FI92110B - Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittäminen - Google Patents

Description

92110

Useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittäminen

Keksinnön ala 5 Esillä oleva keksintö kohdistuu vallitsevien ana- lyyttikonsentraatioiden määrittämiseen nesteissä, esimerkiksi sellaisten analyyttien, kuten hormonien, proteiinien ja biologisissa nesteissä, kuten kehon nesteissä, luonnollisesti esiintyvien tai keinotekoisesti läsnä olevien ana-10 lyyttien määrittämiseen.

Keksinnön tausta

Olen ehdottanut PCT-hakemuksessa W084/01031, että nesteessä olevan analyytin konsentraatio mitataan saattamalla neste kosketukseen pienen määrän kanssa sidosainet-15 ta, kuten vasta-ainetta, joka on analyytille spesifinen siinä mielessä, että se sitoo palautuvasti analyytin muttei muita nesteen komponentteja, määritetään sidosaineen sidoskohtiin verrannollista miehitystä edustava määrä ja arvioidaan tästä määrästä analyytin konsentraatio. Siinä 20 patenttihakemuksessa kiinnitän huomiota siihen, että edel lyttäen, että sidosaineen määrä on riittävän alhainen, jotta sen lisääminen nesteeseen ei aiheuta merkittävää analyytin vallitsevan (sitoutumattoman) konsentraation pienentymistä, niin sidosaineen sidoskohtien osittainen 25 miehittyminen analyytillä on tehollisesti riippumaton nesteen absoluuttisesta tilavuudesta ja sidosaineen absoluuttisesta määrästä, ts. riippumaton tavallisesti osittaisen miehittymisen mittauksiin yhdistettyjen virherajojen puitteissa. Tällaisissa olosuhteissa ja ainoastaan näissä olo-30 suhteissa nesteessä olevan analyytin alkukonsentraatio [H] on verrannollinen analyytin miehittämien sidosaineen sidoskohtien osuuteen (Ab/Ab0) seuraavan yhtälön mukaisesti :

Ab _ Kab[H]

Ab0 1 + Kab[H] 2 92110 jossa Kab (johon tämän jälkeen viitataan symbolilla K) on tasapainovakio analyytin sitoutumiselle sidoskohtiin, ja se on vakio tietylle analyytille ja sidosaineelle missä tahansa lämpötilassa. Tämä vakio tunnetaan yleensä affini-5 teettivakiona, erityisesti silloin, kun sidosaine on vasta-aine, esimerkiksi monoklonaalinen vasta-aine.

