CN103954776A - Ngal光激发化学发光检测试剂盒、其制备及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，包括如下步骤：活化发光微球：将发光微球通过配制的碳二亚胺及Sulfo-NHS溶液在PBS缓冲液中活化，发光微球为羧基修饰发光微球，发光微球中包被有二甲基噻吩、蒽、红荧烯且带有铕螯合物；抗NGAL抗体偶联发光微球：选取羧基修饰发光微球，将抗NGAL单克隆抗体与活化的羧基修饰发光微球混合反应以偶联抗体到微球上，并且在混合抗体和活化微球的同时加入了新鲜配置的碳二亚胺；生物素标记抗NGAL抗体；亲和素标记感光微球。还涉及其制备及使用方法。本发明解决了现有技术的检测方法解决了现有技术中检测方法灵敏度低、检测容易受环境干扰的问题。
Description
技术领域
本发明涉及脂质运载蛋白含量检测领域，具体涉及一种人体内中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)光激发化学发光检测试剂盒、其制备及使用方法。
背景技术
目前最常用的NGAL检测方法是胶体金免疫检测分析和化学发光免疫分析(CLIA)；
但本申请人在使用胶体金、CLIA方法时发现这些方法存在着一些缺陷：胶体金检测灵敏度不高，且无法准确定量；CLIA影响因素较多，例如易受环境干扰，发光时间短，并且为非开放性试剂，试剂价格高。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种NGAL光激发化学发光检测试剂盒、其制备及使用方法，解决了现有技术中检测方法灵敏度低、检测容易受环境干扰的问题。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)活化发光微球；
(2)抗NGAL抗体偶联发光微球；
(3)生物素标记抗NGAL抗体；
(4)亲和素标记感光微球。
在上述技术方案中，步骤(1)中，将发光微球通过配制的碳二亚胺及Sulfo-NHS溶液在PBS缓冲液中活化，所述发光微球为羧基修饰发光微球，所述发光微球中包被有二甲基噻吩、蒽、红荧烯且带有铕螯合物。
在上述技术方案中，步骤(2)中，将抗NGAL单克隆抗体与活化的发光微球混合反应以偶联抗体到微球上，并且在混合抗体和活化微球的同时加入了新鲜配置的碳二亚胺
在上述技术方案中，步骤(3)中，所述新鲜配置的碳二亚胺为50mg/mL，偶联方法为室温震荡2小时。
在上述技术方案中，所述抗NGAL抗体偶联发光微球步骤中，发光微球与NGAL抗体的质量比例为10-50：1。
在上述技术方案中，所述生物素标记抗NGAL抗体步骤中，生物素与抗体的分子比例为10-50：1。
在上述技术方案中，所述生物素与抗体的分子比例为为30:1。
在上述技术方案中，所述感光微球带有酞菁染料。
根据以上任一技术方案所述方法制备的NGAL光激发化学发光检测试剂盒。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、用于NGAL的检测微球和生物素标记的抗NGAL抗体，混合反应；
2)再加入亲和素包被的感光微球进行第二步反应；
3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
本发明利用光激化学发光的方式，即利用感光微球和发光微球之间的单线态氧传递作用来发光，实现两种微球的结合即发光，使检测特异性提高；发光材料包裹在发光微球的颗粒中，不容易受环境干扰，有更高的特异性和稳定性；本发明制备试剂盒过程中，采用羧基化发光微球和单克隆抗体进行偶联，反应时间比现有的醛基化发光微球偶联时间短，且反应效率高，有利于提高试剂的检测灵敏度。本发明在抗NGAL抗体偶联发光微球步骤中同时加入新鲜配置的EDC，使偶联抗体效率更高，在测试时标准曲线的线性更好，测试准确性更高。
附图说明
图1为本发明实施例提供的NGAL光激发化学发光检测试剂盒检测原理示意图。
图2为本发明实施例提供的NGAL光激发化学发光检测试剂盒检测线性范围图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例1.
