JPS5890169A - 単クロ−ン性抗体を使用する免疫学的、抑制試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明け、血清などの流体中における抗原性物質を検出
および／またけ骸物質の濃度を測定する方法に関する。

他の局面から見ると、本発明は免疫学的、抑制試験法に
係る。更に別の局面から見ると、本発明は単りローンゼ
Ｌ抗体に関する。

種々の身体的疾患に伴う、例えば血清もしくは他の体液
中の抗原性物質の存在もしくは濃度の決定は、近時ます
ます免疫学的測定法に頼る傾向となってきている。この
方法は、検査すべき抗原性物質と抗体（／マたは複数）
との間における錯体の形成に基いており、該錯体の／も
しくは他の成分が、例えば１２５１　　などの放射ｒＦ
：、物質により標識され、それによって錯化された標識
抗原もしくは抗体と錯化されなかった標識抗原または抗
体とを分離した後、抗原の検出および／ｆたけ定量分析
が可能となる。

競合免疫学的測定法においては、存在を試験すべき流体
試料中の抗原物質と既知量の標識抗原とが限定量の抗体
の結合サイトを奪い合う。かくして、抗体に結合１．た
標識抗原の一計は試料中の抗原の量に反比例する。これ
とに対照的に、免疫学的測定では標識抗体を使用する。

かかる検定においては、前記錯体に関与する標識抗体の
１゛け流体試料中の抗原性物質の量に比例する。

免疫学的検定は、とりわけ多価抗原、即ち同時に、２′
ｆ、たけそれ以上の抗体と銘化し得る抗原性物質の検出
に対して適していることがわかった。このよう力検定は
、典型的には被検流体試料中に不溶な固体担体に結合し
た標識されていないある量の抗体および放射性同位体な
どの標識を有するある量の可溶性抗体を利用し、該同位
体によって同相抗体、抗原および標識抗体との間に形成
される三元錯体の検出および／ｆ、たけその量の定量的
見積りが可能となる。

尚業界において公知の免疫学的検定においては、典型的
には１前〃検定が利用され、ここでは固相に結合した抗
体を、まず被検試料と接触させて、二元同相抗体即ち抗
原錯体を形成することによって抗原を試料から抽出する
。適当々インキュベーションの後、骸固体担体を洗浄し
て、存在するかもしれない未反応抗原を含む流体試料の
残渣を除去し、次いで既知−厘・の標識抗体を含む溶液
と接触させる。

核標識抗体を、標識してない抗体を介して固体相体に結
合した抗原と錯化することを可能とする第コのインキュ
ベーションの後、肢固体担体のコ度目の洗浄を行って、
未反応の標識抗体を除去する。抗原が被検試料中に存在
するか否かを決定するための簡単な箋イエス／ノー　〃
試験において、洗浄した固体担体は、例えば標識が放射
性元素である場合には放出される放射能を測定すること
により、標識抗体の存在を検出するために試験される。

検出された標識抗体の量は、該抗原を含まないことが知
られている負の対５照試料に対する値と比較される。狗
の対照により示されるバックグラウンド水準を実質的に
越える量で標識抗体を検出することけ、問題とする抗原
の存在を示すものと解釈される。定量的検出は、標識抗
体の量と骸抗原の既知量を含む較正試料について得られ
た量とを比較することにより達成することができる。

この種の検定はしばし、げ［，２−サイト−１もしくケ
「サンドウィッチ」検査といわれる。というのは抗原が
その表面の異った位置に結合したユつの抗体を有するか
らである。このおよびこれに関連する技術はＷｌｄｐの
「放射線免疫検定法（Ｒａｄｉ’ｏｉｍｕｎｏａｓｓａ
ｖ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）Ｊ　　／　９９−、．２０　Ａ頁
（／ｑり０　）　、　Ｋｔｒｋｈａｍ＆　Ｈｕｎｔｅｒ
監修、Ｅ、＆Ｓ。

Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに記
載されている。

Ｉｌｌ　Ｔ　　標識抗体を使用する血清肝炎に関連する
抗原の検出のためのこの技術による検定は米国特許第３
．　ｇＡ７．３／り号に記載されている。

これらの大きガ有用性にもかかわらず、従来の免疫学的
検定法は時間のかがる手法であることが認識されている
。というのは一部には二度の洗浄工程が必要とされるか
らであり、ま九平衡即ち時間の増加に伴う形成され之錯
体の量の変化が生じなくなる点、の達成のため罠長期に
亘るインキュベーションが必要とされることによる。

この方法に関連する洗浄工程の少なくとも／っを排除す
るため罠、いわゆる１同時“および気道“検定法が提案
されている。同時検定法は固体担体に結合した抗体およ
び標識抗体両者が同時に被検試料に添加された際におけ
るただ７度だけのインキュベーション工程を含んでいる
。このインキュベーションの後、固体相体を洗浄して流
体試料の残渣並びに錯化しなかった標識抗体を除去する
。

核固体担体と会合１７た標識抗体の存在は、次いで従来
の事前Ｉサンドウィッチ検定におけるようにして検出さ
れる。

送検定法は段階的添加を含み、その第１は標識抗体溶液
の流体試料への添加であり、引き続き適当なインキュベ
ーションの後向体担体に結合した標識されていない抗体
の添加が行われる。第コのインキュベーション後、眩固
体相を常法に従って洗浄して、被検試料の残渣並びに未
反応標識抗体の溶液を除去する。次いで、固体担体と会
合した標識抗体の決定は同時並びに前検定法におけると
同様にして行われる。

同時並びに送検定法両者においては、存在する抗原の殆
ども１−＜は全てを結合するために十分に過剰量の固相
抗体を使用して、人為的に負のもしくは低い抗原量が極
めて高い抗原濃度の下で観察される高量フック作用（ｈ
ｉｇｈ　ｄｏｓｅ　ｈｏｏｋ　ｅｆｆｅｃｔ）を避ける
ことが必要とされる。このために、前検定法が当業者に
とっては好ましい方法であった。

これが前検定法が当業者によって好まれる理由である。

またこれが、十分な抗原結合能を有する固相を製造する
ために、問題とする抗原に対して特異的な、高純度の、
活性な抗体を、従来法において使用されていた喚多りロ
ーン性〃抗体から大量に得ることが困難であった理由で
ある。免疫原性物質が生体中に導入された場合、該生体
の免疫系が該免疫原性物質を認識する免疫原上の各サイ
トに抗体を生成することにより応答する。大きな免疫原
性蛋白分子は数十のサイトを有し、異種細胞は数百のサ
イトを有し得る。かくして、細胞をつくる各抗体は単一
の抗原性サイトに対して特異的な抗体をつくるが、免疫
系は認識された各免疫原性サイトに対して、細胞をつく
る特異的抗体種を発生する。更に、生体は問題とする抗
原以外の抗原に対する抗体を比較的大１゛に生成するの
で、多クローン性混合物中の抗体の大部分は問題とする
抗原に対１７て特異的ではない。従って、従来の免疫学
的検査において使用されていた抗体は必然的ｌｃ％多ク
ローン性”であった。というのは、この抗体が動物中に
普通の様式で牛じる抗血清から誘導され、かつこれらの
精製が困難であるからである。かかる抗体の親和性精製
法は一般に時間のかかる、低収率を与える、かつ高い親
和性の抗体の損失をまねくものであった。

前記逆および同時検定において、従来の多クローン性抗
体混合物を使用１〜た場合、異ったサイトにおいて抗原
と錯化する、２またはそれ以上の標識抗体により錯化さ
れた抗原を含むゝサンドイッチｌの形成が可能である。

