CN111579801A - 用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒及其检测方法,本发明的试剂盒包括至少一根单人份试剂条,单人份试剂条内预置有R1试剂、R2试剂和R3试剂,R1试剂为发光微粒‑抗AMH抗体结合物溶液,R1试剂由经过透析的抗AMH抗体和经活化的发光微粒经偶联和封闭后得到,发光微粒经CB缓冲液清洗后离心并超声混匀后加入用CB缓冲液配制的EDAC溶液和NHS溶液,混匀,旋转后活化,R2试剂为生物素‑抗AMH抗体结合物溶液,R3试剂为感光微粒‑亲和素结合物溶液。本发明的试剂盒对抗缪勒氏管激素的检测结果重复性高,且检测灵敏度高,检测结果可靠。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒及其检测方法。
背景技术
抗缪勒管激素(Anti-Müllerian hormone,AMH)是一种糖蛋白,是由2个完全相同的72kDa单体以二硫键连接组成的二聚体,属于转化生长因子-β家族。AMH由窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞分泌,可以作为女性生育力的评估指标及卵巢功能衰退的预警信号。在临床上,AMH可用作“多囊卵巢综合征(PCOS)”、“卵巢功能早衰(POF)”、“卵巢颗粒细胞瘤”等相关疾病的辅助诊断。
目前,抗缪勒氏管激素(AMH)的常用检测方法有如下几种:酶联免疫分析法(ELISA)、胶乳增强免疫比浊法和磁微粒化学发光免疫分析法等。
酶联免疫分析法(ELISA)检测灵敏度不够高,检测范围窄,影响因素较多,易造成假阴性和假阳性。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速,但是灵敏度低、低值重复性差。
磁微粒化学发光免疫分析法,为目前主流的免疫标志物检测分析方法,该方法以超顺磁微粒为固相分离载体,即让结合状态标记物吸附在微球表面,而游离状态标记物分布于液相中,再洗涤去除磁微粒表面的游离标记物。由于多次清洗,较容易发生磁微粒脱落(即丢磁现象),研究表明,标记免疫分析随机误差主要由分离洗涤过程产生,故该类方法重复性偏低。此外,多次清洗,也势必造成检测灵敏度的损失。而且清洗后产生的废液,也会增加实验室的处理负担。
近几年,新兴起了利用光激发化学发光技术进行检测的技术,参见附图1所示,光激发化学发光技术的原理是通过将发光微粒包被的抗体与生物素标记的配对抗体和样本、或校准品中的抗原结合形成“三明治”复合物。随后加入连有链霉亲和素(Streptavidin,SA)的感光微粒,在680nm的激发光激发下,发生微粒之间的离子氧的转移,进而产生高能级的610nm红光,在检测范围内,发光强度与样本中的抗原浓度成正比,通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。光激发化学发光技术具有检测响应速度快的优点。
目前,国内已有利用该项技术进行AMH检测的试剂盒及检测方法的相关报道,但是AMH的光激发化学发光检测试剂盒的主要市场仍然被国外公司所垄断,究其原因在于,国内的AMH的光激发化学发光检测试剂盒普遍存在重复性及检测灵敏度较差的缺陷,因而对检测精度和检测结果造成较大影响。
发明内容
为克服上述缺点,本发明的目的在于提供一种用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒及其检测方法,其检测重复性高,灵敏度好,检测结果可靠。