1.发光微球与抗体连接：
(1)抗体、微球准备：将0.1mg抗体加入到超滤管中，离心8min，用缓冲液(pH8.0)PBS缓冲液重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。微球用PBS(pH8.0)重悬为20mg/ml。
(2)活化发光微球(所有试剂使用前回复到室温)
量取1mg发光微球，加入1mLPBS(pH7.4)后涡旋，悬液加入到1.5mL离心管中，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的清洗缓冲液PBS(ρΗ7.4),0.05％Tween-20悬浮，震荡并超声后12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入1mL的PBS缓冲液(pH6.2)，接着先加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后，在室温震摇20分钟。12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入1m L的磷酸盐缓冲液(pH7.2)或者硼酸盐缓冲液(pH7.8)悬浮发光微球。
(3)抗体偶联发光微球
取NGAL单克隆抗体1-50μg加入到1mL上述活化后的发光微球中，室温震荡2小时。12000g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的PBS缓冲液(1％BSA,ρΗ7.4)悬浮发光微球，在室温震摇30分钟，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的PBS缓冲液(0.1％BSA，0.02％Tween-20,pΗ7.4)洗涤发光微球，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的PBS缓冲液(0.1％BSA，0.02％Tween-20,含0.05％Proclin-300，pΗ7.4)悬浮发光微球，于4℃避光保存备用。
2.生物素与抗体连接：
(1)抗体准备:将另一株1mg抗NGAL抗体加入到超滤管中，离心8min。用缓冲液(pH8.0)PBS或碳酸缓冲液重复洗涤6次后，抗体稀释到5mg/ml备用。
(2)生物素化：将20μL上述抗体溶液中加入7.6μL2mg/mL生物素中(用DMSO配制)，室温振动孵育4h。
(3)抗体洗涤：超滤管超滤去除多余的生物素。
3.亲和素标记感光微球
在离心管中加入1mg感光微球，加入1.25μL质量浓度10％的Tween-20、0.1mg亲和素、10μL硼氢化氰钠(0.4M)，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液或者0.1M Hepes缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时；加入10μL0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接亲和素的感光微球，稀释后备用。
实施例2
1.发光微球与抗体连接：
(1)抗体、微球准备：将0.1mg抗体加入到超滤管中，离心8min，用缓冲液(pH8.0)PBS缓冲液重复洗涤6次后，抗体稀释到1mg/ml备用。微球用PBS(pH8.0)重悬为20mg/ml。
(2)活化发光微球(所有试剂使用前回复到室温)
量取1mg发光微球，加入1mLPBS(pH7.4)后涡旋，悬液加入到1.5mL离心管中，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的清洗缓冲液PBS(ρΗ7.4),0.05％Tween-20悬浮，震荡并超声后12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入1mL的PBS缓冲液(pH6.2)，接着先加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后，在室温震摇20分钟。12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入1mL的磷酸盐缓冲液(pH7.2)或者硼酸盐缓冲液(pH7.8)悬浮发光微球。
(3)抗体偶联发光微球
取NGAL单克隆抗体1-50μg加入到1mL以上步骤(2)活化后的发光微球中，接着加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，室温震荡2小时。12000g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的PBS缓冲液(1％BSA,pΗ7.4)悬浮发光微球，在室温震摇30分钟，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的PBS缓冲液(0.1％BSA，0.02％Tween-20,pΗ7.4。)洗涤发光微球，12000g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的PBS缓冲液(0.1％BSA，0.02％Tween-20,含0.05％Proclin-300，pΗ7.4)悬浮发光微球，于4℃避光保存备用。
2.生物素与抗体连接：
(1)抗体准备:将另一株1mg抗NGAL抗体加入到超滤管中，离心8min。用缓冲液(pH8.0)PBS或碳酸缓冲液重复洗涤6次后，抗体稀释到5mg/ml备用。
(2)生物素化：将20μL上述抗体溶液中加入7.6μL2mg/mL生物素中(用DMSO配制)，室温振动孵育4h。
(3)抗体洗涤：超滤管超滤去除多余的生物素。
3.亲和素标记感光微球
在离心管中加入1mg感光微球，加入1.25μL质量浓度10％的Tween-20、0.1mg亲和素、10μL硼氢化氰钠(0.4M)，用0.1M、pH6.0的2-(N-吗啉)乙磺酸MES缓冲液或者0.1M Hepes缓冲液将体积补充到200μL，37℃避光振荡反应48小时；加入10μL0.3M、pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1小时后离心，分离得到已连接亲和素的感光微球，稀释后备用。
实施例3
试剂盒的制备
按所述用量取各组分：
加入90mL水溶解后调节pH到7.4，水补足到100mL，制成分析缓冲液。
(1)使用分析缓冲液稀释偶联NGAL抗体的发光微球(实施例1或2中制备)浓度到50μg/mL；
(2)使用分析缓冲液稀释生物素化抗体，抗体浓度调整为0.5mg/mL；
(3)使用分析缓冲液稀释偶联亲和素标记感光微球为80μg/mL。
实施例4
检测实施例1试剂盒线性：
配制浓度为0ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL、5000ng/mL的NGAL标准品溶液。在96孔板中每孔分别加入20μL标准品(终浓度0ng/mL–5000ng/mL)每孔分别加入40μL生物素化抗NGAL抗体，终浓度4nM。每孔加入40μL偶联抗NGAL抗体的发光微球(浓度50μg/mL)。室温暗处温育0.5-1小时加入100μL亲和素偶联的感光微球，终浓度40μg/mL，室温暗处温育0.5-1小时后上机读数。