被検試料中における可溶性を維持し得るこれらの錯体は
次の洗浄工程により除去されるので、同相が固相ＫＭ合
した標識抗体について分析される際には計算されない。

これがかがりの程度で起こった場合、検定の感度は減少
し、誤った結果を与える。しかしながら、標識されてい
ない結合抗体を、前記の前サンドイッチ検定におけるよ
うにまず試料に添加すると、立体的考察から、標識抗体
が排除され、かつ抗原釦結合されている、２またはそれ
以上の標識されていない抗体に錯化された抗原を含むサ
ンドイッチの形成が妨げられる。従って、該抗原は標識
抗体分子と自由に反応する。それにもかかわらず、固相
に結合した大過剰の標識してない抗体を使用して可溶性
標識抗体による可溶性錯体の形成を最小化することによ
って、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ）に対する同
時検定法を利用することが提案されていた。Ｊｅｏｎｇ
等の１ヒト甲す腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ）の検出に適
用される放射線免疫検定（ＲＩＡ）と固有の単−一イン
キュベーションコーサイト免疫学的放射線検定Ｃ＋ＲＭ
Ａ）との比較’Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｎｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　、　／　９’７９参照のこと□同時検定の変法が
米国特許第４．／りＩｔ、　、３ｇ１１号に記載されて
いる。この検定においては、抗免疫グロブリンＩｇＧ　
（ヒト）の別々の部分が夫々螢光性発色団（フルオレセ
イン）オ（！よび発色団（ロダミン）、これけフル第１
／セインから放出される光を吸収する、によって標識さ
れる。１′Ｉ″ｒ溶件状態にある両抗体はヒト１ｇＧを
含む試料と接触させられる。

抗−ＩｇＧ　、］−１１ｇとの反応け１００人もしくは
それ以下の相互に十分近接した二種の発色団をもたらし
、Ｉｌｆ光性発色団により発せらｉまた光は他方の発色
団により吸収（消光）される、、試料の最大螢光の割合
を決定し、試料中のＩｇＧの序゛の尺塵として使用され
る。

）−ＩＴＳＨ１肝炎関連抗原（＋−１八Ａ）および癌胎
児性抗原（ＣＥＡ　）に対して、標識抗体を保証するの
に十分な標識抗体の量、ただし抗原錯体を形成するが、
試料中に存在するすべての抗原の事サンドイッチ”を形
成するには不充分な量を使用することＫより送検定を応
用することが提案されている。

米国特許第り、　ｏｑｇ、　ｇ’ｕ、号参照のこと。

肖秦者に公知の３つのすべての手続きが抗体の多クロー
ン性混合物を使用（７，ているので、試験すべき抗原以
外の流体もＬ　＜け血清中の他の物質との交叉反応の可
能性が大きくなる。他の抗原との交叉−反応性の出現は
マ六、問題とする抗原の試験の感度を減じ、かつゝ誤っ
た一正“の検定の可能性を増す。更に、同時も１．　＜
は送検定において多クローン性抗体を使用することは、
固相抗体および／またけ存在する抗原の量に関して、使
用すべき標識抗体の量の注意深い考察を必要とする。螢
光の消光を利用する場合には、感度が低い。これは螢光
発色団と消光発色団との間の最小間隔が、多クローン性
抗体を使用した場合には、保証されないことによる。

これら諸欠点から、当業界において公知の免疫的手法の
限界はまったく明らかである。従来の前検定はより少な
い工程数で達成されるが、大量の固相特異的抗体を必要
とし、かつ低濃度の抗原の検出には不適当である。なん
となれば、抗原と多数の標識抗体分子とのサンドイッチ
の形成が、結合した抗体、抗原、標識抗体を含むサンド
イッチの形成と競合し、もしくは螢光の消光を利用する
場合には、螢光発色団と消光発色団との対形成なしに、
サンドイッチが形成される可能性がある。

しかも抗体の多クローン性に基〈正の誤差の誤った解釈
に導く。

従って１本発明の目的の７つけ抗原性物質に対する改良
された免疫学的検定法を提供することである。

更に詳しくに１、本発明の目的はより短時間の免疫検定
法を提供することである。

本発明の他の目的はより感ｒ！の高い免疫検定法を提供
することである。

本発明の更に別の目的は改良されたゝ同時“並びに亀逆
＃労疫検定法を提供することである。

戻に別の本発明の目的は、改良された阻害試験法を提供
することである。

上記並びに他の目的が本発明によって実現される様式は
以下に示す詳細な記載から明らかとなろう。

本発明によれば、免疫検定において使用される多クロー
ン性抗体、例えば固体相体に結合した未標識抗体、およ
び可溶性標識抗体と１７で使用される抗体または螢光消
光による検定の場合には螢光もしくは消光発色団を有す
る抗体は少なくとも／および通常は、２またはそれ以上
の異る単クローン性抗体、即ち単一の抗原性サイトに対
して特異的で、単一の細胞系からのクローンによって別
々につくられる各抗体、Ｋよって置換される。

本発明によれば、流体試料を検査するための免疫検定法
が提供され、この方法は抗原性物質、第１抗体および第
コ抗体（ただしこの第ツ抗体は第１抗体とは異ったサイ
トにおいて抗原と結合している）の三元錯体を、試料と
肢第１および＠二抗体とを接触させることにより形成す
ることを含み、骸第１および第ツ抗体夫々に対して単ク
ローン性抗体を使用することにより改良した方法である
。

本発明の好ましい具体例においては、固体担体に結合す
る抗体として使用される単クローン性抗体は、標識抗体
に使用する単クローン性抗体とは違った細胞系の生成物
でおり、これら２種の単クローン性抗体は相互に異った
サイトにおいて抗原性物質を結合するように選ばれ、抗
原に対する他の抗体の結合が阻害されないようにする。

螢光消光の場合にも、これら、２Ｎの抗体は通常違った
細胞系の生成物であり、他の抗体の結合を阻害しないよ
うに、かつａ秤の発育団が十分に近接して（即ち、通常
は約１００Ａ以内）螢光の消失が可能となるように選ば
れる。本発明の、特に同時並びに送検定法の、従来技術
に勝る利点は添付図の考察および以下の本発明の詳細な
記載から明らかとなろう。

また、本発明によれば、単クローン性抗体は阻害試験に
おいても使用される。このような試験において、既知量
の抗原および単クローン性抗体が、核単クローン性抗体
に添加された既知抗原に対応する抗原を含む、問題とす
る試料と接触させられる。抗体と抗原との間の錯体の阻
害が、単クローン性抗体と試ネ９１からの抗原とを含む
錯体が形成するため罠生じ、その程度は被検定試料中に
おける抗原の存在および／またけ量の尺摩となる。

更に、本発明によれば、以下の工程を含む、流体中の抗
原性物質の存在もしくけその濃度を決定する方法が提供
される： （ａ）　　流体試料を、添加された既知量の抗原性物質
および抗原性物質と結合する即クローン性抗体と接触さ
せる工程、および （ｂ）　　該抗体と添加された抗原性物質との間の錯体
の形成の阻害を、該単クローン性抗体と該流体内の抗原
性物質とを結合してｍ２の錯体を形成することによシ測
定する工程。

好ましい具体例においては、抗体と抗原とけ夫夫一対の
螢光発色団と消光発色団の一方のものと結合する。標識
抗原と抗体との間の錯体の形成を、被検試料中の抗原に
より阻害することにより、消光の程度の減少および螢光
の増大が起こる。消光の阻害の程度は、試料中における
抗原濃度の尺度である。他の好ましい阻害試験の具体例
においては、既知の抗原と抗体との元の錯体は、凝集体
形成を可能とする大きさの例えばラテックス粒子などの
粒子に結合する。抗原を含む、問題とする試料を抗体と
接触させて抗原を結合させる場合、凝集体形成の阻害が
、凝集体を形成し得ない試料の抗原と結合した抗体との
間で錯化が起こるために生じる。Ｕ集の減少は１１５１
ｆ測定法を利用することにより測定することができる。