Käsite, että käytetään vain pieniä määriä sidosai-netta, on vastakkainen yleensä suositellulle käytännölle immunomääritysmenetelmien ja immunometristen tekniikkojen 10 alalla. Esimerkiksi sellaisessa hyvin tunnetussa työssä kuten "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology", toimittajat S. A. Berson ja R. S. Yalow, 1973, sivut 111 - 116, ehdotetaan, että kilpailevassa immunomääri-tysmenetelmässä maksimiherkkyys saavutetaan, jos sitoutu-15 van "indikaattori"-analyytin määrä on lähes 50 %. Jotta saavutettaisiin tällainen suuri analyytin sitoutumisaste, Bersonin ja Yalowin teoria, jonka muut alalla työskentelevät ovat tähän päivään asti yleisesti hyväksyneet, on edellyttänyt, että sidosaineen (tarkasti ottaen sidoskoh-20 tien, sidosaineen kunkin molekyylin, jolla perinteisesti on yksi tai enintään kaksi sidoskohtaa) konsentraatio on oltava suurempi tai yhtä suuri kuin analyytin sidosaineen tasapainovakion [K] käänteisarvo, ts. [AB] > 1/K. Näytteen, jonka tilavuus on V, sidosaineen (tai sidoskohtien) 25 kokonaismäärän on siksi oltava suurempi tai yhtä suuri kuin V/K. Sidosaineen, joka on monoklonaalkinen vasta-aine, tasapainovakio (K) voi esimerkiksi olla suuruusluokkaa 1011 1/mol tietylle antigeenille, johon se sitoutuu. Siten edellä mainitun yleisesti hyväksytyn käytännön mukaisesti 30 tarvitaan sidosaineen (tai -paikan) konsentraatio suuruusluokkaa 10'11 moolia/litra tai enemmän tällaiset tasapai-novakiot omaavia sidosaineita varten, ja nestemäisten näy-tetilavuuksien ollessa 1 ml: n suuruusluokkaa 10'14 tai useampia mooleja sidosainetta (tai -paikkaa) on tavanomai-35 sesti pidetty tarpeellisena. Avogadron luku on noin 6 x 3 9 2 ί ΊΟ ΙΟ23, joten ΙΟ'14 moolia sidoskohtia vastaa yli 109 molekyyliä sidosainetta jopa oletettaessa, että sidosaineessa on kaksi sidoskohtaa molekyyliä kohden. Spesifisille sidosai-neille, joilla on suurin affiniteetti, K on alle 1013 1/ 5 mol, joten tavanomainen käytäntö edellyttää enemmän kuin 107 molekyyliä sidosainetta, kun taas sidosaineet, joilla on pienempi, suuruusluokkaa 10® 1/mol oleva affiniteetti, edellyttävät useamman kuin 1012 molekyylin käyttöä tavanomaisessa käytännössä. Itse asiassa kaikki kaupallisesti 10 markkinoidut immunomääritysmenetelmäkitit nykyisin vahvistavat näitä käsitteitä ja käyttävät sidosainetta lähes määrän V/K tai useammin huomattavasti enemmän; todellakin eräissä tietyntyyppisissä kiteissä, joiden käyttö perustuu leimattuihin vasta-aineisiin, on tavanomaista käyttää niin 15 paljon sidosainetta kuin mahdollista analyytin sidososuuk-sien ylittäessä suuresti 50 %.

Testattavissa nestemäisissä näytteissä analyytin huomattavien osuuksien, esimerkiksi 50 %:n, sitoutumisen vuoksi tällaisissa systeemeissä sidosaineen sidoskohtien 20 osittainen miehittyminen ei ole riippumaton nestemäisen näytteen tilavuudesta, joten tarkoissa kvantitatiivisissa määritysmenetelmissä on välttämätöntä kontrolloida näytteen tilavuutta tarkasti ja pitää se vakiona kaikissa testeissä käytettiinpä tuntematonta näytteen konsentraatiota 25 tai tunnettua standardinäytteen konsentraatiota annos-vas- tekäyrän synnyttämiseksi. Edelleen tällainen systeemi edellyttää myös standardi- tai kontrolli-inkubointiputkis-sa olevan sidosainemäärän tarkkaa kontrollointia. Nämä esillä olevan tekniikan rajoitukset on yleisesti tunnis-30 tettu ja hyväksytty.

GB-patenttihakemus 2 099 57 8A käsittelee laitetta immunomääritysmenetelmiä varten käsittäen huokoisen kiinteän kantajan, johon antigeenit tai harvemmin immunoglo-buliinit sidotaan moniin toisistaan erillään oleviin paik-35 koihin, jolloin kyseinen laite sallii suuren määrän kva- 4 92110 litatiivisia tai kvantitatiivisia inununomäärityksiä suorittamisen samassa kantajassa, esimerkiksi ihmisen veri-seeruminäytteen vasta-aineprofiilin aikaansaamiseksi. Vaikka yksittäiset sijainnit saattavat olla niin kutsut-5 tuina mikropisteinä, jotka on saatu aikaan annostelemalla antigeeniä sisältävien liuosten tai suspensioiden pisaroita, kussakin paikassa läsnäolevien antigeenimoolien lukumäärän kuitenkin kuvitellaan ilmeisesti vielä olevan riittävä, jotta se sitoo pääasiallisesti kaiken analyytin 10 (esim. vasta-aineen), jonka konsentraatio on tarkoitus määrittää ja joka on läsnä nestemäisessä näytteessä testin aikana. Tämä on ilmeistä tosiasiasta, että tässä sovellutuksessa käytetty kvantitatiivinen menetelmä (sivu 3, rivit 21 - 28) käsittää kalibroinnin tunnetuilla määrillä 15 immunoglobuliinia lisättynä kantajaan; mutta tämä tarkoittaa sitä, että testattavissa näytteissä olennaisesti jokainen molekyyli täytyy uuttaa näytteestä, jotta voidaan tehdä todellinen vertailu ja että kuhunkin mikropisteeseen vaaditaan suuria määriä antigeeniä (ts. sidosainetta tässä 20 tilanteessa), suuresti ylimäärin analyytin kokonaismäärästä (ts. vasta-aine tässä tilanteessa), joka on läsnä näytteessä.

