JPH0235365A - 抗原性物質の存在もしくはその濃度を決定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血清などの流体中における抗原性物質を検出
および／または該物質の濃度を測定する方法例関する。

他の局面から見ると、本発明は免疫学的、抑制試験法に
係る。更に別の局面から見ると、本発明は単クローン性
抗体に関する。

種々の身体的疾患に伴う、例えば血清もしくは他の体液
中の抗原性物質の存在もしくは濃度の決定は、近時ます
ます免疫学的測定法に頼る傾向となってきている。この
方法は、扶育すべき抗原性物質と抗体（／または複数）
との間における錯体の形成に基いておｐ１該錯体の７も
しくは他の成分が、例えば１２５Ｉ　　などの放射性物
質によシ標識され、それによって錯化された標識抗原も
しくは抗体と錯化されなかった標識抗原または抗体とを
分離した後、抗原の検出および／または定量分析が可能
となる。

競合免疫学的測定法においては、存在を試験すべき流体
試料中の抗原物質と既知量の標識抗原とが限定量の抗体
の結合サイトラ奪い合う。かくして、抗体に結合した標
識抗原の量は試料中の抗原の量に反比例する。これとは
対照的に、免疫学的測定では標識抗体を使用する。かか
る検定においては、前記錯体に関与する標識抗体の量は
流体試料中の抗原性物質の量に比例する。

免疫学的検定は、とシわけ多価抗原、即ち同時にコまた
はそれ以上の抗体と錯化し得る抗原性物質の検出に対し
て適していることがわかった。このような検定は、典型
的には被検流体試料中に不溶な固体担体に結合した標識
されていないある量の抗体および放射性同位体などの標
識を有するある量の可溶性抗体を利用し、該同位体によ
って固相抗体、抗原および標識抗体との間に形成される
三元錯体の検出および／またはその量の定量的見積りが
可能となる。

当業界において公知の免疫学的検定においては、典型的
には“前”検定がオリ用され、ここでは固相に結合した
抗体を、まず被検試料と接触させて、二元固相抗体即ち
抗原錯体を形成することによって抗原を試料から抽出す
る。適当なインキュベーションの後、該固体担体を洗浄
して、存在するかもしれない未反応抗原を含む流体試料
の残渣を除去し、次いで既知量の標識抗体を含む溶液と
接触させる。

該標識抗体を、標識してない抗体を介して固体担体に結
合した抗原と錯化することを可能とする第スのインキュ
ベーションの後、該固体担体のコ度目の洗浄を行って、
未反応の標識抗体を除去する。抗原が被検試料中に存在
するか否かを決定するための簡単な”イエス／ノー”試
験において、洗浄した固体担体は、例えば標識が放射性
元素である場合には放出される放射能を測定することに
よｐ１標標識体の存在を検出するために試験される。検
出された標識抗体の量は、該抗原を含まないことが知ら
れている負の対照試料に対する値と比較される。負の対
照によシ示されるバックグラウンド水準を実質的に越え
る量で標識抗体を検出することは、問題とする抗原の存
在を示すものと解釈される。定量的検出は、標識抗体の
量と該抗原の既知量を含む較正試料について得られた量
と全比較することによｐ達成することができる。

この種の検定りしばしば「ａ−サイト」もしくは「サン
ドウィッチ」検査といわれる。というのは抗原がその表
面の異った位置に結合した２つの抗体を有するからであ
る。このおよびこれに関連する技術はＷｉ　ｄｅ　　の
「放射線免疫検定法（Ｒａｄｉｏｉｍｕｎｏａｓｓａｖ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　Ｊ　／　９９−２０６頁（／９り
０　）　、　Ｋｉｒｋｈａｍ　＆　Ｈｕｎｔｅｒ監修、
Ｅ、　＆Ｓ。

Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ　　に
記載されている。

１２５Ｉ　　標識抗体を使用する血清肝炎に関連する抗
原の検出のためのこの技術による検定は米国特許第３２
ｇ乙７．Ｓ／り号に記載されている。

これらの大きな有用性にもかかわらず、従来の免疫学的
検出法は時間のかかる手法でおることが認識されている
。というのは一部には二度の洗浄工程が必要とされるか
らであり、また平衡即ち時間の増加に伴う形成された錯
体の量の変化が生じなくなる点、の達成のために長期に
亘るインキュベーションが必要とされることによる。

この方法に関連する洗浄工程の少なくとも１つを排除す
るために、いわゆる″同時”および”逆“検定法が提案
されている。同時検定法は固体担体に結合した抗体およ
び標識抗体両者が同時に被検試料に添加された際におけ
るただ７度だけのインキュベーション工程を含んでいる
。このインキュベーションの後、固体担体を洗浄してｔ
Ａ１ミ体試料の残渣並びに錯化しなかった標識抗体を除
去する。

該固体担体と会合した標識抗体の存在は、次いで従来の
″ｎ１１”サンドウィッチ検定におけるようＫして検出
される。

連棟定法は段階的添加を含み、その第１は標識抗体溶液
の流体試料への添加でおシ、引き続き適当ナインキュペ
ーションの後固体担体に結合した標識されていない抗体
の添加が行われる。第二のインキュベーション後、該固
体相ヲ常法に従って洗浄して、被検試料の残渣並ひに未
反応標識抗体の溶液を除去する。次いで、固体担体と会
合した標識抗体の決定げ同時並びに前検定法におけると
同様にして行われる。

同時並ひに連棟定法両者においては、存在する抗原の殆
どもしくは全てを結合するために十分に過剰量の固相抗
体を使用して、人為的に負のもしくは低い抗原量が極め
て高い抗原濃度の下で観察される高量フック作用（ｈｉ
ｇｈ　ｄｏｓｅ　ｈｏｏｋ　ｅｆｆｅｃｔ）を避けるこ
とが必要とされる。このために、前検定法が西業者にと
っては好ましい方法であった。