本发明的目的之一在于,提供一种用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒,其包括至少一根单人份试剂条,在每个所述单人份试剂条内预置有R1试剂、R2试剂和R3试剂,在每个所述单人份试剂条上设置有若干试剂孔,所述试剂孔包括用于容纳R1试剂的第一试剂孔、用于容纳R2试剂的第二试剂孔、用于容纳R3试剂的第三试剂孔和与激光发生反应的检测孔,所述检测孔采用不透光材料制成,所述试剂孔还包括用于容纳待检测物的样本孔,所述R1试剂为发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液,所述R1试剂由经过透析的抗AMH抗体和经活化的发光微粒经偶联和封闭后得到,所述发光微粒按照如下步骤进行活化:将发光微粒经CB缓冲液清洗后离心并超声混匀后加入用CB缓冲液配制的EDAC溶液和NHS溶液,混匀,旋转反应后即完成对发光微粒的活化,所述R1试剂的发光微粒的浓度为10-100μg/ml,所述R2试剂为生物素-抗AMH抗体结合物溶液,所述R3试剂为感光微粒-亲和素结合物溶液,所述R3试剂的感光微粒的浓度为10-100μg/ml。
进一步的,所述发光微粒的活化方法为,将所述发光微粒利用CB缓冲液清洗后离心,超声混匀用CB缓冲液分别配制EDAC和NHS溶液,并迅速加入清洗后的发光微粒中,混匀,即完成对发光微粒的活化。
更进一步的,所述R1试剂按照如下方法制备:
①活化后清洗:将活化完的发光微粒用去离子水离心清洗,离心后用缓冲液重新悬浮;
②偶联反应:将经活化的发光微粒及经透析处理的抗AMH抗体按质量比10:0.1-10:0.8混合,充分旋转反应;
③封闭:利用甘氨酸溶液对发光微粒进行封闭处理;
④清洗:用CB缓冲液清洗步骤③得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物;
⑤定容:用HEPES缓冲液对发光微粒-抗AMH抗体结合物定容,备用;
⑥R1试剂配制:将步骤⑤制备得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R1试剂。
进一步的,所述R2试剂按照如下步骤制备:
①抗AMH抗体的透析:将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定;
②标记反应:用NaHCO3缓冲液将步骤①透析得到的抗AMH抗体稀释,将生物素溶液加入抗AMH抗体溶液中,旋转反应,即完成标记,生物素与抗AMH抗体的标记比例为20-100个生物素:1个抗AMH抗体;
③标记后的透析:用CB缓冲液对步骤②得到的生物素标记的抗AMH抗体进行透析;
④浓度测定:收集步骤③得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液,使用OD法进行抗体蛋白浓度测定;
⑤R2试剂配制:将步骤③制备得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液加入到PB缓冲液中,即配制得到R2试剂。
更进一步的,所述R3试剂按照如下步骤制备:
①亲和素蛋白透析:将亲和素蛋白于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行蛋白浓度测定;
②感光微粒清洗:将感光微粒用去离子水离心清洗,离心后用HEPES缓冲液重新悬浮;
③偶联反应:将步骤②得到的感光微粒及步骤①得到的亲和素蛋白按质量比10:0.1-10:0.8混合,保温旋转反应;
④还原:向步骤③所得到的反应液中迅速加入NaBH4溶液,低温旋转反应,感光微粒与NaBH4的质量比为10:0.05-10:0.5;
⑤封闭:将甘氨酸溶液迅速加入到步骤④得到的反应物中进行封闭处理,感光微粒与甘氨酸的质量比为1:0.5-1:5;
⑥清洗:用CB缓冲液对步骤⑤得到的感光微粒-亲和素结合物进行清洗;
⑦定容:用HEPES缓冲液将步骤⑥得到的感光微粒-亲和素结合物定容,备用;
⑧R3试剂配制:将步骤⑦制备得到的感光微粒-亲和素结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R3试剂。
本发明的目的之二,在于提供一种非诊断目的的定量检测抗缪勒氏管激素的方法,其利用前述本发明的目的之一所述的单人份试剂条完成,具体包括如下步骤:
①校准品溶液的配制:
采用胎牛血清(内含1‰Proclin)作为校准品缓冲液,配制不同梯度浓度的AMH校准品溶液;
②校准品的发光值检测:
将步骤①所得到的不同浓度的校准品分别放入到一根单人份试剂条的样本孔内,将单人份试剂条放入到分析仪器中进行检测;TIP头从样本孔和第一试剂孔吸取样本和R1试剂后注入到第二试剂孔,吸打混匀后恒温温育,温育结束后,吸取第二试剂孔中的反应物和第三试剂孔中的R3试剂,注入到所述检测孔中,吸打混匀后,恒温温育处理;
③标准曲线的拟合:
温育结束后,分析仪器产生激光照射检测孔,计算每孔发光光子量,拟合出样本浓度-发光值的标准曲线;
④样本检测:
将待测样本放入单人份试剂条的样本孔内,分析仪器重复步骤②的工作过程,得到样本的发光值,并通过步骤③得到的标准曲线计算出样本中AMH的浓度值。
本发明的目的之三在于,提供一种非诊断目的的定量检测抗缪勒氏管激素的方法,其包括如下步骤:
①制备R1试剂:
(a)抗AMH抗体透析:将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定;
(b)发光微粒活化:将发光微粒利用CB缓冲液清洗后离心,超声混匀。用CB缓冲液分别配制EDAC和NHS溶液,并迅速加入清洗后的发光微粒中,混匀,充分旋转反应;
(c)活化后清洗:将活化完的发光微粒用去离子水离心清洗,离心后用缓冲液重新悬浮;
(d)偶联反应:将处理好的发光微粒及抗AMH抗体按质量比10:0.1-10:0.8混合,充分旋转反应;
(e)封闭:利用甘氨酸溶液对发光微粒进行封闭处理;
(f)清洗:用CB缓冲液清洗步骤(e)得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物;
(g)定容:用HEPES缓冲液对发光微粒-抗AMH抗体结合物定容,备用;
(h)配制R1试剂:将步骤(g)制备得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R1试剂。
②制备R2试剂:
(a)抗AMH抗体的透析:将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定;
(b)标记反应:用NaHCO3缓冲液将步骤(a)透析得到的抗AMH抗体稀释,将生物素溶液加入抗AMH抗体溶液中,旋转反应,即完成标记,生物素与抗AMH抗体的标记比例为20-100个生物素:1个抗AMH抗体;
(c)标记后的透析:用CB缓冲液对步骤(b)得到的生物素标记的抗AMH抗体进行透析;
(d)浓度测定:收集步骤(c)得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液,使用OD法进行抗体蛋白浓度测定;
(e)R2试剂配制:将步骤(c)制备得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液加入到PB缓冲液中,即配制得到R2试剂。
③制备R3试剂:
(a)亲和素蛋白透析:将亲和素蛋白于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行蛋白浓度测定;
(b)感光微粒清洗:将感光微粒用去离子水离心清洗,离心后用HEPES缓冲液重新悬浮;
(c)偶联反应:将步骤(b)得到的感光微粒及步骤(a)得到的亲和素蛋白按质量比10:0.1-10:0.8混合,保温旋转反应;
(d)还原:向步骤(c)所得到的反应液中迅速加入NaBH4溶液,低温旋转反应,感光微粒与NaBH4的质量比为10:0.05-10:0.5;
(e)封闭:将甘氨酸溶液迅速加入到步骤④得到的反应物中进行封闭处理,感光微粒与甘氨酸的质量比为1:0.5-1:5;
(f)清洗:用CB缓冲液对步骤(e)得到的感光微粒-亲和素结合物进行清洗;
(g)定容:用HEPES缓冲液将步骤⑥得到的感光微粒-亲和素结合物定容,备用;
(h)R3试剂配制:将步骤(g)制备得到的感光微粒-亲和素结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R3试剂。
