抗体与FITC分子摩尔数比1:20比例在抗体溶液中加入FITC溶液，混合均匀，室温静置超过12h，反应生成抗F-β-HCG抗体-FITC连接物；

3、将经过步骤2的反应液用G-25凝胶柱进行分离，除去未反应的FITC，获得抗F-β-HCG抗体-FITC连接物（即FITC标记的抗F-β-HCG抗体）的溶液，将该溶液用含质量百分比为0.5%牛血清白蛋白（BSA）PH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5-1μg/ml，pH为7-9，即为第一试剂。

实施例3、第二试剂的制备。

材料与仪器

抗F-β-HCG单克隆抗体，由北京利德曼生化股份有限公司制备，纯度超过95%，浓度超过1mg/ml,以磷酸盐缓冲液保存；

碱性磷酸酶纯度约为99%，比活性约为1500U/mg，浓度为10mg/ml；

偶联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）,2-亚氨基四氢噻吩（2-IT）购自THERMO公司,TRIS等化学试剂应达到化学纯；

AKTA-purifier蛋白纯化仪和Supperde x200凝胶纯化柱为GE公司产品。

操作步骤

1、取1mg抗F-β-HCG抗体，加入10mg/ml的偶联剂2-IT溶液2-4μl，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μl，室温静置5min。用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；

2、取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液10-20μl，室温静置30mi n，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；

3、将上述活化的抗F-β-HCG抗体与活化的ALP混合，2-8℃条件下静置12-24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，2-8℃保存备用。

4、将抗体-ALP连接物浓溶液用含质量百分比为0.5%牛血清白蛋白（BSA）PH8.0的0.1mol/L的TRIS缓冲液稀释到0.5-1μg/ml，pH7-9，即为第二试剂。

实施例4用于游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位定量检测的试剂盒

该试剂盒包括：

按照实施例1方法制备的磁分离试剂50ml；

按照实施例2方法制备的第一试剂（浓度为0.75μg/ml），50ml；

按照实施例3方法制备的第二试剂（浓度为0.75μg/ml），50ml。

实施例5用于游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位定量检测的试剂盒

该试剂盒包括：

按照实施例1方法制备的磁分离试剂50ml；

按照实施例2方法制备的第一试剂（浓度为0.5μg/ml），50ml；

按照实施例3方法制备的第二试剂（浓度为0.5μg/ml），50ml。

实施例6采取实施例4的试剂盒进行游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的定量检测

（一）检测实施

下述检测步骤由全自动化学发光分析仪自动完成，也可手工操作完成。

1、在检测管中加入10μl待测样本（血清或血浆）原液，然后加入50μl第一试剂，混匀，37±1℃条件下温育10mi n；

2、加入50μl磁分离试剂，混匀，37±1℃条件下温育5mi n；

3、使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入600μl的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬。重复此操作，共操作3次。

4、加入100μl第二试剂，混匀，37±1℃条件下温育10mi n；

5、使磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入600μl的清洗液，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬。重复此操作，共操作3次。

6、将磁微粒在磁场中沉降，去除上清，加入100μl的碱性磷酸酶化学发光底物溶液（北京阿匹斯生物技术有限公司APCL-Ⅰ），去除磁场，充分混悬后检测1秒内相对发光强度值（RLU），。

（二）绘制校准品标准曲线

校准品标准曲线参见图1.

（三）灵敏度评价

检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU）的平均值（M）和标准差（SD），并计算M+2SD值,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度不大于0.2ng/mL。其中：A点的发光值参见表1：

表1

A点发光均值X=1397

SD=80

X+2SD=1557

B点的发光值参见表2。

表2

F-hCGβ-STD-B(RLU)
	18653
18856

B点发光均值X=18755

A,B点连点拟合曲线参见图2。灵敏度=0.046ng/mL。

（四）精密度评价

（1）分析内精密度

将实施例4中制备的试剂盒一批，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定，得出批内变异系数为4.59%～6.33%。

表3分析内精密度测试

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			8.33	10	6.33
60.42	10	4.59
			132.25	10	5.12

（2）分析间精密度

将实施例4中制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定。每份血清得到30个浓度测值，统计分析间变异系数为6.26%～7.59%。

表4分析间精密度测试

测定血清浓度（ng/mL）	测定次数	分析内CV(%)
			8.33	30	7.59
60.42	30	6.26
			132.25	30	7.26

（五）准确度评价

在2例混合血清样本中添加不同量人F-β-HCG标准品，形成3个浓度水平的血清添加样本，添加物体积小于总体积的10%。检测样本浓度，按下述公式计算回收率。本方法血清基质回收率在90-110%之间。数据参见表5.