これが前検定法が当業者によって好まれる理由である。

またこれが、十分な抗原結合能を有する固相を製造する
ために、問題とする抗原に対して特異的な、高純度の、
活性な抗体を、従来法において使用されていた”多クロ
ーン性”抗体から大量に得ることが困難であった理由で
ある。免疫原性物質が生体中に導入された場合、該生体
の免疫系が該免疫原性物質を認識する免疫原上の各サイ
トに抗体を生成することにより応答する。大きな免疫原
性蛋白分子は数十のサイトを有し、異種細胞は数百のサ
イトを有し得る。かくして、細胞をつくる各抗体は単一
の抗原性サイトに対して特異的な抗体をつくるが、免疫
系Ｖ′ｉ認識された各免疫原性サイトに対して、細胞を
つくる％異的抗体種を発生する。更に、生体は問題とす
る抗原以外の抗原に対する抗体な比較的大量に生成する
ので、多クローン性混合物中の抗体の大部分は問題とす
る抗原に対して特異的ではない。従って、従来の免疫学
的検査において使用されていた抗体は必然的に１多クロ
ーン性”であった。というのは、この抗体が動物中に普
通の様式で生じる抗血清から誘導され、かつこれらの精
製が困難であるからである。かかる抗体の親和性精製法
は一般に時間のかかる、低収率を与える、かつ高い親和
性の抗体の損失をまねくものであった。

前記逆および同時検定において、従来の多クローン性抗
体混合物を使用した場合、異ったサイトにおいて抗原と
錯化する、ユまたはそれ以上の標識抗体により錯化され
た抗原を含む“す／ドイツチ”の形成が可能である。被
検試料中における可溶性を維持し得るこれらの錯体は次
の洗浄工程により除去されるので、固相が固相に結合し
た標識抗体について分析される際には計算されない。こ
れがかなシの程度で起こつ７′ｉｃ場合、検定の感度は
減少し、誤った結果を与える。しかしながら、標識され
ていない結合抗体を、前記の前サンドインチ検定におけ
るようにまず試料に添加すると、立体的考察から、標識
抗体が排除され、かつ抗原に結合されている１、２また
はそれ以上の標識されていない抗体に錯化された抗原を
含むサンドインチの形成が妨げられる。従って、該抗原
汀標識抗体分子と自由に反応する。それにもかかわらず
、固相に結合した大過剰の標識してない抗体を使用して
可溶性標識抗体による可溶性錯体の形成を最小化するこ
とによって、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ）に対
する同時検定法を利用することが提案されていた。Ｊｅ
ｏｎｇ等の”ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ）の検
出に適用される放射線免役検定（ＲＩＡ）と固有の単一
一インキュベーションコーサイト免疫学的放射線検足（
ＩＲＭＡ）との比較”Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　／　９７９参照のこと。

同時検定の変法が米国特許第ｑ、７７４．３ｇ’ｌ−号
に記載されている。この検定においては、抗免疫グロブ
リン１ｇＧ（ヒト）の別々の部分が夫々螢光性発色団（
フルオレセイン）および発色団（ロダミノ）、これはフ
ルオレセインから放出される光を吸収する、によって標
識される。可溶性状態にある両抗体はヒ）ＩｇＧを含む
試料と接触させられる。

抗−ＩｇＧとＩｇＧとの反応は７００八もしくはそれ以
下の相互に十分近接した二種の発色団をもたらし、螢光
性発色団により発せられた光は他方の発色団によＱ吸収
（消光）される。試料の最大螢光の割合を決定し、試料
中のＩｇＧｏ）ｉの尺度として使用される。

ＨＴ　Ｓ　Ｈ，肝炎関連抗原（ＨＡＡ）および癌胎児性
抗原（ＣＥＡ）に対して、標識抗体を保証するのに十分
な標識抗体の量、ただし抗原錯体を形成するが、試料中
に存在するすべての抗原の゛サンドインチ”を形成する
には不充分な量を使用することによシ逆検定を応用する
ことが提案されている。

米国特許第’１．０９ｇ、ｇ’７１．号参照のこと。

湧業者に公知の３つのすべての手続きが抗体の多クロー
ン性混合物を使用しているので、試験すべき抗原以外の
流体もし２くは血清中の他の物質との交叉反応の可能性
が大きくなる。他の抗原との交叉−反応性の出現はまた
、問題とする抗原の試験の感度を減じ、かつ″誤った一
正”の検定の可能性を増す。更に、同時もしくは連棟定
において多クローン性抗体を使用することは、固相抗体
および／または存在する抗原の量に関して、使用すべき
標識抗体の量の注意深゛Ｊ−４考察をｌ要とする。

螢光の消光を利用する場仕には、感朋が低い。これは螢
光発色団と消光発色団との間の最小間隔が、多クローン
性抗体を使用した場合には、保証されないことによる。

これら諸欠点から、当業界において公知の免役的手法の
限界はまったく明らかである。従来の前検定はよｐ少な
い工程数で達成されるが、大量の固相特異的抗体を必要
とし、かつ低（８度の抗原の検出には不適尚である。な
んとなれば、抗原と多数の標識抗体分子とのサンドイッ
チの形成が、結合した抗体、抗原、標識抗体を含むサン
ドインチの形成と魅合し、もしくは螢光の消光を利用す
る場合には、螢光発色団と消光発色団との対形成なしに
、サンドイッチが形成される可能性がある。