④标准曲线的绘制:
配制不同梯度浓度的校准品溶液;将校准品溶液和R1试剂放入预先存放有R2试剂的反应容器中,吸打混匀后恒温温育,温育结束后,将经温育和R3试剂于避光的反应容器中混匀后恒温温育处理,温育结束后,将避光的反应容器放入分析仪器内,分析仪器产生激光照射其内的反应物,并得到其发光光子量;依次得到各个不同浓度的校准品的发光值,拟合出样本浓度-发光值的标准曲线;
⑤将待测样本按照上述步骤④中的处理步骤,利用分析仪器得到样本的发光值,并通过步骤④得到的标准曲线计算出样本中AMH的浓度值。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果:
①本发明的试剂盒对抗缪勒氏管激素的检测结果重复性高,经过对高浓度AMH和低浓度AMH质控品的重复检测实验验证,其CV值小于1.5%,检测结果具有良好的检测重复性。
②本发明的试剂盒检测结果可靠,其与罗氏诊断的临床相关性r>0.99以上,且对血浆和全血检测结果具有良好的一致性。
③本发明的试剂盒的检测结果分析灵敏度高,其检出限≤0.001μg/ml。
④本发明的检测试剂盒中包含多个单人份检测试剂条,因而具有更佳的使用灵活性和检测精度。
⑤利用本发明的检测方法能够实现对AMH的快速、准确的测定,其检测效率高,检测结果可靠。
附图说明
图1为光激发化学发光技术原理图;
图2为本发明的实施例4中的单人份试剂条的结构示意图;
图3为本发明的实施例6中的AMH浓度-发光值标准曲线;
图4为本发明的实施例10中利用本发明的试剂盒对血浆和全血中的AMH检测结果的相关性曲线;
图5为本发明的实施例11中利用本发明的试剂盒与市售商品的对AMH进行检测结果的相关性曲线。
图中:
1-样本孔、2-第一试剂孔、3-第二试剂孔、4-第三试剂孔、5-检测孔、6-空白孔。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。
本发明各个实施例中的原料均为市售,主要原料来源为发光微粒和感光微粒均采购自DUKE POLYTECH COMPANY;生物素和链霉亲和素(Streptavidin)均采购自Sigma;与发光微粒结合的抗AMH抗体采购自Medix,货号为100758;与生物素结合的抗AMH抗体采购自Med ix,货号为100756。
实施例1.R1试剂的制备
①抗AMH抗体透析:将抗AMH抗体于0.05M CB缓冲液(pH9.6)中透析,透析时间4h,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定。
②发光微粒活化:将发光微粒利用0.05M CB缓冲液(pH9.6)清洗后离心,超声混匀。用CB缓冲液分别配制10mg/ml的EDAC溶液和40mg/ml的NHS溶液,磁珠与EDAC的投料质量比为1:0.25,磁珠与NHS的投料质量比为1:1.15,在发光微粒经超声混匀后迅速向其中加入EDAC溶液和NHS溶液,混匀,37℃旋转反应30min。
③活化后清洗:将步骤②得到的活化完的发光微粒用去离子水离心清洗,离心后用0.05M HEPES(pH8.0)缓冲液重新悬浮。
④偶联反应:将处理好的发光微粒及处理后的AMH包被抗体按质量比10:0.3混合,定容至25mg/ml(发光微粒浓度),37℃旋转反应18小时。
⑤封闭:用缓冲液配制75mg/ml甘氨酸溶液,按每10mg发光微粒需要0.16ml甘氨酸溶液的比例迅速加入反应液中,37℃反应10小时。
⑥清洗:用0.05M CB缓冲液(pH9.6)清洗步骤⑤得到的发光微粒-抗体结合物。
⑦定容:用0.05M HEPES(pH8.0)缓冲液将发光微粒-抗体结合物定容至10mg/ml左右(发光微粒浓度),备用。
⑧R1试剂配制:取步骤⑦的发光微粒-抗体结合物溶液加入到试剂缓冲液中,配制成最终工作浓度(发光微粒浓度)为50μg/mL的R1试剂;所用的试剂缓冲液为0.01M HEPES(pH 7.2)缓冲液,其中含1%Casein、5%BSA、1‰Proclin300。