上で述べたように、本発明によれば抗原性物質に対する
免疫学的検定法において使用されていた多クローン性抗
体が単クローン性抗体で置換される。同様に、単クロー
ン性抗体が抑制試験において使用される。本発明は、多
価抗原性物質を含めて、極めて広範な種々の抗原性物質
の存在もしくけその濃度の決定のために有用である。従
って、本明細書で使用する用語「抗原」または「抗原性
物質」は抗体を生成する広範囲の物質を意味する。

このような物質として、特にハブテン、ホルモン、例え
ばインシュリンおよびヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳ
Ｈ）、ｒ−グロブリン、アレルゲン、ウィルス、ウィル
スサブユニット、細菌、弾縮に関るもの並びに動物毒液
などの毒素およびある種の薬剤などを例示することがで
きる。本発明の方法によって検定することのできる特定
の抗原としては癌胎児性抗原（、ＣＥ　Ａ　）　、肝炎
ウィルスＡおよびＢ１肝炎ウィルスノン（Ｎｏｎ　）　
ＡおよびノンＢ１１ｇＥ並びにα−７エトプロテインを
例示することができる。

本発明において有用な単クローン性抗体はＭｉ　１ｓｔ
ｅｉｎ　＆　Ｋｏｈｌｅｒにより議論され、Ｎａｔｕｒ
ｅ　。

ユＳ乙、グ９Ｓ−ゲゾ’７（／９７３）に報告された方
法によって得ることができる。この方法の詳細は周知で
あり、ここであらためて述べるにはあたらないでろろう
。しかしながら、基本的にはこの方法はネズミもしくは
他の適当な動物に免疫原を注射することを含んでいる。

このネズミは次いで殺され、その牌臓から取り出された
細胞を骨髄細胞で融解する。得られるものけハイブリッ
ド細胞で「ハイブリドーマ」と呼ばれ、生体外で再生さ
れる。／・イブリドーマの集団を篩別し、個々の分校系
を単離するように処理され、各分枝系は抗原に対する単
一の抗体徨を分泌する。このようにして得られた個々の
抗体種は、免疫原性物質上で認識された特定の抗原性サ
イトに応答して生成された、免疫性動物からの単−Ｂ細
胞の生成物である。

免疫原１＜、ｔ：物質が生きている宿主中に導入された
場合、該宿主の免疫系は該免疫原作物質上の認識し得る
すべてのサイトに対する抗体を生成することにより応答
する。侵入物に対抗するために抗体を生成するこのより
なゝショットガン〃的対応は、訪免疫原性物質に対して
異つ九親和性並びに特異性を有する抗体の生成に導く。

従って、種々の・・イブリドーマ細胞系を選別して、所
定の抗原に対する抗体を製造するものを固定した後、個
々のハイブリドーマ細胞系によって生成された抗体を選
別１．て、本発明において使用することを決めるに先立
って、固有の生産を模倣する免疫原性物質に対して最も
高い親和性を有するものを固定することが好ましい。こ
の規準に基く選択が、従来法において使用された多クロ
ーン性抗体と比較して、単クローン性抗体を使用する本
発明の免疫学的検定並びに抑制試験における高い感度を
達成するのに役立つものと考えられる。該多クローン性
抗体は抗原に対する親和性として、よくても免疫系によ
り生産されるすべての抗体の親、相性のほぼ平均値を有
するにすぎない。選ばれた単クローン性抗体は所定の感
度に匹敵する親和性を有し、対象とするテスト系に対す
る範囲内にあることが好ずしい。抗体は少なくともＩＱ
８ｔ１モル、更に好ましくは少なくとも約ｉｏ’ｔ、ｉ
モルの親和性を有することが望ましい。

更に、最も高い親和性を有するこれらの単クローン性抗
体を、従来の多クローン性抗体を使用した方法で誤った
正の結果を与えることが知られている試験体について模
擬検定を行うことにより、更に選別し７て、交叉反応を
示さずかつ誤った正の結果を与えない単クローン性抗体
を同定することができる。

ユサイト免疫学的検定は抗体：抗原゛抗体サンドイッチ
の形成に基いているので、通常抗原に対する相互の結合
を妨害しない、２．種の異った単クローン性抗体が結合
抗体および可溶性椰識抗体もしくは螢光消光法が使用さ
れた際における抗体対として選ばれる。三者が前記サン
ドイッチを完成するのに必要とされるので、逆並びに同
時検定は、例えば標識抗体：抗原；ｗ４識抗体なる錯体
が形成されるという懸念なしに行うことができ、かかる
錯体の形成は同相と結合する抗体と抗原との間の錯体形
成を妨害する。ここに本発明の特別の利点がある。更に
１前検定は中間的洗浄工程を経ることなしに達成できる
。というのは前記一種の抗体が二種の異ったサイトに結
合するからである。我々はこのような方法をゝゝ急速前
（ｆａｓｔ　ｆｏｒｗａｒｄ）“検定と呼ぶ。

しかしながら、特に前検定の場合において、抗原性物質
が十分な間隔を有する同等な抗体結合サイトを有してお
り、その結果／よυ多くの抗体分子が同時に結合するこ
とが可能である場合には、同一の単クローン性抗体を標
識抗体並びに固体担体に結合した抗体、両者に対して使
用することができる。このような系において、初めに試
料に結合抗体を添加することにより、サンドイッチの形
成が阻止されるが、これは立体的障碍によるものである
。次いで標識単クローン性抗体が添加されると、固体相
体上の未標識抗体と結合した抗原と錯化することも可能
である。

被検試料から抗原性物質を抽出するための本発明の方法
において使用する未標識単クローン性抗体は免疫学的検
定において普通に使用されているいずれかの担体上に固
定することができる。これらの中で沢紙、プラスチック
ビーズもしくはポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロ
ピレンもしくは他の適当な物質でつくられた試験管を例
示することができる。また、アガロース、架橋デキスト
ランおよび他のポリサッカライドなどの粒状物質も有用
である。抗体をこのような物質に結合するための方法は
当業者には周知のことである。例えば、抗体を米国特許
第３．μす、　ｇｓ、ｙ号に記載された方法を利用する
ことにより、ポリサッカライドポリマーに結合すること
ができる。

本発明において使用する標識単クローン性抗体には従来
の免疫学的検定において使用されているものと同じ標識
を与えることができる。この中で螢光法による検定に対
しては米国特許第３、９１１０．　’１７左号に記載さ
れているように螢光発光性標識を、米国特許第３．Ａ左
ｇ、　ｏｑｏ号におけるような酵素系標識を例示するこ
とができる。現在のところ、抗体を１２５ｒ　　などの
放射性同位元素によって、例えばＨｕｎｔｅｒ　＆　Ｇ
ｒｅｅｎｗｏｏｄ　、のＮａｔｕｒｅｓエムダ！、９４
’、ｔ（／９６．２）に記載されたも（７〈はＤａｖ　
ｉ　ｄ等のＥ３１ｏｃｈｅｗｌｓｔｒｙ　、ム３　、＋
　１０　／４’　−１０，２／Ｃ／９’７１１　）に記
載された手法を利用して、標識することが好ましい。

典型的検定においては、不溶性ザンドイツチ錯体と会合
する棹識抗体の量は適尚な手段に千って不溶性担体物質
を検査することによって決められる。しかしながら、被
検流体試料中の抗原の存在もしくは不在を、検定中に反
応せずに可溶形で残された標識抗体の量に関連ずけるこ
とも可能である。多クローン性抗体と比較して、単クロ
ーン性抗体を使用する本発明の免疫学的検定の利点は以
下の実施例を参照することによって理解されよう。