しかも抗体の多クローン性に基く正の誤差の誤った解釈
に導く。

そこで本発明の目的は、改良された阻害試験法を提供す
ることである。

本発明によれば、単クローン性抗体は阻害試験において
使用される。このような試験において、既知量の抗原お
よび単クローン性抗体が、該単クローン性抗体に添加さ
れた既知抗原に対応する抗原を含む、問題とする試料と
接触させられる。抗体と抗原との間の錯体の阻害が、単
クローン性抗体と試料からの抗原とを含む錯体が形成す
るために生じ、その程度は被検定試料中における抗原の
存在および／または量の尺度となる。

更に、本発明によれば、以下の工程を含む、流体中の抗
原性物質の存在もしくはその濃度を決定する方法が提供
される （ａ）　　流体試料を、添加された既知量の抗原性物質
および抗原性物質と結合する単クローン性抗体と接触さ
せる工程、および （ｂ）　　該抗、体と添加された抗原性物質との間の錯
体の形成の阻害を、該単クローン性抗体と該流体内の抗
原性物質とを結合して第コの錯体を形成することによシ
測定する工程。

好ましい具体例においては、抗体と抗原とは夫夫一対の
螢光発色団と消光発色団の一方のものと結合する。標識
抗原と抗体との間の錯体の形成を、被検試料中の抗原に
よｐ阻害することによシ、消光の程度の減少および螢光
の増大が起こる。消光の阻害の程度は、試料中における
抗原濃此の尺度である。他の好ましい阻害試験の具体例
においては、既知の抗原と抗体との元の錯体は、凝集体
形成を可能とする大きさの例えばラテックス粒子などの
粒子に結合する。抗原を含む、問題とする試料を抗体と
接触させて抗原を結合させる場合、凝集体形成の阻害が
、凝集体を形成し得ない試料の抗原と結合した抗体との
間で錯化が起こるために生じる。凝集の減少Ｖ：ｉ濁度
測定法を利用することによｐ測定することができる。

上で述べたように、本発明によれは抗原好物質に対する
免疫学的検定法において使用されていた多クローン性抗
体が単クローン性抗体で置換される。同様に、単クロー
ン性抗体が抑制試験例おいて使用される。本発明は、多
価抗原性物質を含めて、極めて広範な種々の抗原性物質
の存在もしくはその濃度の決定のために有用である。従
って、本明細書で使用する用語「抗原」または「抗原性
物質」は抗体を生成する広範囲の物質を意味する。

このような物質として、特に・・ブテン、ホルモン、例
えばインシュリンおよびヒト甲状腺刺激ホルモｙ　（Ｈ
ＴＳＨ）　、ｒ−ｆロブリン、アレルゲン、ウィルス、
ウィルスサブユニット、細菌、弧線に関るもの並びに動
物褐敢などの毎累およびある種の薬剤などを例示するこ
とができる。本発明の方法によって検定することのでき
る特定の抗原としてＶｉ癌胎児性抗ｙＡ（ＣＥＡ）、肝
炎ウィルスＡおよびＢ１肝炎ウィルスノン（Ｎｏｎ　）
　Ａおよびノン８１ｇＥ並びにα−フエトグロテインを
例示することができる。

本発明において有用な単クローン性抗体はＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ　＆にｏｈｌｅｒによυ議論され、Ｎａｔｕｒｅ　
。

２５乙、４１３−４ｔヲクＣ／９７３）に報６された方
法によって得ることができる。この方法の詳細は周知で
あシ、ここであらためて述べるにはあたらないであろう
。しかしながら、基本的にはこの方法はネズミもしくは
他の適肖な動物に免疫原を注射することを含んでいる。

このネズミは次いで殺され、その牌臓から取り出された
細胞を骨髄細胞で融解する。得られるものはノ・イブリ
ッド細胞で「ノ・イブリドーマ」と呼ばれ、生体外で再
生される。ノ・イブリドーマの集団を篩別し、個々の分
枝系を単離するように処理され、各分枝系は抗原に対す
る単一の抗体種を分泌する。このようにして得られた個
々の抗体種は、免疫原性物質上で認識された特定の抗原
性サイトに応答して生成された、免疫性動物からの単一
Ｂ細胞の生成物である。

免疫原性物質が生きている宿主中に導入された場合、該
宿主の免疫系は該免疫原性物質上の認識し得るすべての
サイトに対する抗体を生成することによシ応答する。侵
入物に対抗するために抗体を生成するこのよりな゛ショ
ットガン゛′的対応は該免疫原性物質に対して異った親
和性並びに特異性を有する抗体の生成に導く。従って、
種々のノ・イブリドーマ細胞系を選別して、所定の抗原
に対する抗体を製造するものを固定した後、個々のノ・
イブリドーマ細胞系によって生成された抗体を選別して
、本発明において使用することを決めるに先立って、固
有の生産を模倣する免疫原性物質に対して最も高い親和
性を有するものを固定することが好ましい。この規準に
基く選択が、従来法において使用された多クローン性抗
体と比較して、単クローン性抗体を使用する本発明の免
疫学的検定並びに抑制試験における高い感度を達成する
のに役立つものと考えられる。該多クローン性抗体は抗
原に対する親和性として、よくても免疫系により生産さ
れるすべての抗体の親和性、のほぼ平均値を有するにす
ぎない。選ばれた単クローン性抗体は所定の感度に匹敵
する顆、相性を有し、対象とするテスト系に対する範囲
内にあることが好ましい。抗体は少なくとも１０８２１
モル、更に好ましくは少なくとも約ｉｏ’ｔ７モルの親
和性を有することが望ましい。

更に）最も高い親和性を有するこれらの単クローン性抗
体を、従来の多クローン性抗体を使用した方法で誤った
正のＩｆ：ｉ果を与えることが知られている試験体につ
いて模擬検定を行うことにより１更に選別して、交叉反
応を示さずかつ誤った正の結果を与えない単クローン性
抗体を同だすることができる。