如上用本发明实施例1所制备的NGAL含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线(见附图2)。
检测实施例2试剂盒线性：
配制浓度为0ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL,、5000ng/mL的NGAL标准品溶液。在96孔板中每孔分别加入20μL标准品(终浓度0ng/mL–5000ng/mL)每孔分别加入40μL生物素化抗NGAL抗体，终浓度4nM。每孔加入40μL偶联抗NGAL抗体的发光微球(浓度50μg/mL)。室温暗处温育0.5-1小时加入100μL亲和素偶联的感光微球，终浓度40μg/mL，室温暗处温育0.5-1小时后上机读数。
如上用本发明实施例2所制备的NGAL含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线(见附图2)。从附图2可以看出本发明实施例1所制备的检测试剂盒能保持良好的线性，NGAL浓度为5000ng/mL时方法无Hook效应.与丹麦Bioporto Diagnostics公司NGAL检测试剂盒具有较好的相关性(R2＝0.9988)，实施例2的结果表明在混合蛋白和活化微球的同时加入新鲜配置的EDC后，偶联的抗体效率更高。测试的时候，标准曲线的线性更好，测试准确性更高。
实施例5
本发明实施例2的检测试剂盒准确度及精确性检测试验
分别测定3组低值(200ng/mL)、中值(600ng/mL)、高值(800ng/mL)，对各血清质控品进行测定，各设20个复孔，计算各质控品检测值的均数、标准差及CV值。批内和批间变异系数(CV)分别为4.89％～5.93％和6.76％～8.96％。
表1检测试剂盒准确度及精确性检测
实施例6
本发明实施例2检测试剂盒的灵敏度测定
检测10次生理盐水和100ng/mL的样本，记录光强度数值，计算平均值和标准偏差，算出。分析灵敏度＝样本浓度×最低检出限/光强度均值。
测定的灵敏度实验数据：100ng/mL的样本光强度平均值为25820，空白生理盐水的－为1740。在标准曲线上反求浓度，结果显示试剂盒分析灵敏度达到6.74ng/mL。
表2检测试剂盒灵敏度检测数据
| 次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | MEAN | SD |
| 盐水 | 1720 | 1667 | 1682 | 1700 | 1688 | 1677 | 1669 | 1711 | 1691 | 1680 | 1688.5 | 17.40 |
| 样本 | 25866 | 25855 | 25766 | 25780 | 25797 | 25831 | 25877 | 25785 | 25765 | 25879 | 25820.1 | 46.53 |
实施例7
本发明实施例2检测试剂盒的干扰性实验：
检测本实施例2的光激化学发光免疫分析试剂在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。将血红蛋白溶液(5mg/mL)分别取适量加入到1mL的NGAL阳性血清标本中，使血清中血红蛋白的含量分别为1mg/mL、0.5mg/mL。将甘油三酯溶液(5mg/mL)分别取适量加入到1mL的NGAL阳性血清标本中，使血清中甘油三酯的含量分别为1mg/mL、0.5mg/mL。将胆红素溶液(5mg/mL)分别取适量加入到1mL的NGAL阳性血清标本中，使血清中胆红素的含量分别为50ng/mL、25ng/mL。对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的NGAL阳性标本进行测定，在96孔板中每孔分别加入20μL含加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的NGAL阳性标本，每孔分别加入40μL生物素化抗NGAL抗体，终浓度4nM。每孔加入40μL偶联抗NGAL抗体的发光微球(浓度50μg/mL)。室温暗处温育0.5-1小时加入100μL亲和素偶联的感光微球，终浓度40μg/mL，室温暗处温育0.5-1小时后读数。将理论浓度与实测浓度的比值作为回收率，回收率在94.98％-105.97％之间。表明NGAL光激化学发光试剂在检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。
表3血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰实验
本发明的原理(见附图1)是通过在均相条件下将偶联了抗NGAL抗体3的带有酞菁染料的感光微球1、包被有二甲基噻吩、蒽、红荧烯等活性分子且带有铕螯合物、偶联了抗NGAL抗体3的发光微球2以及检测样本4混合。此时感光微球1和包被有活性分子的发光微球2可通过偶联的抗NGAL抗体3迅速有效地识别检测样本4的目标分子而形成免疫夹心复合物。在激光(波长为680nm)的照射下，感光微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至发光微球，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在发光微球上的荧光基团，使之发出荧光，波长为520～620nm。单体氧的半衰期为4μs，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作用，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有荧光信号产生。本发明在制备试剂盒过程中采用羧基化发光微球和单克隆抗体进行偶联，反应时间比现有技术中常用的醛基化发光微球偶联时间短，且反应效率高，有利于提高试剂的检测灵敏度。本发明在抗NGAL抗体偶联发光微球步骤中同时加入新鲜配置的EDC，使偶联抗体效率更高，在测试时标准曲线的线性更好，测试准确性更高。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本材料的技术实施方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)活化发光微球；
(2)抗NGAL抗体偶联发光微球；
(3)生物素标记抗NGAL抗体；
(4)亲和素标记感光微球。
2.如权利要求1所述的制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：步骤(1)中，将发光微球通过配制的碳二亚胺及Sulfo-NHS溶液在PBS缓冲液中活化，所述发光微球为羧基修饰发光微球，所述发光微球中包被有二甲基噻吩、蒽、红荧烯且带有铕螯合物。
3.如权利要求1所述的制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：步骤(2)中，将抗NGAL单克隆抗体与活化的发光微球混合反应以偶联抗体到微球上，并且在混合抗体和活化微球的同时加入了新鲜配置的碳二亚胺