实施例2.R2试剂的制备
①抗AMH抗体透析:将抗AMH抗体于0.05M CB缓冲液(pH9.6)中透析,透析时间4h,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定。
②标记反应:用0.1M NaHCO3缓冲液将透析好的抗AMH抗体稀释至反应浓度1mg/ml;按照每1mg抗AMH抗体需要0.01μl的Biotin溶液,Biotin使用DMSO溶解,向离心管中迅速加入Biotin溶液,迅速混匀,2-8℃旋转反应18小时。
③标记后的透析:用0.05M CB缓冲液(pH9.6)对Biotin-抗AMH抗体结合物进行透析。
④浓度测定:收集透析完的Biotin-抗AMH抗体结合物溶液,使用OD法进行抗体蛋白浓度测定。
⑤R2试剂配制:将步骤③制备得到的Biotin-抗AMH抗体结合物溶液,按照最终工作浓度2μg/ml投入到试剂缓冲液中,配置成R2试剂;所用的试剂缓冲液为0.01M PB(pH7.4)缓冲液,其中含5%BSA、1‰Proclin300。
实施例3.R3试剂的制备
①链霉亲和素蛋白的透析:将链霉亲和素蛋白于0.05M CB缓冲液(pH9.6)中透析,透析时间4h,透析完成后使用OD法进行蛋白浓度测定。
②感光微粒清洗:将感光微粒用去离子水离心清洗,离心后用0.05M HEPES(pH8.0)缓冲液重新悬浮。
③偶联反应:将处理好的感光微粒及处理后的链霉亲和素蛋白按质量比10:0.3混合,定容至25mg/ml(感光微粒浓度),37℃旋转反应18小时。
④还原:按每10mg感光微粒需要0.02ml的8mg/ml的NaBH4溶液,量取NaBH4溶液,迅速加入反应液中,2-8℃旋转反应2小时。
⑤封闭:用缓冲液配制75mg/ml甘氨酸,按每10mg感光微粒需要0.16ml甘氨酸溶液的比例迅速加入反应液中,37℃,反应10小时。
⑥清洗:用0.05M CB缓冲液(pH9.6)清洗反应好的感光微粒-链霉亲和素结合物。
⑦定容:用0.05M HEPES(pH8.0)缓冲液,将感光微粒-链霉亲和素结合物定容至10mg/ml左右(感光微粒浓度),备用。
⑧R3试剂配制:将步骤⑦得到的感光微粒-链霉亲和素结合物溶液,投入到试剂缓冲液中,配制成最终工作浓度(感光微粒浓度)为50μg/mL的R3试剂;所用的试剂缓冲液为0.01M HEPES(pH 7.2)缓冲液,其中含1%Casein、5%BSA、1‰Proclin300。
实施例4.单人份试剂条的分装及试剂盒的制备
参见附图2所示,本实施例的单人份试剂条包括依次设置的样本孔1、用于容纳R1试剂的第一试剂孔2、用于容纳R2试剂的第二试剂孔3、用于容纳R3试剂的第三试剂孔4和与激光发生反应的检测孔5,检测孔5为黑管,本实施例的单人份试剂条还包含至少一个空白孔6。按照表1对本实施例的单人份试剂条的各个试剂孔内的反应物进行分装:
表1单人份试剂条内的反应物分装量
试剂组分名称 | 孔位号 | 分装量(μl) |
R1试剂 | 第一试剂孔2 | 60 |
R2试剂 | 第二试剂孔3 | 50 |
R3试剂 | 第三试剂孔4 | 60 |
本发明的试剂盒内包装有多根单人份试剂条以及AMH标准品,在使用时,利用AMH标准品定标完成后,每次检测利用一根单人份试剂条即可完成。
实施例5.AMH校准品的配制
采用胎牛血清(内含1‰Proclin)作为校准品缓冲液,配制目标浓度为25μg/ml、20μg/ml、15μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml及0μg/ml的AMH溶液。本实施例的校准品缓冲液溶液是1L胎牛血清中加入1ml Proclin300,完全混匀后经0.22μm滤膜过滤而成。
实施例6.AMH浓度-发光值的标准曲线的拟合