Ωサイト免疫学的検定は抗体：抗原：抗体サンドインチ
の形成に基いているので、通常抗原に対する相互の結合
を妨害しない、２種の異った単クローン性抗体が結合抗
体および可溶性標識抗体もしくは餐光消光法が使用され
た際における抗体対として選ばれる。三者が前記サンド
イッチを完成するのに必要とされるので、逆並びに同時
検定に、例えば標識抗体：抗原：標識抗体なる錯体が形
成されるという懸念なしに行うことができ、かかる錯体
の形成は固相と結合する抗体と抗原との間の錯体形成を
妨害する。ここに本発明の特別の利点がある。更に、前
検定は中間的洗浄工程を経ることなしに達成できる。と
いうのに１１１記２種の抗体が２種の異ったサイトに結
合するからである。我々はこのような方法を゛急速前（
ｆａｓｔ　ｆｏｒｗａｒｄｌ”検定と呼ぶ。

しかしながら、特に前検定の場合において、抗原性物質
が十分な間隔を有する同等な抗体結合サイトを有してお
シ、その結果／よシ多くの抗体分子が同時に結合するこ
とが可能である場合には、同一の単クローン性抗体を標
識抗体並びに固体担体に結合した抗体、両者に対して使
用することができる。このような系において、初めに試
料に結合抗体を添加することにより、サンドイッチの形
成が阻止されるが、これは立体的障碍によるものである
。次いで標識単クローン性抗体が添加されると、固体担
体上の未標識抗体と結合した抗原と錯化することも可能
である。

被検試料から抗原性物質を抽出するための本発明の方法
において使用する未標識単クローン性抗体は免疫学的検
定において普通に使用されているいずれかの担体上に固
定することができる。これらの中でＦ紙、プラスチック
ビーズもしくはポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロ
ピレンもしくは他の適当な物質でつくられた試験管を例
示することができる。また、アガロース、架橋デキスト
ランおよび他のポリサッカライドなどの粒状物質も有用
である。抗体全このような物質に結合するための方法は
旨業者には周知のことである　例えば、抗体を米国特許
第３．ろ’Ｉｓ　、　３３２号に記載された方法を利用
することによシ、ポリサッカライドポリマーに結合する
ことができる。

本発明において使用する標誠単クローン性抗体には従来
の免疫学的検定において使用されているものと同じ標識
を与えることができる。この中で、螢光法による検定に
対しては米国特許第３．９１１．０．’ｌ’７３号に記
載されているように螢光発光性標識を、米国特許第３．
乙ｓ１１．ｏｙｏ号におけるような酵素系標識を例示す
ることができる。現在のところ、抗体を　　■　などの
放射性同位元素によって、例えばＨｕｎｔｅｒ　＆　Ｇ
ｒｅｅｎｗｏｏｄ　、のＮａｔｕｒｅ　。

／ググ、９グ、！Ｘ／？Ａ２）に記載されたもしくはＤ
ａｖｉｄ等のＢｉｏｃｈｅｗｉｓｔｒｙ　、　／３１０
／’１−１０，２／（／９７４ｔ）に記載された手法を
利用して、標識することが好ましい。

典型的検定においては、不溶性サンドイッチ錯体と会合
する標識抗体の量は適当な手段によって不溶状抗体物質
を検査することによって決められる。しかしながら、被
検流体試料中の抗原の存在もしくは不仕を、検定中に反
応せずに可溶形で残された標識抗体の量に関連ずけるこ
とも可能である。多クローン性抗体と比較して、単クロ
ーン性抗体を使用する本発明の免疫学的検定の利点は以
下の実施例を参照することによって理解されよう。

この実施例においてハ、ｑつの対照検定、同時検定、連
棟定、前検定および「急速」前検定を、単クローン性抗
体および多クーロン性抗体を使用し、かつ正の試料とし
てヒトＩｇＥを１０ＯＩＩＪ／ｍｌ含有する標準血清を
使用して行った。負の対照として、ｇＥを含まない常態
の馬の血清を使用した。

試料中における標識抗体として使用した、ＩｇＥに対す
る多クローン性抗体はＰｈａｒｍａｃｉａＤｉａｇｎｏ
ｓｔｌｃｓ　ｏｆ　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　（Ｎｅｗ　
Ｊｅｒｓｅｙ　）　　がら得た。固体担体に結合した多
クローン性抗体はＴａｇｏ、　Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ　（Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）から得た
。

ｇＥに対する単クローン性抗体は前述のＭｌｌｓｔｅｉ
ｎ　＆　Ｋｏｈｌｅｒの方法を利用して得た。二種の抗
体としては、各々１０９　ｔ１モルより大きなＩｇＥに
対する親和性を示すものが選ばれ、これらはＩｇＥに対
する他のものの結合を妨害しなかった。

検定はアガロースに結合した未標識抗体を使用し、米国
特許第３．Ａり左２ｇ左ユ号に記載の方法により行った
。抗体の標識１″ｌ：Ｄａｖｉｄ等の前述の方法に従っ
て１２５１に　よって行った。燐酸塩で緩衝した塩水（
ｐＨ７、’Ａ　）　ｋ、すべての試料を洗浄するために
使用した。

実施例 ／）同時検定法 アガロース粒子上に固定した抗体のＭ、濁液１０゜μｔ
ｋ１００μｔの検体（血清）および７００μｔの可溶性
　　Ｉ　で標識した抗体と混合して、一対の試料につい
て実施した。この混合物全以下の第７表（多クローン性
抗体）および第２表（単クローン性抗体）に示した所定
の時間および更に３０分間インキュベーションした。余
分の３０分間のインキュベーションは、第ユの添加試薬
に対する追加の３０分間のインキュベーション時間が必
要とされる他の検定法と水沫とン同−条件とするために
加えられた。インキュベーション期間の経過後、アガロ
ース粒子を緩衝液を添加して洗浄し、次いで遠心分離し
た。吸引により洗液を除いた後、得られたアガロース粒
子のペレットを、結合した１２５■−標識抗体について
計数した。特だのインキュベーション時間の後肢錯体の
各々に対して得られた計数値は第１表および第二光に示
す。