4.如权利要求1所述的制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述新鲜配置的碳二亚胺为50mg/mL，偶联方法为室温震荡2小时。
5.如权利要求1所述的制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：所述抗NGAL抗体偶联发光微球步骤中，发光微球与NGAL抗体的质量比例为10-50：1。
6.如权利要求1所述的制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：所述生物素标记抗NGAL抗体步骤中，生物素与抗体的分子比例为10-50：1。
7.如权利要求4所述的制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：所述生物素与抗体的分子比例为为30:1。
8.如权利要求1所述的制备NGAL光激发化学发光检测试剂盒的方法，其特征在于：所述感光微球带有酞菁染料。
9.根据以上任一权利要求所述方法制备的NGAL光激发化学发光检测试剂盒。
10.如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)在试剂盒的反应孔中加入样品、用于NGAL的检测微球和生物素标记的抗NGAL抗体，混合反应；
2)再加入亲和素包被的感光微球进行第二步反应；
3)激发光照射反应孔，测量每个反应孔发光量获得光信号值。
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 430206 B11 building, No. 818, hi tech medical center, hi tech Avenue, East Lake Development Zone, Wuhan, Hubei, 2 Patentee after: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK CO., LTD. Address before: 430206 hi tech medical equipment Park No. 818, hi tech Avenue, East Lake Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan, B11 Patentee before: Wuhan Life Origin Biotech Co., Ltd. |
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Denomination of invention: NGAL (Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin) optical excitation chemiluminescence detection kit and preparation and use methods of kit Effective date of registration: 20180612 Granted publication date: 20160518 Pledgee: Wuhan rural commercial bank Limited by Share Ltd Optics Valley branch Pledgor: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK CO., LTD. Registration number: 2018420000024 |
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Date of cancellation: 20190620 Granted publication date: 20160518 Pledgee: Wuhan rural commercial bank Limited by Share Ltd Optics Valley branch Pledgor: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK CO., LTD. Registration number: 2018420000024 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: NGAL (Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin) optical excitation chemiluminescence detection kit and preparation and use methods of kit Effective date of registration: 20191107 Granted publication date: 20160518 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co., Ltd. Pledgor: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK CO., LTD. Registration number: Y2019420000025 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20201223 Granted publication date: 20160518 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK Co.,Ltd. Registration number: Y2019420000025 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 430000 1 / F, 2 / F and 3 / F, B11, hi tech medical device Park, 818 Gaoxin Avenue, Donghu Development Zone, Wuhan, Hubei Province Patentee after: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK Co.,Ltd. Address before: 2 / F, B11, Gaoke medical equipment Park, 818 Gaoxin Avenue, Donghu Development Zone, Wuhan Patentee before: WUHAN LIFE ORIGIN BIOTECH JOINT STOCK Co.,Ltd. |
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| CP02 | Change in the address of a patent holder |