この実施例においては、ｑつの対照検定、同時検定、送
検定、前検定および「急速１前検定を、単クローン性抗
体および多クローン性抗体を使用し、かつ正の試料とし
てと）　ＩｇＥを／　００　ＩＵ／ｍｌ！含有する標準
血清を使用して行った。負の対照として、ＩｇＥを含ま
ない常態の馬の血清を使用した。

試料中における標識抗体として使用した、ＩｇＥに対す
る多クローン性抗体はＰｈａｒｍａｃｉａＤｌａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　（Ｎｅｗ　
Ｊｅｒｓｅｙ　）から得た。固体担体に結合した多クロ
ーン性抗体はＴａｇｏ　、　　Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ　（Ｃａ１ｉｆｏｒｎｌａ　）から得た
。

ＩｇＥに対する単クローン性抗体は前述のＭｉ　１ｓｔ
ｅｉｎ　＆　Ｋｏｈｌｅｒの方法を利用して得た。二種
の抗体としては、各々ＩＯ”１１モルより大きなＩｇＥ
に対する親和性を示すものが選ばれ、これらはＩｇＥに
対する他のものの結合を妨害しなかった。

検定はアガロースに結合した未標識抗体を使用た塩水（
ｐｆｌ？、ｌｌ）を、すべての試料を洗浄するために使
用した。

実施例 ／）同時検定法 アガロース粒子上に固定した抗体の懸濁液１００μｔを
ｉｏｏμｔの検体（血清）：ｔ・丁よびｉｏｏμｔの可
溶性１２１１Ｉ　　で標識した抗体と混合して、一対の
試料について実施した。この混合物を以下の第１表（多
クローン性抗体）および第２表（単クローン性抗体）に
示した所定の時間および更に３０分間インキュベーショ
ンした。余分の３０分間のインキュベーションは、第ユ
の添加試薬に対する追加の３０分間のインキュベーショ
ン時間が必要とされる他の検定法と拳法とを同一条件と
するために加えられた。インキュベーション期間の経過
後、アガロース粒子を緩衝液を添加して洗浄し、次いで
遠心分離した。吸引により洗液を除いた後、得られたア
ガロース粒子のペレットを、結合した１２１１　■−標
識抗体について計数１７た。特定のインキュベーション
時間の後肢錯体の各々に対して得られた計数値は第１表
および第、２表に示す。

、２）送検定法 １００μノの検体（血清）を／　００　ｐｔの可溶性１
２Ｊ−標識抗体と混合し、第１表および第２表に示した
所定時間インキュベーションして、一対の試料について
実施した。次いで、アガロース粒子上に固定した抗体の
懸濁液を添加し、得られた混合物を更に３０分間インキ
ュベーションし“た。次いで、アガロース粒子を洗浄し
、同時検定法におけるように計数した。計数量は第１表
および第２表に示す。

３）前検定法 一対の試料について行った。１０Ｏμｔの検定（血清）
を１００μｔのアガロース粒子上に固定した抗体の懸濁
液と混合し、かつ第７表および第二光に示した所定時間
の間インキュベーションした。このアガロース粒子を二
Ｓ〜３．０−の緩衝液を添加し、混合波遠心分離するこ
とにより７回洗浄し、液を吸引により除去した。次いで
、可溶性１２１ｉ−標識抗体１００μｔを添加し、混合
物を更に３０分間インキュベーションした。次いで、ア
ガロース粒子を洗浄し、同時検定法におけるように計数
（また。計数値を第１表および第２表に示す。

り）急速前検定法 検定はコ度行い、アガロース粒子上に固定された抗体を
含む検体の最初のインキュベーションと可溶性＋ｔｓ■
−標識抗体の添加工程との間の洗浄工程を省略した以外
は前検定法と同様に実施した。

一対の対照に対する計数値７分並びに多クローン性抗体
および単クローン性抗体を使用してＩｇＥを含有する一
対の試料の検定にｔｔｒける計数値７分の結果を１￥／
表および第、２表に夫々示した。これらのデータをＪソ
、下のようにして第７図および第２図を作るために使用
し念。所定のインキュベーション時間に対する対照の計
数値７分の平均は対応するＩｇＥ検定に対する計数値の
平均から算出した。

差を試料に添加した（１．ｆ抗体体の全計数値７７分に
対する割合とし７て計算し７、同相に結合した抗体の合
計数値７分に対する割合としてＹ軸上にプロットした。

インキュベーション時間をＸ軸上にプロットした。

単クローン性抗体を使用した検定の結果を示す第二図に
示ｉ−たプロットと多クローン性抗体を使用した検定の
結果を示す第１図とを比較すると、各々の検定、即ち同
時、逆、前および急速前検定において、単クローン性抗
体を使用した検定がより感度が高いことがわかる。この
ことｕｉｏ。

ＩＵ　ＩｇＥ／７！検定について得られた、固相に結合
１゜たものの全計数値の高い割合によって示される８予
想外にも、同時並びに逆検定の場合において、単クロー
ン性抗体を使用し７て行った検定が多クローン性抗体を
使用して行った対応する検定よりも一層急速に平衡に達
することがわかった。従って、これらの手法において単
クローン性抗体を使用することにより、検定に要する時
間を、単に洗浄工程を省くことにより達成される時間の
節約をはるかに越えて節減することができる。この点に
ついて、単クローン性抗体を使用した逆検定は７時間以
内で平衡に達した。多クローン性抗体を使用した同様な
検定実験では４時間経過するまで平衡に達しなかった。

同様に、同時検定の場合にも、単クローン性抗体を使用
した検定ではｇ時間以内に平衡に達するが、多クローン
性抗体を使用した検定ではコゲ時間以内で平衡に達する
ことはなかった。結局、本発明は従来法よりも極めて急
速かつ感度の高い同時並びに送検定法を与え、かつ可溶
性「サンドインチ−１錯体の形成が所定の不溶性錯体の
形成と競合するという懸念を排除する。

ｌｌ／　　　　　　　　　　　　　　４４ｍ前述の議論
において、焦点はａつのサイト即ちサンドイッチ検定に
あった。そこでは抗体の一つは不溶化されるが、他方は
分析される媒体中に可溶性である。これ以外の変法も可
能である。好ましい変法の７つでは粒子例えばラテック
ス粒子などに結合した抗体が使用され、そこで各粒子は
多数の抗体を担持することになる。第１の単クローン性
抗体が結合するある量の粒子が、例えば第二の単クロー
ン性抗体が結合するある量の粒子と混合された場合、乳
白色の懸濁液が得られる。しかしながら、試料が多価抗
原を含有し、抗体が該抗原に対して特異的な場合、該試
料を前記懸濁液に導入すると、粒子の凝集もしくは凝着
を生じ、容易に検出し得る凝集塊を形成する。

凝集体形成の肉眼的検出が、抗原の存在に対する予検試
験において利用することができる。この検出は一方の単
クローン性抗体を担持する粒子の色と、他方の抗体を担
持する粒子の色とを違えることにより促進される。しか
しながら、凝集の程度を試料中における抗原存在量の尺
度として決定することも可能である。例えば、濁度変化
を比濁法などの標準的方法を利用して測定することがで
きる。

現在のところ、当業者に周知の方法を利用して抗体を共
有結合的に結合させたラテックス粒子を使用することが
好ましい。しかし、他の粒状担体を使用すること本可能
である。その中で、シリカ、ガラス、細胞、ポリアクリ
ルアミド、ポリメチルメタクリレートおよびアガロース
などを挙げることができる。好ましくは該粒子の粒径は
約０．２〜約１０μの範囲で変化する。肉眼的予検法け
、しかしながら、少なくとも約／、Ｏｔｔの大きさの粒
子を必要とする。