、２４ ２）逆積定法 １００μｔ（Ｄ検体（血清１ｆ１００ａｔ（７）可溶性
１２５Ｉ−標識抗体と混合し、第１表および第２表に示
した所定時間インキュベーションして、一対の試料につ
いて実施した。次いで、アガロース粒子上に固定した抗
体の懸濁液を添加し、得られた混合物を更に３０分間イ
ンキュベーションした。次いで、アガロース粒子を洗浄
し、同時検定法におけるように計数した。計数量に第１
表および第２表に示す。

３）前検定法 一対の試料について行った。１００μｔの検定（血清）
を７００μｔのアガロース粒子上に固定した抗体の懸濁
液と混合し、かつ第１表および第６２表に示した所定時
間の間インキュベーションした。このアガロース粒子を
λ、、！ｉ′〜３．０ｙｎｌの緩衝液を添加し、混合後
遠ノし・分離することにより７回洗浄し、液を吸引によ
シ除去した。次いで、可溶性　　Ｉ−標識抗体１００μ
ｔを添加し、混合物を更に３０分間インキュベーション
した。次いで、アガロース粒子を洗浄し、同時検定法に
おけるように計数した。計数値を第１表および第２表例
示す。

ゲ）急速前検定法 検定Ｕ、２度行い、アガロース粒子上に固定された抗体
を含む検体の最初のインキュベーションと可溶性１２５
■−標識抗体の添加工程との間の洗浄工程を省略した以
外は前検定法と同様に実施した。

一対の対照に対する計数値７分並びに多クローン性抗体
および単クローン性抗体全使用してＩｇＥを含有する一
対の試料の検定における計数値７分の結果を第１表およ
び第２表に夫々示した。これらのデータを以下のように
して第１図および第Ω図を作るために使用した。所定の
インキュベーション時間に対する対照の計数値７分の平
均は対応するＩｇＥ検定に対する計数値の平均から算出
した。

差を試料に添加した標識抗体の全計数値７分に対する割
合として計算し、固相に結合した抗体の合計数値７分に
対する割合としてＹ軸上にプロットした。インキュベー
ション時間をＸ　Ｉｉ＋上にプロット　し１辷、。

単クローン性抗体を使用した検定の結果を示す第２図に
示したプロットと多クローン性抗体を使用した検定の結
果を示す第７図とを比較すると、各々の検定、即ち同時
、逆、Ａｉｌおよび急速ＭｉＪ検定において、単クロー
ン性抗体を使用した検定がよシ感度が高いことがわかる
。このことは１００Ｕ　ＩｇＥ／ｄ検定について得られ
た、固相に結合したものの全計数値の冒い割合によって
示される。

予想外にも、同時並びに逆検定の場合において、単クロ
ーン性抗体を使用して行った検定が多クローン性抗体を
使用して行った対応する検定よりも一層急速に平衡に達
することがわかった。従って、これらの手法において単
クローン性抗体を使用することによシ、検定に要する時
間音、単に洗浄工程を省くことにより達成される時間の
節約をはるかに越えて節減することができる。この点に
ついて、単クローン性抗体を使用した逆検定は７時間以
内で平衡に遅した。多クローン性抗体を使用した同様な
検定実験でｒｉグ時間経過するまで平衡に達しなかった
。同様に、同時検定の場合にも、単クローン性抗体を使
用した検定ではｇ時間以内に平衡に達するが、多クロー
ン性抗体を使用した検定でｎ２’１時間以内で平衡に達
することはなかった。結局、本発明は従来法よりも極め
て急速かつ感度の高い同時並びに逆積定法を与え、かつ
可溶性「ザンドイツチ」錯体の形成が所定の不溶性錯体
の形成と競合するという懸念を排除する。

辱 ）　　　）　　　＼ 辱 前述の議論において、焦点はユつのサイト即ちサンドイ
ンチ検定にあった。そこでは抗体の一つは不溶化される
が、他方は分析される媒体中に可溶性である。これ以外
の変法も可能である。好ましい変法の１つでは粒子例え
ばラテックス粒子々とに結合した抗体が使用され、そこ
で各粒子は多数の抗体を担持することになる。第１の単
クローン性抗体が結合するある量の粒子が、例えば第ユ
の単クローン性抗体が結合するある量の粒子と混会さね
、た場合、乳白色の懸濁液が得られる。しかしながら、
試料が多価抗原を含有し、抗体が該抗原に対して特異的
な場合、該試料を前記懸濁液に導入すると、粒子の凝集
もしくは凝着を生じ、容易に検出し得る凝集塊を形成す
る。

凝集体形成の肉眼的検出が、抗原の存在に対する予検試
験において利用することができる。この検出は一方の単
クローン性抗体を担持する粒子の色と、他方の抗体を担
持する粒子の色とを違えることにより促進される。しか
しながら、凝集の程度を試料中における抗原存在ｌの尺
朋として決足することも可能である。例えば、濁度変化
を比濁法などの標準的方法を利用して測定することがで
きる。

現在のところ、当業者に周知の方法を利用して抗体を共
有結合的に結合させたラテックス粒子を使用することが
好ましい。しかし、他の粒状担体を使用することも可能
である。その中で、シリカ、ガラス、細胞、ポリアクリ
ルアミド、ポリメチルメタクリレートおよびアガロース
などを挙げることができる。好ましくは該粒子の粒径は
約０．２〜約７０μの範囲で変化する。肉眼的予検法は
、しかしながら、少なくとも約／、θμの大きさの粒子
を必要とする。