取50μl校准品溶液放入到单人份试剂条样本孔1中,将单人份试剂条放入到EASY-M160化学发光免疫分析仪中进行检测,具体步骤为:TIP头从样本孔1中吸取25μl样本,从第一试剂孔2中吸取50μl R1试剂,注入到位于第二试剂孔3的R2试剂中,吸打混匀后,37℃温育4分钟。温浴结束后,吸取第二试剂孔3的所有反应试剂和50μl的第三试剂孔4的R3试剂,注入到检测孔5中,吸打混匀后,37℃温育4分钟。仪器产生激光照射检测孔,即可检测出发光值。
按上述方法得到各个不同浓度的校准品的发光值,并拟合出AMH浓度-发光值曲线,见附图3所示。
根据图3可知,本试剂盒标准曲线线性R>0.9900。
实施例7.样本中AMH浓度的检测
取50μl待测样本放入到单人份试剂条样本孔1中,将单人份试剂条放入到EASY-M160化学发光免疫分析仪中进行检测,具体步骤为:TIP头吸取样本孔1中的样本溶液25μl和第一试剂孔2中的R1试剂50μl,注入到第二试剂孔3的R2试剂中,吸打混匀后,37℃温育4分钟。温浴结束后,吸取第二试剂孔3的所有反应试剂和第三试剂孔4的R3试剂50μl中,注入到检测孔5中,吸打混匀后,37℃温育4分钟。温育结束后仪器产生激光照射微孔计算每孔发光光子量,根据光子量数自动计算标本浓度值,单位是μg/ml。
实施例8.试剂盒的重复性性能检测
使用高浓度(10μg/ml)和低浓度(1μg/ml)的AMH校准品,重复检测20次,计算均值和标准差。高、低浓度校准品的重复性CV值均小于1.5%。
实施例9.试剂盒的分析灵敏度性能检测
对不含AMH抗原的空白缓冲液测定20次,结果如表2所示,计算信号均值和标准差,以信号均值+2标准差代入标准曲线,计算得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度。
表2本发明的试剂盒的分析灵敏度性能检测结果
结果表明,本发明的AMH检测试剂盒的分析灵敏度≤0.001μg/ml。
实施例10.利用本发明的试剂盒进行血浆、全血中AMH含量的检测结果对比
收集30份具有同源性的血浆和全血(即血浆和全血样本来自于同一个人),检测结果如图4所示。结果显示二者斜率为0.956,且相关性>0.99,说明利用本发明的试剂盒对血浆和全血中的AMH检测结果具有良好的一致性。
实施例11.本发明试剂盒与市售商品检测结果的相关性
利用本发明的试剂盒检测30例经罗氏诊断Cobas e411电化学发光检测系统临床定值样本,其临床数据相关性如图5所示,结果表明,本发明试剂盒与罗氏诊断的临床相关性r>0.99以上,说明利用本发明的检测试剂盒得到的AMH含量检测结果具有足够的可信度。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒,其特征在于,包括至少一根单人份试剂条,每根所述单人份试剂条内预置有R1试剂、R2试剂和R3试剂,在每个所述单人份试剂条上设置有若干试剂孔,所述试剂孔包括用于容纳R1试剂的第一试剂孔、用于容纳R2试剂的第二试剂孔、用于容纳R3试剂的第三试剂孔和与激光发生反应的检测孔,所述检测孔采用不透光材料制成,所述试剂孔还包括用于容纳待检测物的样本孔,
所述R1试剂为发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液,所述R1试剂由经过透析的抗AMH抗体和经活化的发光微粒经偶联和封闭后得到,所述发光微粒按照如下步骤进行活化:将发光微粒经CB缓冲液清洗后离心并超声混匀后加入用CB缓冲液配制的EDAC溶液和NHS溶液,混匀,旋转反应后即完成对发光微粒的活化,所述R1试剂的发光微粒的浓度为10-100μg/ml,
所述R2试剂为生物素-抗AMH抗体结合物溶液,
所述R3试剂为感光微粒-亲和素结合物溶液,所述R3试剂的感光微粒的浓度为10-100μg/ml。
2.根据权利要求1所述的用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒,其特征在于,所述发光微粒的活化方法为,将所述发光微粒利用CB缓冲液清洗后离心,超声混匀用CB缓冲液分别配制EDAC和NHS溶液,并迅速加入清洗后的发光微粒中,混匀,即完成对发光微粒的活化。