同別の変法において、抗体の一方にビーズ、試験管壁も
しくは他の巨視的固体担体」二に固定され、他方の抗体
はラテックスもしくは他の適当な物質の小粒子に結合さ
れる。抗原の存在下で、巨視的に結合し次抗体と粒子に
結合している抗体との間に抗原を有するサンドイッチが
形成される。例えば粒子を着色することＫより、サンド
イッチの形成を肉眼的に検出することができる。粒子に
結合した抗体の螢光、酵素、放射能もしくは他の標識を
、前述の可溶性抗体を使用する場合と全く同様に、定量
的検出のために使用することができる。

ユーザイト検定の他の好ましい変法においては、二つの
異る単クローン性抗体のうちの少なくとも一つが酵素に
結合される。該酵素は、他の単クローン性抗体に結合す
る物質を含む反応を触媒して検出可能な物質を生成する
か、もしくは第二の抗体上の物質と相互作用して錯体即
ち抗体：抗原：抗体の検出を可能とする。検出は、例え
ば比色法、螢光法、発光法、分光々度法などによって行
うことができる。このような方法を利用すれば、抗体両
者を不溶性とする必要がなく、検定が著しく単純化され
ることが理解されよう。

現在好ましい具体例においては、第二抗体上の物質も酵
素であり、検定は酵素で標識し九一対の抗体を使用して
、後の反応を触媒させる。抗体の一方は他のものが必要
とする生成物を製造する。

これらの反応においては１．２種の抗体が抗原と結合す
る場合、立体的に配向され、第１酵素反応の生成物は第
２のＷｆ素で標識された抗体に近接するように発生され
、第二の反応は第１の反応の生成物が環境の媒質中に大
きく拡散する前に起こるように、二種の抗体が選ばれる
。

この方法を一対の単クローン性抗体を使用して説明する
ことができる。該抗体の７つをヘキソキナーゼ（１−Ｉ
　Ｋ　）で標識し、他の抗体をグルコース−Ｌ−ホスフ
ェ　トデヒドロゲナーゼ（Ｇ−Ａ−ＰＤ）−１）で標識
し、以下の一連の反応を行う。

（ＡＤＰ） この検定は問題とする抗原を含む試料に、該抗原と結合
する標識抗体、ＡＴＰ、　　グルコースおよび補酵素Ｎ
ＡＤ＋を添加することにより行われる。

抗原が存在する場合、以下に示すような錯体が形成され
る： ＨＫで標識した抗体は、Ｇ−Ａ−ＰＤＨで標識した抗体
の近傍におけるグルコース−６−ホスフェートの形成を
触媒し、そこでグルコノラクトン−６−ホスフェートに
転化される。この反応においてＮＡＤ＋の還元によって
形成されるＮＡＤＩ−１は分光々度法により検出するこ
とができる。というのはジヒドロニコチンアミドが３　
’ｌ　Ｏｎｍにおける強い吸収で特徴ずけられるからで
ある。

ＮＡＤＨの形成と同様に、グルコースのグルコノラクト
ン−４−ホスフェートへの転化［’Ｊｔ中で起こり、こ
れは錯化されなかった標識抗体によって触媒されるが、
二種の抗体が錯体即ち抗体：抗原：抗体において相互に
近接して配置される場合よりも一層低い速度である。従
って、対照試料と比較して３１１　Ｑ　ｎｍにおける吸
収の増大は試料中における抗原の存在を確認している。

吸収における増加は錯体中の抗原の量と本関係ずけるこ
とができる。

適当に標識された問題とする抗原に結合する抗体を使用
するニーサイト検定において、任意の他の適当な一対の
連続的な酵素触媒反応を使用することができる。その中
で、グルコノラクトンと過酸化水素とを形成し、引き続
きパーオキシダーゼにより触媒されて着色成分を生成す
る過酸化水素と０−フェニレンジアミンとの反応を伴う
ような、グルコースオキシダーゼにより触媒されるグル
コースの反応を挙げることがで良る。この検定において
は、単クローン性抗体の一方がグルコースオキシダーゼ
で標識され、他方はパーオキシダーゼで標識される。対
照と比較して、得られる色の強度は被検試料中における
抗原の存在および／またけその量と関係ずけることがで
きる。酵素の存在下で、着色成分に酸化し得る他の物質
で０−フェニレンジアミンを代替することができるもの
と理解すべきである。

夫々ＮＡＤオキシドリダクターゼおよびルシフェラーゼ
で標識した、所定の抗原に結合する一対の抗体を使用す
る更に別の適した一連の反応は以ＦＭＮ）−１，＋　Ｎ
ＡＤ ルシフェラーゼ （至）ＦＭＮＨｙ　＋ＲＣＨＯ＋　０２ＦＭ〜”＋　Ｒ
ＣＯＯＨ十ＨｔＯ ここでＲＣ）Ｉ　Ｏｌｄ典型的にはｌＯブたけそれ以上
の炭素原子数を有する直鎖アルデヒドである。

Ｆ　Ｍ　Ｎ　”、即ち励起状態のＦＭＮの発生は光子の
放出を伴い、この光子は被検試料中における抗原の存在
お工び／またはその量を示すために、対照試料との相関
関係から、光学的方法で検出することができる。

酵素で標識した一対の抗体を使用する他の具体例では、
酵素的に触媒される第１の反応の生成物は、一連の酵素
触媒反応のアロステリック性活性因子もしくは抑制因子
であり得る。アロステリック性活性因子は第１の反応に
おいて消費されるというよりもむ（−ろ酵素と相互作用
１．て基質に対する親和性を増すか、もｔ、＜＋−ｔｍ
素−基質錯体が形成された後、基質を生成物に転化する
速度を増大する。他方、アロステリック性抑制囚子ｔｉ
ｔ逆の効果を有し、基質に対する酵素の親和性を減少も
しくは基質の生成物への転化速度を減する。アロステリ
ック性抑制は競合的もしくは非競合的型のものであり得
る。

夫々ホスホフルクトキナーゼおよびホスホエノールピル
ベートで標識した一対の抗体を使用する、アロステリッ
ク性活性因子を含む検定の例は以下のような反応を利用
する： （１）　　フルクトース−４−ホスフェート」−へＴＰ
−−−−−−−仝フルクトースーム乙−ジホスフェ−１
・＋ＡＤＰ（，２）　　ＨＣＯｓ−＋ホスホエノールピ
ルベート（ＰＥＰ） （ＯＡＡ） 反応（ｉ′）で形成されるフルクトース−／、Ａ−ジホ
スフェートはホスホエノールピルベートカルボキシラー
ゼとアロステリック的に相互作用して、反応０）の触媒
を活性化し、ＰＥＰからのオキザロアセテートの形成を
活性化する。反応■は囲まれた媒質中で起こり、第、？
の単クローン性抗体にマレエートデヒドロゲナーゼを結
合する必安けない。

問題とする抗原の存在および／またはその量は、３　’
Ｉ　ＯｎｍにおけるＮＡＤ）−１による吸収の減少と関
係ずけることにより測定することができる。ＮＡＤ）−
１は反応■においてＮＡＤＨに酸化される。