局別の変法において、抗体の一方はビーズ、試験管壁も
しくは他の巨視的固体担体上に固定され、他方の抗体は
ラテックスもしくは他の適当な物質の小粒子に結合され
る。抗原の存在下で、巨視的に結合した抗体と粒子に結
合している抗体との間に抗原を有するサンドインチが形
成される。例えば粒子全着色することにより、サンドイ
ンチの形成を肉眼的に検出することができる。粒子に結
合した抗体の螢光、酵素、放射能もしくは他の標識を、
前述の可溶性抗体を使用する場合と全く同様に、定量的
検出のために使用することができる。

ニーサイト検定の他の好ましい変法においては、二つの
異る単クローン性抗体のうちの少なくとも一つが酵素に
結合される。該酵素は、他の単り四−ン性抗体に結合す
る物質を含む反応を触媒して検出可能な物質を生成する
が、もしくは第２の抗体上の物質と相互作用して錯体即
ち抗体：抗原：抗体の検出を可能とする。検出は、例え
ば比・色決、螢光法、発光法、分光４度法などによって
行うことができる。このような方法を利用すれば、抗体
両者を不溶性とする必要がなく、検定が著しく単純化さ
れることが理解されよう。

現在好ましい具体例においては、第コ抗体上の物質も酵
素であり、検定は酵素で標識した一対の抗体を使用して
、後の反応を触媒芒せる。抗体の一方は他のものが必要
とする生成物を製造する。

これらの反応においては１．２種の抗体が抗原と結合す
るぢ・台、立体的に配向さｊ５、第１酵累反応の生成物
は第ユの酵素で標識さｆｌ、た抗体に近接するように発
生され、第２の反応は第１の反応の生成物が環境の媒質
中に犬きく拡散する前に起こるように、２種の抗体が選
けｊ、る。

この方法全一対の単クローン性抗体を使用して説明する
ことができる。該抗体の／っをヘキソキナ−ｅ（ＨＫ）
で標識し、他の抗体をグルコース乙−ホスフエートデヒ
ドロゲナーゼ（Ｇ−４−ＰＤＨ）で標識し、以下の一連
の反応を行う。

この検定は問題とする抗原を含む試料に、該抗原と結合
する標識抗体、ＡＴＰ、グルコースおよび補酵素ＮＡＤ
　　を添加することにより行われる。

抗原が存在する場合、以下に示すような錯体が形成され
る： ＨＫで標識した抗体は、Ｇ−４−ＰＤＨで標識した抗体
の近傍におけるグルコース−乙−ホスフェートの形成を
触媒し、そこでグルコノラクトン乙−ホスフエートに転
化される。この反応においてＮＡＤＨの還元によって形
成されるＮＡＤＨは分光々暦法により検出することがで
きる。というのは・ジヒドロニコチンアミドが３１０　
ｎｍにおける強い吸収で特徴ずけら１．るからである。

ＮＡＤＨの形成と同様に、グルコースのグルコノラクト
ン−６−ホスフェートへの転化も媒儀中で起こり、これ
は鉛化さ力、なかった標識抗体によって触媒されるが、
二種の抗体が錯体即ち抗体：抗原：抗体において相互に
近接して配置される場合よりも一層低い速度である。従
って、対照試料と比較して３１１．θｎｍ　　における
吸収の増大は試料中における抗原の存在を確的している
。吸収における増加は錯体中の抗原の量とも関係ずける
ことかできる。

連層に標識さ１．た問題とする抗原に結合する抗体を使
用するコーザイト検定において、任意の他の適轟々一対
の連続釣力酵素触媒反応を使用するととができる。その
中で、グルコノラクトンと過酸化水素とを形成し、引き
続きパーオキシダーゼにより触媒されて着色成分を生成
する過酸化水素とＯ−フェニレンジアミンとの反応を伴
うより１１グルコースオキシダーゼにより触媒されるグ
ルコノの反応を挙けることができる。この検定において
は、単クローン性抗体の一層がダルコースオキシダーゼ
で標識さｊｌ、他方はパーオキシダーゼで標識される。

対照と比較して、得られる色の強度は被検試料中におけ
る抗原の存在および／またにその量と関係すげることが
できる。酵左の存在下で、着色成分に酸化し得る他の？
！＋負で０−フェニレン・ソアミンを代替することがで
きるものと理解すべきである。

夫々ＮＡＤオキシドリダクターゼおよびルシフェラーゼ
で標識した、所定の抗原に結合する一対の抗体を使用す
る更に別の適した一連の反応は以ＦＭＮＨ＋ＮＡＤ＋ ＦＭＮ※＋ＲＣＯＯＨ＋ＨＯ ここでＲＣＨＯは典型的には１０またはそれ以上の炭素
原子数を有する直鎖アルデヒドである。

ＦＭＮゞ、即ち励起状態のＦＭＮの発生は光子の放出を
伴い、この光子は被検試料中における抗原の存在および
／またはその賞を示すために、対照試料との相（ハ）関
係から、光学的方法で検出することができる。

酵素で標識した一対の抗体を使用する他の具体例では、
酵素的に触好される第１の反応の生成物は、一連の酵素
触媒反応のアロステリック性活性因子もしくは抑制因子
であり得る。アロステリック性活性因子は第ユの反応に
おいて消費されるというよりもむしろ酵素と相互作用し
て基質に対する親和性を増すか、もしくは酵素−基質錯
体が形成された後、基質を生成物に転化する速度を増大
する。他方、アロステリンク性抑制因子は逆の効果を有
し、基質に対する酵素の親和性全減少もしくは基質の生
成物への転化速度を減する。アロステリック性抑制は競
合的もしくは非競合的型のものであり得る。