3.根据权利要求2所述的用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒,其特征在于,所述R1试剂按照如下方法制备:
①活化后清洗:将活化完的发光微粒用去离子水离心清洗,离心后用缓冲液重新悬浮;
②偶联反应:将经活化的发光微粒及经透析处理的抗AMH抗体按质量比10:0.1-10:0.8混合,充分旋转反应;
③封闭:利用甘氨酸溶液对发光微粒进行封闭处理;
④清洗:用CB缓冲液清洗步骤③得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物;
⑤定容:用HEPES缓冲液对发光微粒-抗AMH抗体结合物定容,备用;
⑥R1试剂配制:将步骤⑤制备得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R1试剂。
4.根据权利要求1所述的用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒,其特征在于,所述R2试剂按照如下步骤制备:
①抗AMH抗体的透析:将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定;
②标记反应:用NaHCO3缓冲液将步骤①透析得到的抗AMH抗体稀释,将生物素溶液加入抗AMH抗体溶液中,旋转反应,即完成标记,生物素与抗AMH抗体的标记比例为20-100个生物素:1个抗AMH抗体;
③标记后的透析:用CB缓冲液对步骤②得到的生物素标记的抗AMH抗体进行透析;
④浓度测定:收集步骤③得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液,使用OD法进行抗体蛋白浓度测定;
⑤R2试剂配制:将步骤③制备得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液加入到PB缓冲液中,即配制得到R2试剂。
5.根据权利要求1所述的用于抗缪勒氏管激素含量检测的单人份试剂盒,其特征在于,所述R3试剂按照如下步骤制备:
①亲和素蛋白透析:将亲和素蛋白于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行蛋白浓度测定;
②感光微粒清洗:将感光微粒用去离子水离心清洗,离心后用HEPES缓冲液重新悬浮;
③偶联反应:将步骤②得到的感光微粒及步骤①得到的亲和素蛋白按质量比10:0.1-10:0.8混合,保温旋转反应;
④还原:向步骤③所得到的反应液中迅速加入NaBH4溶液,低温旋转反应,感光微粒与NaBH4的质量比为10:0.05-10:0.5;
⑤封闭:将甘氨酸溶液迅速加入到步骤④得到的反应物中进行封闭处理,感光微粒与甘氨酸的质量比为1:0.5-1:5;
⑥清洗:用CB缓冲液对步骤⑤得到的感光微粒-亲和素结合物进行清洗;
⑦定容:用HEPES缓冲液将步骤⑥得到的感光微粒-亲和素结合物定容,备用;
⑧R3试剂配制:将步骤⑦制备得到的感光微粒-亲和素结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R3试剂。
6.一种非诊断目的的定量检测抗缪勒氏管激素的方法,其特征在于,利用权利要求1-5中任一项所述的单人份试剂条完成,具体包括如下步骤:
①校准品溶液的配制:
采用胎牛血清(内含1‰Proclin)作为校准品缓冲液,配制不同梯度浓度的AMH校准品溶液;
②校准品的发光值检测:
将步骤①所得到的不同浓度的校准品分别放入到一根单人份试剂条的样本孔内,将单人份试剂条放入到分析仪器中进行检测;TIP头从样本孔和第一试剂孔吸取样本和R1试剂后注入到第二试剂孔,吸打混匀后恒温温育,温育结束后,吸取第二试剂孔中的反应物和第三试剂孔中的R3试剂,注入到所述检测孔中,吸打混匀后,恒温温育处理;
③标准曲线的拟合:
温育结束后,分析仪器产生激光照射检测孔,计算每孔发光光子量,拟合出样本浓度-发光值的标准曲线;