夫々アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ
）およびホスホエノールピルベートカルボキシラーゼで
標識１．７た一対の抗体を使用する、アロステリック性
抑制因子を含む検定の例では以下の反応系が利用される
： ５Ｔ （１）　　オキザロアセテート−１−グルタメ−１・−
〉アスパルテート＋α−ケトゲルトレート （２）　　　ＰＥＰ−１−ＮＡ［’）Ｈホスホエノール
ビピ：＝）　！！ムサ遭レし仕ヨー〇ＡＡ＋ＮＡＤ”反
応（／′）で形成されるアスパルテートはホスホエノー
ルピルベートカルボキシラーゼとアロステリック的に相
互作用することに」：り第二の反応を抑制する。これは
ＮＡＤＨが酸化されてＮＡＤＨになる速度を減する。従
って、ＮＡＤＨの示す３１１Ｑｍにおける吸収の減少を
、被検試料中における抗原の存在および／またはその量
と関係ずけることができ、該吸収における減少は抗原が
存在することを示す対照試料について生ずる減少度より
も小さい。

当業者は、第２の酵素により触媒される反応の活性化も
［−＜は抑制を含む他の多数の反応の対をツーサイト検
定において使用するために前記した例に対して代用し得
ることを理解するであろう。

他の具体例では、抗体対の一方のみを酵素で標識し、他
方を、例えば該酵素により触媒される反応を生じて第二
の生成物を形成するような物質で標識する。該第二の生
成物は比色法、螢光法、発光法、分光々度法もしくは他
の方法によって検出および／または定量し得るものであ
る。このような例の１つは一対の単クローン性抗体を使
用し、その一方はパーオキシダーゼにより標識され、他
方はルミノールで標識され、以下の反応を生ずる：ルミ
ノール この反応により放出された光子（ｈｌ／）は光学的方法
により検出することができ、被検試料中における抗原の
存在および／−ｆ、たけその量と関係ずけることができ
る。

ニーサイト検定の好ましい周別の変形では、夫々螢光発
色団および該螢光体の放出する波長の光を吸収し得る消
光発色団と結合した２種の単クローン性抗体が使用され
る。この２種の抗体は、これらと特異的な抗原と結合し
た際に、これらツつの発色団が十分に接近して配置され
て、螢光体から放出された光を他の発色団が吸収し得る
ように選ばれる。通常、これらは相互に約１００人以内
、好ましくはｓＯＡ以内におかれる。適当な抗体の選択
は予検法を介して行われ、そこでは螢光体および消光体
で標識された抗体の混合物が既知量の抗原を含む試料と
接触させられる。螢光の減少は前記２種の発色団が相互
に十分近接して配置していることを示すものである。

螢光の消光を利用すれば、２種の抗体のいずれかを不溶
化する必要がなくなる。定量的測定は、単に最大螢光、
即ち抗原をまったく含まない対照試料の示す螢光におけ
る減少量を測定することにより、もしくは試料の螢光と
既知量の抗原を含有する対照試料の螢光とを比較するこ
とにより行うことができる。しかしながら、螢光−消光
発色団対を、粒子凝集法と組合せて使用することもでき
、その場合には抗体の一方が試験管壁もしくはビーズな
どの固体担体に結合されて不溶化される。というのは、
螢光−消光発色団の対形成が起こるからである。この場
合も、螢光における減少が試料中における抗原の存在お
よび／またはその量の指標となる。

適当な螢光並びに消光発色団およびこれらを抗体と結合
する方法は米国特許第４．　／りＩＩ、　３ｇ１１号に
記載されている。現在のところ、フルオレセインおよび
ロダミンを夫々螢光発色団および消光発色団として使用
することが好ましい。

本発明の前記議論において、我々は螢光−消光法を記載
したが、そこで必要な発色団を担持する抗体対が、分析
すべき試料中に抗原が存在する場合に、該抗原との結合
を生じ、その立体的配列は螢光発色団の放出する光を該
消光発色団が吸収し得るような配列にある。存在する抗
原の量の定量的測定は最大螢光における減少を測ること
によって行われる。

これらの方法は、極めて広範囲の濃度に亘って試料中に
存在する抗原を測定するのに極めて適している。しかし
ながら、低抗原濃度に相当する、螢光におけるわずかな
減少は検出困難であり、かつ正確な測定も困難である。

逆に、螢光におけるわずかな増加は比較的検定が容易で
かつ正確な測定が可能である。従って、本発明の他の局
面では、我々は消光の抑制を開択し、螢光における増加
を測定することが好ましい。

特殊な抗原に対する検定において、これを達成するため
に、抗原および該抗原に結合する抗体のある皺を、夫々
螢光−消光発色団の一方もしくけ他方で標識する。発色
団で８１４識した抗原並びに抗体を、次に結合して錯体
を形成する。該錯体において、螢光発色団は、これが放
出する光が消光発色団により吸収されるように配置され
る。これを達成するために１抗原を螢光体で標識するこ
とができ、一方抗体を消光体で標識することができ、か
つ逆もまた可能である。

被検抗原を含有する問題の試料は、次に発色団で標識し
た抗原と抗体とに接触させられる。適当なインキュベー
ンヨン期間の後、螢光を測定する。

抗原が椋検°試料中に存在する場合、発色団で標識した
抗原と抗体との間の錯体形成を、試料中の抗原自身が単
クローン性抗体との錯体を形成することによって、少な
くとも部分的に抑制する。このことがある程度ブで起こ
ると、螢光発色団は最早その結果螢光発色団の放出する
光が消光発色団により吸収されるようには配置されない
。このことは螢光における増加をもたらす。螢光におけ
る増加を測定し、抗原を含まないも；〜くけ既知量の抗
原を含む対照試料の示す螢光と比較することにより、分
析中の試料中の抗体の濃度と、前記螢光における増加と
を関係ずけることかできる。

以上の記載から、発色団で標識した抗原：抗体錯体が可
溶性錯体であることは明らかであろう。

しかしながら、現在のところ、ラテックスも（−ぐけ他
の適当な粒子、例えば上述したような、錯体が形成され
た場合に凝集体を形成するような寸法の粒子、に結合し
九発色団−標識抗原並びに単クローン性抗体を使用する
ことが好ましい。約０．２〜約１０μの範囲の寸法を有
する粒子が、通常この目的に適している。問題とする抗
原を含有する未知試料を抗体並びに抗原の凝集体形成粒
子と接触させた際に、凝集抑制が起こる。というのは試
料中の抗原が粒子に結合した抗体と結合するからである
１、消光は最早起こらないので、螢光における増大がも
たらされ、これは検出しかつ測定して、既知量の抗原を
含む試料について観測された螢光と比較することにより
、試料中における抗原の量と関係ずけることができる。

凝集の抑制を直接測定する検定において、結合抗原およ
び粒子に結合した単クローン性抗体を使用することも本
発明の範囲内にある。この方法においては抗原も抗体も
標識されない。抗原を含有する試料を該粒子と接触させ
ると、インキュベーション期間中に凝集の抑制が起こる
。これは少なぐとも部分的な凝集体形成の減少をきたす
。この中割は比濁法もしくけ濁度を測定するための他の
σ法を利用することにより決定することができる。