夫々ホスホフルクト千ナーゼおよびホスホエノールピル
ベートで標識した一対の抗体を使用する、アロステリッ
ク性活性因子を含む検定の例１は以下のよう々反応を利
用する： （１１フルクト−ノー６−ホスフエート＋ＡＴＰフルク
トース−／、６−ジホスフェート＋ＡＤＰ３７゜ アロステリック性抑制因子を含む検定の例では以ケトゲ
ルトレート １２＋　　　　Ｐ　Ｅ　Ｐ　＋　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ反応（
１１で形成されるフルクトース−／、６−ジホスフェー
トはホスホエノールピルベートカルボキシラーゼとアロ
ステリック的に相互作用して、反応（２１の触媒を活性
化し、ＰＥＰからのオキザロアセテートの形成を活性化
する。反応（３１は囲ま１゜た媒質中で起こり、第３の
単クローン性抗体にマレエートデヒドロゲナーゼを結＠
する必要はない。

問題とする抗原の存在および／またはその量は、３１Ａ
ＯｎｍｖＣおけるＮＡＤＩ−１による吸収の減少と関係
すけることにより測定することができる。、ＮＡＤＨは
反応（３）においてＮＡＤ　　に酸化さｊ、る。

夫々アスノｅルテートアミノトランヌフエラーゼ（ＡＳ
Ｔ）およびホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ
で標識した一対の抗体を使用する、反応（１１で形成さ
れるアヌパルテートはホスホエノールピルベートカルボ
キシラーゼとアロステリック的に相互作用することによ
り第一の反応全抑制する。こｊ２はＮＡＤＨが酸化され
てＮＡＤＨになる速度を減する。従って、ＮＡＤＨの示
す、？　１１０　ｎｍにおける吸収の減少を、被検試料
中における抗原の存在および／またはその童と関係すけ
ることができ、該吸収における減少は抗原が存在するこ
とを示す対照試料について生ずる減少度よりも小さい。

当業者は、第一の酵素により触媒される反応の活性化も
しくは抑制を含む他の多数の反応の対をノーサイト（ｙ
定において使用するために前記したｖ＊：　Ｋ対して代
用し得るととｊ、Ｉ　Ｘ解するであろう。

仙の具体例では、抗体対の一方のみを酵素で標識し・他
方を、例えは該酵素Ｖこより触媒さ１．る反応を生じて
第２の生成物を形成するよう々物質で標識する。該第一
の生成物は比色法、螢光法１発光法、分光４度法もしく
は他の方法によって検出および／または足食し得るもの
である。このような例の７つは一対の単クローン性抗体
を使用し、その−万はパーオキシダーゼにより標識され
、他方はルミノールで標識され、以下の反応を生ずる；
ルミノール この反応により放出された光子（ｈν）は光学的方法に
より検出することができ、被検試料中における抗原の存
在および／またはその量と関係ずけることができる。

ニーサイト検定の好ましい面別の変形では、夫々螢光発
色団および該螢光体の放出する波長の光を吸収し得る消
光発色団と結付した２種の単クローン性抗体が使用さｊ
、る。この、２浄の抗体は、とｊ、らと特異的な抗原と
結合した際に、これらユっの発色団が十分に接近して配
置されて、螢光体から放出さｊ、た光を他の発色団が吸
収し得るように選ばれる。通常、とｊ、らは相互に約７
００Ａ以内、好ましくは５ＯＡ以内におかノ］、る。適
当な抗体の選択は予検法を介して行われ、そこでは螢光
体および消光体で標識された抗体の混合物が既知景の抗
原を含む試料と接触させられる。螢光の減少は前記、２
種の発色団が相互に十分近接して配置していることを示
すものである。

螢光の消光を利用す几ば、２棟の抗体のいずれかを不溶
化する必要がなくなる。足型的測定は、単に最大螢光、
即ち抗原をまったく含まない対照試料の示す螢光におけ
る減少前を測定することにより、もしくは試料の螢光と
既知量の抗原を含有する対照試料の螢光とを比較するこ
とにより行うことができる。しかしながら、螢光−消光
発色団対を、粒子凝集法と組合せて使用することもでき
、その場合には抗体の一方が試験管壁もしくはビーズな
どの固体担体に結合されて不溶化される。というのは、
螢光−消光発色団の対形成が起こるからである。この場
合も、螢光における減少が試料中における抗原の存在お
よび／またはその量の指標となる。

適当な螢光並びに消光発色団およびとハ、らな抗体と結
合する方法は米国特許第１１．／７１４，３ｇ’１号に
記載されている。現在のところ、フルオレセインおよび
ロダミンを夫々螢光発色団および消光発色団として使用
することが好ましい。

本発明の前記議論において、我々は螢光−消光法を記載
したが、そこで必要な発色団を担持する抗体対が、分析
すべき試料中に抗原が存在する場合に、該抗原との結合
音生じ、その立体的配列は螢光発色団の放出する光を該
消光発色団が吸収しイ←るような配列ｙｃある。存在づ
−る抗原の重＝の定せ的測定は最大螢光における減少を
測ることによって行われる。

これらの方法は、極めて広範囲の濃度に亘って試料中に
存在する抗原を測定するのに極めて適している。しかし
ながら、低抗原濃度に相当する、螢光におけるわずかな
減少は検出困難であり、かつ正確な測定も困難である。

逆に、螢光におけるわずかな増加は比較的検定が容易で
かつ正確な測定が可能である。従って、本発明の他の局
面では、我々は消光の抑制全開択し、螢光における増加
を測定することが好ましい。

特殊な抗原に対する検定において、これを達成するため
に、抗原および該抗原に結合する抗体のある量を、夫々
螢光−消光発色団の一方もしくは他方で標識する。発色
団で標識した抗原並びに抗体を、次に結合して錯体を形
成する。該錯体において、螢光発色団は、こｊ、が放出
する光が消光発色団により吸収されるように配置さ１．
る。こｆ”Ｊ、　ｆ達成するために、抗原を螢光体で標
識することができ、一方抗体を消光体で標識することが
でき、かつ逆もまた可能である。