R = \frac{C \times (V_{0} + V) - C_{0} \times V_{0}}{V \times C_{s}} \times 100 %

R：回收率；

V：加入标准溶液的体积；

V0：人源样品的体积；

C：人源样品加入标准溶液后的检测浓度；

C0：人源样品的检测浓度；

Cs：标准溶液的浓度。

表5.准确度评价——添加回收实验数据

（六）试剂盒特异性评价

对实施例4的试剂盒特异性检验是选取与F-β-HCG有类似结构的促黄体生成激素（LH）、促甲状腺激素（TSH）、促卵泡生成激素（FSH），配制成大于生理浓度的样本，以本方法进行测定，并计算交叉反应率。结果见表6，本法与LH、TSH、FSH的交叉反应率均小于0.04%

表6特异性实验

注：F-β-HCG单位换算ng/mL＝mIU/ml

（七）相关性评价

用实施例4所述的试剂盒和PerkinElmer公司的时间分辨荧光法试剂盒对100份人血清样品同时进行检测。其检测见过见附图3，以本发明方法的测的血清F-hCGβ浓度为横坐标，以PerkinElmer试剂盒测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：y=0.02707+0.9974x，相关系数为：0.9962。经统计学处理结果表明，本方法同国外试剂盒临床样本测值相关性良好。

（八）热稳定性评价

对实施例4的试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达12个月。

实施例7采取实施例5的试剂盒进行游离甲状腺素的定量检测

（1）检测步骤：同实施例6。

（2）灵敏度评价：该实施例中的试剂盒灵敏度为0.046ng/mL，达到国内外同类试剂领先水平，较好的满足临床应用。

（3）精密度评价：该实施例中的试剂盒分析内和分析见精密度均小于10%，批间差小。

（4）准确性评价：该实施例中的试剂盒血清添加回收率在90-110%之间，临床应用测值准确性可靠。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：

第一试剂：含荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为7.0-9.0的缓冲溶液，所述的荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为0.5~1μg/mL；

第二试剂：含碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为7.0-9.0的缓冲溶液，所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为0.5~1μg/mL；

磁分离试剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。

2.根据权利要求1所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体由碱性磷酸酶与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。

3.根据权利要求1所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的包被着荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间化学偶联。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述的第一试剂、所述的第二试剂以及所述的磁分离试剂的步骤，其特征在于：所述的第二试剂的制备方法如下：

（3）将步骤（1）所得溶液与步骤（2）所得溶液按照游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:1~2混合，在2-8℃下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体，反应结束，将反应液通过Supperdex200凝胶纯化柱纯化，选择合适的pH缓冲液调整浓度和pH值即得所述的第二试剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、所述的碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过1000u/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度超过5mg/ml。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的第一试剂的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为9~10的缓冲液，然后按照荧光素与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9~10的缓冲液与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，获得荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的溶液，接着用具有适当的pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述第一试剂。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的磁分离试剂的制备方法如下：使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应2~12小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2微米，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0.4mmol；所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万；所述的偶联剂为碳二亚胺。

9.一种采用如权利要求1所述的试剂盒用于定量检测血清或血浆样本中游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的检测方法，该方法是基于磁微粒分离技术的化学发光免疫检测法，所述检测方法包括依次进行的免疫反应步骤、使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

（1）、免疫反应：在检测管中加入待测样本原液，然后加入第一试剂，混匀，25-40℃条件下进行第一次温育；

（3）、多次洗涤；

（5）、多次洗涤；

（6）、加底物溶液检测发光强度；

所述的底物溶液为碱性磷酸酶化学发光底物溶液。

10.根据权利要求9所述的定量检测方法，其特征在于：所述的第一次温育的时间为5-15min，第二次温育的时间为3-10min，第三次温育的时间为5-15min。