関度における減少は試料中の抗原の量と関係ずけ５こと
ができる。

ＩｇＥに関る検定に対する本発明の適用性を証明ｌる本
発明の前記々載並びに実施例は、本発明を〜果を示す図
である。

第２図はヒト１ｇＥに対して、前記４種の免疫検巨法に
おいて、単クローン性抗体を使用して得らした結果にお
ける差を示す第１図と同様な図であ３゜ 昭和　　年　　月　　日 り表示 昭和５６年　特　許　願　第１８６７９３号をする者 牛との関係　　出願人 ろ　称　　ハイブリチック　インコーボレーテソド１人 つ対象　　　　願書　委任状　全図面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　抗原性物質、第１抗体および第１抗体とけ異
   るサイトにて核抗原に結合する第ユの抗体の三元錯体を
   、流体試料と第１および第ユ抗体とを接触させること罠
   より形成することを含む、流体試料中の抗原性物質の存
   在も１．りけその濃度を検査するための免疫学的検定法
   において、前記第１および第ツ抗体の夫々に対して単ク
   ローン性抗体を使用することを含む、改良された前記免
   疫学的検定法。 （，２１螢光発色団が前記第１抗体に結合し、核螢光発
   色団の放出する波長の光を吸収し得る発色団が前記第ユ
   の抗体に結合し、かつ前記試料を第１並びにｗｃ２抗体
   を含む溶液と接触させて三元錯体を形成して、螢光強度
   を決定し、これを該抗原を含まないもしくは既知量の該
   抗原を含有する標準試料の螢光強度と比較することを特
   徴とする特許請求の範囲第（ハ項記載の方法。 Ｃ３）　　前記第１並びに第ユ抗体の１つが固体担体に
   結合しており、該担体が前記流体試料に不溶であり、か
   り該第１並びに第ユ抗体の他方が該流体試料に可溶であ
   る、特許請求の範囲第（２）項記載の方法。 （グ）前記流体試料が同時に該第７並びに第ユ抗体と接
   触させられて不溶性の三元錯体を形成し、かつ該三元錯
   体の螢光強度を決定し、前記抗原を含まない、もしくは
   既知量で該抗原を含有する標準溶液の螢光強度と比較す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載の方
   法。 （６）前記流体試料をまず前記第１および第λ抗体の１
   つと接触させて抗体−抗原の二元錯体を形成し、次いで
   該第１および第ユ抗体の他方と接触させて三元錯体を形
   成し、かつ該錯体の丸しくけ該流体の螢光強度を決定し
   、前記抗原を含まないもしくは既知量の核抗原を含有す
   る標準試料の値と比較することを特徴とする特許請求の
   範囲第（、？）項記載の方法。 （／、）　　前記第１抗体が前記流体試料に不溶が粒子
   に結合１．ており、かつ核試料を三元錯体の形成を起こ
   すのに十分な時間、該Ｗ！濁液と接触させ、それによっ
   て前記第１および第一抗体に結合した粒子の凝集を起こ
   させることを特徴とする特許請求の範囲Ｗ、（ハ項記載
   の方法。 （７）　　前記粒子の大きさが約００．２μ〜約１０μ
   の範囲内である、特許請求の範囲第（１）項記載の方法
   。 （豹　　前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞
   、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレートおよ
   びアガロースからなる群から選ばれる、特許請求の範囲
   第（２）項記載の方法。 （９）　　第１抗体を結合する前記粒子が、第一抗体を
   結合する粒子とけ違った色を有するものであることを特
   徴とする特Ｗｒ請求の範囲第（乙）、（７）および破）
   項のいずれか７項に記載の方法。 ＱＯ）前記粒子のサイズが約／、Ｏ〜／θμの範囲内に
   あることを特徴とする特許請求の範囲第（，４）、（り
   ）、（イ）および（９）項のいずれか７項に記載の方法
   。 σの　前記三元錯体の形成後、試料の濁度を決定し、か
   つ抗原を含まないもしくけ既知量の抗原を含有すること
   がわかっている対照試料の濁度と比較することを特徴と
   する特許請求の範囲第（Ａ）、（り）、＠）オ６よび（
   ０）項のいずれか７項記載の方法。 （Ｄ螢光発色団を前記第１の抗体に結合させ、該螢光発
   色団によって発せられる波長の光を吸収することのでき
   る発色団を第一の抗体に結合させ、かつ該接触の後螢光
   強度を決定し、該抗原を含まないも１−くけ既知濃度で
   該抗原を含有する標準試料の螢光強度と比較することを
   特徴とする特許請求の範囲第（乙）、（７）、（わおよ
   びＵＯ）項のいずれか７項に記載の方法。 （／３）前記螢光発色団がフルオレセインであす、放出
   された光を吸収し得る発色団がロダミンである、特許請
   求の範囲第＠、（？１．（９）、（イ）および（Ｌ）項
   のいずれかに記載の方法。 （／ゲ）前記第７抗体に酵素を結合し、前記第一抗体に
   ある物質を結合し、それによって眩酵素と物質とを相互
   作用させて、抗体：抗原；抗体錯体の検出を行うことを
   特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （／り）第一抗体に結合させる前記物質が酵素である、
   特許請求の範囲第（／’ｌ）項記載の方法。 （ん）第１抗体と結合した酵素が、第二の抗体に結合［
   また酵素によシ触媒される反応に必要な生成物を中成す
   る反応を触媒することを特徴とする特許請求の範囲第（
   Ａり）項記載の方法。 （／７）第１抗体と結合した酵素により触媒される反応
   の生成物が、第一抗体と結合した酵素により触媒される
   反応において消費されることを特徴とする特許請求の範
   囲第（／乙）項記載の方法。 （／ｇ’）第１抗体と結合１７た酵素により触媒される
   反応の生成物が、第λ抗体と結合した酵素とアロステリ
   ックな相互作用をする、特許請求の範囲第（／乙）項記
   載の方法。 （／９）第１の抗体と結合した酵素により触媒される反
   応の生成物が第一の抗体と結合した酵素を了ロステリツ
   ク的に活性化しもしくはアロステリック的に抑制する、
   特許請求の範囲第（／ｇ）項記載の方法。 （７））第一の抗体と結合した酵素によって触媒される
   反応が検出可能な生成物を特徴する特許請求の範囲第（
   ン）〜（／ｑ）項のいずれか７項に記載の方法。 （７）第一の抗体に結合した酵素によって触媒される反
   応が検出可能な物質を特徴する特許請求の範囲第（ン）
   〜Ｇ’９　）項のいずれか７項に記載の方法。 （〃）前記検出可能な物質の形成もしくけ消費が比色法
   、螢光法、ルミネッセンス筐たは分光光度法により検出
   される、特許請求の範囲第（：Ｔ））または（ｙ）項記
   載の方法。 □□□）第二の抗体上の前記物質が、第１の抗体に結合
   した酵素により触媒される反応を特徴する特許請求の範
   囲第（／ｌｌ）項記載の方法。 ＣＪ）前記反応が比色法、螢光法、ルミネッセンスもし
   くは分光光度法により検出し得る物質を特徴する特許請
   求の範囲第（，２Ｊ′）項記載の方法。 ■）（ａ）流体試料を、添加した既知量の抗原性物質お
   よび抗原性物質と結合する単クローン性抗体と接触させ
   、かつ （ｂ）　　肢抗体と添加された抗原性物質との間の錯体
   形成の阻害を、前記単クローン性抗体と抗原性物質とを
   結合させて第一の錯体を形成することによって測定する
   、 工程を含む、流体中における抗原性物質の存在もしくけ
   その濃度を決定する方法。 （））螢光発色団を前記添加された抗原性物質と結合さ
   せ、核螢光発色団により発せられる波長の光を吸収する
   ことのできる発色団を前記単クローン性抗体と結合させ
   、かつ胃変接触の後、螢光強度を決定し、核抗原性物質