被検抗原を含有する問題の試料は、次に発色団で標識し
た抗原と抗体とに接触させられる。適当ガインキュペー
ション期間の後、螢光を測定する。

抗原が被検試料中に存在する場合、発色団で標識した抗
原と抗体との間の錯体形成を、試料中の抗原自身が単ク
ローン性抗体との錯体を形成することによって、少なく
とも部分的に抑制する。このことがある程度まで起こる
と、螢光発色団は最早その結果螢光発色団の放出する光
が消光発色団により吸収されるようには配置されたい。

このことは螢光における増加をもたらす。螢光における
増加を測定し、抗原を含まないもしくは既知ｔの抗原を
含む対照試料の示す螢光と比較することにより、分析中
の試料中の抗体の濃度と、前記螢光における増加とを関
係すけることかできる。

以上の記載から、発色団で標識した抗原：抗体錯体が可
溶性錯体であることは明らかであろう。

しかしながら、現在のところ、ラテックスもしくは伸の
適当な粒子、例えば上述したような、錯体が形成された
場合に凝集体を形成するような寸法の粒子、に結合した
発色団−標識抗原並びに単りローン件抗体を使用するこ
とが好ましい。約００．２〜約７０μの範囲の寸法を有
する粒子が、通常この目的に適している。問題とする抗
原を含有する未知試料を抗体並びに抗原の凝集体形成粒
子と接触させた際に、凝集抑制が起こる。というのは試
料中の抗麿が粒子に結合した抗体と結＠するからである
。消光は最早起こらないので、螢光における増大がもた
らされ、こわ、は検出しかつ測定して、既知量の抗原を
含む試料について観測された螢光と比較することにより
、試料中における抗原の景と関係ずけることかできる。

凝集の抑制を直接測定する検定において、結合抗原およ
び粒子に結合した単りローン件抗体を使用することも本
発明の範囲内にある。この方法においては抗原も抗体も
標識さｊ、ない。抗原を含有する試料を該粒子と接触ぢ
せると、インキュベーション期間中に凝集の抑制が起こ
る。これは少なくとも部分的な凝集体形成の減少をきだ
す。この抑制は比濁法もしくは濁度を測足するための他
の方法を利用することにより決定することができる。

濁度における減少は試料中の抗原の量と関係すげること
ができる。

ｇＥに関る検定に対する本発明の適用性を証明する本発
明の前記々載並びに実施例は、本発明を利用することの
できる種々の方法の例示にすぎない。他の変法も有用で
あることは当業者りこは明らかであろう。従って、本発
明は特許請求の範囲のみによって限定されるものと理解
すべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＩｇＥのための、７種の免役検定法におい
て、多クローン性抗体を使用して得らｊ、だ結果を示す
図である。 第２図はヒトＩｇＥに対して、前記を釉の免役検定法に
おいて、単クローン性抗体を使用して得らｊ、た結果に
おける差を示す第１図と同様な図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）流体試料を、添加した既知量の抗原性物質
   および抗原性物質と結合する単クローン性抗体と接触さ
   せ、かつ （ｂ）該抗体と添加された抗原性物質との間の錯体形成
   の阻害を、前記単クローン性抗体と抗原性物質とを結合
   させて第２の錯体を形成することによって測定する、 工程を含む、流体中における抗原性物質の存在もしくは
   その濃度を決定する方法。
2. （２）螢光発色団を前記添加された抗原性物質と結合さ
   せ、該螢光発色団により発せられる波長の光を吸収する
   ことのできる発色団を前記単クローン性抗体と結合させ
   、かつ該接触の後、螢光強度を決定し、該抗原性物質を
   含まないもしくは既知濃度で該抗原性物質を含有する標
   準試料の螢光と比較することを特徴とする、特許請求の
   範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）螢光発色団を単クローン性抗体と結合させ、該螢
   光発色団によって発せられる波長の光を吸収することの
   できる発色団を前記添加された抗原性物質と結合させ、
   かつ該接触の後、螢光強度を決定し、該抗原性物質を含
   まないもしくは既知濃度を該抗原性物質を含有する標準
   試料の螢光と比較することを特徴とする、特許請求の範
   囲第（１）項記載の方法。
4. （４）前記螢光発色団がフルオレセインであり放出され
   た光を吸収し得る発色団がロダミンである、特許請求の
   範囲第（２）または（３）項記載の方法。
5. （５）前記単クローン性抗体と前記添加された抗原性物
   質が粒子に結合されており、第１の錯体が単クローン性
   抗体を結合している粒子と該抗原性物質を結合している
   粒子との凝集体を含む、特許請求の範囲第（２）または
   （３）項記載の方法。
6. （６）前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞、
   ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレートおよび
   アガロースの粒子からなる群から選ばれる、特許請求の
   範囲第（５）項記載の方法。
7. （７）前記単クローン性抗体と前記添加された抗原性物
   質とが粒子に結合されており、第１の錯体が該添加され
   た抗原性物質を結合している粒子の凝集体を含み、かつ
   該接触の後、試料の濁度を測定し、該抗原性物質を含ま
   ないもしくは既知量の該抗原性物質を含有する標準試料
   の濁度と比較することを特徴とする、特許請求の範囲第
   （１）項記載の方法。
8. （８）前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞、
   ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレートおよび
   アガロースの粒子から選ばれる、特許請求の範囲第（７
   ）項記載の方法。
9. （９）前記粒子のサイズが約０．２〜約１０μの範囲内
   にある、特許請求の範囲第（５）、（６）、（７）およ
   び（８）項のいずれか１項に記載の方法。