④样本检测:
将待测样本放入单人份试剂条的样本孔内,分析仪器重复步骤②的工作过程,得到样本的发光值,并通过步骤③得到的标准曲线计算出样本中AMH的浓度值。
7.一种非诊断目的的定量检测抗缪勒氏管激素的方法,其特征在于,包括如下步骤:
①制备R1试剂:
(a)抗AMH抗体透析:将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定;
(b)发光微粒活化:将发光微粒利用CB缓冲液清洗后离心,超声混匀。用CB缓冲液分别配制EDAC和NHS溶液,并迅速加入清洗后的发光微粒中,混匀,充分旋转反应;
(c)活化后清洗:将活化完的发光微粒用去离子水离心清洗,离心后用缓冲液重新悬浮;
(d)偶联反应:将处理好的发光微粒及抗AMH抗体按质量比10:0.1-10:0.8混合,充分旋转反应;
(e)封闭:利用甘氨酸溶液对发光微粒进行封闭处理;
(f)清洗:用CB缓冲液清洗步骤(e)得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物;
(g)定容:用HEPES缓冲液对发光微粒-抗AMH抗体结合物定容,备用;
(h)配制R1试剂:将步骤(g)制备得到的发光微粒-抗AMH抗体结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R1试剂。
②制备R2试剂:
(a)抗AMH抗体的透析:将抗AMH抗体于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行抗体浓度测定;
(b)标记反应:用NaHCO3缓冲液将步骤(a)透析得到的抗AMH抗体稀释,将生物素溶液加入抗AMH抗体溶液中,旋转反应,即完成标记,生物素与抗AMH抗体的标记比例为20-100个生物素:1个抗AMH抗体;
(c)标记后的透析:用CB缓冲液对步骤(b)得到的生物素标记的抗AMH抗体进行透析;
(d)浓度测定:收集步骤(c)得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液,使用OD法进行抗体蛋白浓度测定;
(e)R2试剂配制:将步骤(c)制备得到的抗AMH抗体-生物素结合物溶液加入到PB缓冲液中,即配制得到R2试剂。
③制备R3试剂:
(a)亲和素蛋白透析:将亲和素蛋白于CB缓冲液中透析处理,透析完成后使用OD法进行蛋白浓度测定;
(b)感光微粒清洗:将感光微粒用去离子水离心清洗,离心后用HEPES缓冲液重新悬浮;
(c)偶联反应:将步骤(b)得到的感光微粒及步骤(a)得到的亲和素蛋白按质量比10:0.1-10:0.8混合,保温旋转反应;
(d)还原:向步骤(c)所得到的反应液中迅速加入NaBH4溶液,低温旋转反应,感光微粒与NaBH4的质量比为10:0.05-10:0.5;
(e)封闭:将甘氨酸溶液迅速加入到步骤④得到的反应物中进行封闭处理,感光微粒与甘氨酸的质量比为1:0.5-1:5;
(f)清洗:用CB缓冲液对步骤(e)得到的感光微粒-亲和素结合物进行清洗;
(g)定容:用HEPES缓冲液将步骤⑥得到的感光微粒-亲和素结合物定容,备用;
(h)R3试剂配制:将步骤(g)制备得到的感光微粒-亲和素结合物溶液加入到HEPES缓冲液中,即配制得到R3试剂。
④标准曲线的绘制:
配制不同梯度浓度的校准品溶液;将校准品溶液和R1试剂放入预先存放有R2试剂的反应容器中,吸打混匀后恒温温育,温育结束后,将经温育和R3试剂于避光的反应容器中混匀后恒温温育处理,温育结束后,将避光的反应容器放入分析仪器内,分析仪器产生激光照射其内的反应物,并得到其发光光子量;依次得到各个不同浓度的校准品的发光值,拟合出样本浓度-发光值的标准曲线;
⑤将待测样本按照上述步骤④中的处理步骤,利用分析仪器得到样本的发光值,并通过步骤④得到的标准曲线计算出样本中AMH的浓度值。
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