   を含まないもしくけ既知濃度で該抗原性物質を含有する
   標準試料の螢光と比較することを特徴とする特許請求の
   範囲第Ｑり）項記載の方法。 （１）螢光発色団を単クローン性抗体と結合させ、該螢
   光発色団によって発せられる波長の光を吸収することの
   できる発色団を前記添加された抗原性物質と結合させ、
   かつ肢接触の後、螢光強度を決定し、核抗原性物質を含
   ｔｎいもしくは既知濃度で該抗原性物質を含有する標準
   試料の螢光と比較することを特徴とする特許請求の範囲
   第■）項記載の方法。 （Ｊ）前記螢光発色団がフルオレセインであり、放出さ
   れた光を吸し得る発色団がロダミンである、特許請求の
   範囲第一）マたけグ）項記載の方法。 （Ｊ）前記単クローン性抗体と前記添加された抗原性物
   質が粒子に結合されており、ｔｓ／の錯体が単クローン
   性抗体を結合している粒子と該抗原性物質を結合してい
   る粒子との凝集体を含む、特許請求の範囲第（工または
   ｃ２７）項記載の方法。 （３０）前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞
   、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレートおよ
   びアガロースの粒子からなる群から選ばれる、特許請求
   の範囲第ａ９）項記載の方法。 （、？／）前記単クローン性抗体と前記添加された抗原
   性物質とが粒子に結合されており、第１の錯体が該添加
   された抗原性物質を結合している粒子の凝集体を含み、
   かつ核接触の後、試料の濁度を測定し、核抗原性物質を
   含まないも１．りけ既知量の該抗原性物質を含有する標
   準試料の濁度と比較することを特徴とする特許請求の範
   囲第■）項記載の方法。 （３コ）前記粒子がラテックス、シリカ、ガラス、細胞
   、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタクリレートおよ
   びアガロースの粒子から選ばれる、特許請求の範囲第（
   ，３１）項記載の方法。 （３３）前記粒子のザイズが約θ、ユ〜約１０μの範囲
   内にある、特許請求の範囲第０９）、０の、（３乃およ
   び（３，７）項のいずれか７項に記載の方法。 （Ｊ）　（ａ）　　流体試料を、抗原性物質と結合する
   第１の可溶性率クローン性抗体と接触させて、該抗体と
   眩試料中の抗原性物質との可溶性錯体を形成し、ただし
   り第１単クローン性抗体は標識されている； （ｂ）　　骸可溶性錯体を、該流体中に不溶性の固体担
   体と結合する第一の単クローン性抗体と接触させて、前
   記側／単りローン性抗体、前記抗原性物質および計固体
   担体と結合する第一の単クローン性抗体の不溶性錯体を
   形成し；（Ｃ）　　該流体試料と未反応標識抗体から該
   固体担体を分離し； （→　該固体担体と会合している標識抗体の量または未
   反応標識抗体の量のいずれかを測定し；かつ （ｅ）　　得られた標識抗体の量と、前記抗原性物質を
   含まないことがわかっている、工程（ａ）〜（ｄ）に従
   って調製した対照試料について得られた標識抗体の量と
   を比較して、前記流体試料中における抗原性物質の存在
   を決定するか、もしくは測定された前記標識抗体の量と
   、前記工程（ａ）〜（ｄｌＫ従って調製した既知量の抗
   原性物質を含有する試料について得られた標識抗体の量
   とを比較して、該流体試料中における抗原性物質の濃度
   を測定する、各工程を含む、流体中の抗原性物質の存在
   もしくけその濃度を測定するための、特許請求の範囲第
   （１）項記載の方法。 （、？５）’　（ａ）流体試料を、その中の抗原性物質
   と結合する第１および第１単クローン性抗体と同時に接
   触させて、第１単クローン性抗体、第１単クローン性抗
   体および！ｌｌ接抗原性物質不溶性錯体を形成する工程
   、ただし該第１単クローン性抗体は標識されており、か
   つ該第ユ単りローン性抗体は前記流体中に不溶性の固体
   担体に結合している： （ｂ）肢固体相体を、該流体試料および未反応標識抗体
   から分離する工程； （ｃ）　　該固体担体と会合１〜ている標識抗体の月゛
   もしくけ未反応標識抗体の−ｌ°のいずれかを測定する
   工程； （φ　測定された標識抗体の号を、抗原性物質を含市な
   いことがわかっている前記工程（ａ）〜（Ｃ）に従って
   訓製し九対照試１について得られた標識抗体の計とを比
   較して、該流体試料中にお（ハ）る抗原性物質の存在を
   決定するか、もしくは測定した標識抗体の計を、前記工
   程（ａ）〜（Ｃ）に従って調製し九既知緊の抗原性物質
   を含有する試料について測定ｉ、た標識抗体の量と比較
   して、肘流体試料中の抗原性物質の濃度を決定する工程
   ； を含む、流体中の抗原性物質の存在もしくけその濃度を
   決定するための、特許請求の範囲第（１）項記載の方法
   。 （３乙）第１の標識抗体、抗原性物質および流体試料に
   対して不溶性の固体相体に結合している第コの抗体の三
   元錯体を形成し、該標識抗体および固体担体に結合した
   第ユの抗体の各々に対し、て単クローン性抗体を使用す
   ることを特徴とする、流体試料中の抗原性物質の存在ま
   たはその濃度を決定するための、特許請求の範囲第（１
   ）項記載の免疫学的検定法。 （，７７）流体試料をまず第ユの抗体と接触させて、抗
   原性物質と該流体中に不溶な第ユ抗体との二元錯体を形
   成し、次いで第１の標識抗体と接触させて三元錯体を形
   成することを特徴とする特許ｉ！求の範囲第（品）項記
   載の方法。 （３ｇ）流体試料をまず第ユ抗体と接触させて、抗原性
   物質と該流体に不溶な第ユ抗体との二元錯体を形成し、
   試料を固体担体と分離し、該固体相体を第１標識抗体の
   溶液と接触させて三元錯体を形成することを特徴とする
   特許請求の範囲第（沼）項記載の方法。 （３ｑ）前記第１単クローン性抗体が前記第ユ単りロー
   ン性抗体とけ異った細胞系からの生成物である、特許請
   求の範囲第孕）〜（３ｇ）項のいずれか７項に記載の方
   法。 （硲）前記抗原が少々くとも二つの同等な結合サイトを
   有して二陰り、該第１および第２単クローン性抗体が同
   一の細胞系からの生成物であることを特徴とする特許請
   求の範囲第（、ＩＡ−（Ｘ）項のいずれか７項に記載の
   方法。 （ｌｌ／）前記第１および第ユ抗体が少なくとも約１０
   ８ｔ１モルの抗原に対する親和性を有するように選ばれ
   る、特許請求の範囲第Ｊ）〜Ｗ））項のいずれか７項に
   記載の方法。 Ｃ’１２）前記親和性が少りくとも約ｌ０Ｉｌｔ１モル
   である、特許請求の範囲第（Ｉｌｌ）項記載の方法。 （ｌＩ３）前記固体担体を洗浄して計枳体から流体試料
   を分離することを特徴とする特許請求の範囲第（、狗〜
   （ｌＩＯ）項のいずれか７項に記載の方法。 （＃）　骸担体を燐酸塩で緩衝した塩水で洗浄する、特
   許請求の範囲第（ｌＡ３項記載の方法。 （４’５）抗原を、ＩｇＥ、肝炎ウィルスＡ、肝炎つィ
   ルスＢ、肝炎ウィルスノンＡ１肝炎ウィルスノンＢ、α
   −フェトプロティン、癌胎児性抗原、インシュリンおよ
   びヒト甲状腺刺激ホルモンからなる群から選ばれる、特
   許請求の範囲第（３’ｌ）　’−（１）項のいずれか１
   項に記載の方法。 （弼）前記標識抗体が放射性同位元素、酵素および螢光
   性物質からなる群から選ばれ、かつ測定が放射線法、螢
   光法および酵素法からかる群から選ばれる、特許請求の
   範囲第Ｊ）〜（鞭項のいずれか７項に記載の方法。 （ｑ７）前記標識が放射性同位元素＋ｆｆ１ｌ　■であ
   る、特許請求の範囲第（４Ａ）項記載の方法。