Keksinnön yhteenveto

Esillä oleva keksintö käsittää oivalluksen, että 25 suurien sidosainemäärien käyttö ei ole tarpeellista hyvälle herkkyydelle immunomääritysmenetelmissä, eikä se myöskään ole yleensä toivottavaa. Jos sen sijaan, että sidos-aineen määrä pidetään niin suurena kuin mahdollista, sitä rajoitetaan siten, että siihen sidotaan palautuvasti mer-30 kityksettömiä osuuksia analyyttiä, tavanomaisesti alle 10 %, yleensä alle 5 %, optimituloksia varten vain 1 tai 2 % tai vähemmän, niin enää ei ole yksistään pakko käyttää tarkasti kontrolloitua vakiotilavuutta kaikille nestemäisille näytteille (standardiliuokset ja tuntemattomat näyt-35 teet) tietyssä määrityksessä, vaan on mahdollista myös 92110 5 käyttää luotettavia ja joskus jopa parannettuja arvioita analyyttikonsentraatiosta käyttäen paljon vähemmän kuin V/K moolia sidosaineen sidoskohtia, esimerkiksi ei enempää kuin 0,1 V/K ja edullisesti alle 0,01 V/K. Sidosaineelle, 5 jonka analyytin tasapainovakio (K) on suuruusluokkaa 1011 1/mol, ja kooltaan noin 1 ml oleville näytteille tämä vastaa likimäärin enintään 108, edullisesti alle 107, molekyyliä sidosainetta kussakin paikassa eri näytteissä. Jos K-arvo on 1013 1/mol, luvut ovat 106 ja vastaavasti 105 mole-10 kyyllä, ja jos K on suuruusluokkaa 10® 1/mol, ne ovat 1011 ja vastaavasti 1010 molekyyliä. Alle 102 molekyylissä sidosainetta yksittäisessä paikassa mittausten tarkkuudesta tulisi enenevästi pienempi, kun sidosainepaikkojen osittaisen miehittymisen analyytillä olisi mahdollista muuttua 15 vain epäjatkuvin askelin, kun eri paikat miehittyisivät tai eivät miehittyisi, mutta periaatteessa vähintään niin vähän kuin 10 molekyylin käyttö olisi sallittua, jos arvion 10 % tarkkuus olisi hyväksyttävissä. Käytännölliset näkökohdat saattavat lisätä etusijaa useammalle kuin 104 20 molekyylille.

Olen havainnut, että yleisesti ottaen vasta-aineille, joiden affiniteettivakio antigeenin suhteen on K 1/ mol, suhde vasta-aineen konsentraation ja sidoskohtien osittaisen miehittäytymisen välillä tietyssä antigeenikon-25 sentraatiossa ja suhde vasta-ainekonsentraation ja sidos-kohtiin sitoutuneen antigeenin osuuden välillä missä tahansa tietyssä antigeenikonsentraatiossa seuraa samaa käyrää sillä ehdolla, että vasta-aineen konsentraatiot ja antigeenin konsentraatiot ilmaistaan kukin 1/K:n murto-30 osien tai kerrannaisten muodossa. Tätä valaisee oheinen kuvio, joka on graafinen kaavio, joka esittää näitä suhteita kartoittavaa kahta käyräsarjaa. Kukin käyrä liittyy vasta-aineen konsentraatioon [Ab], ilmaistuna 1/K:na, x-akselille piirrettynä. Käyräsarjaa varten, joka jää va-35 kioksi tai laskee, kun [Ab] kasvaa, y-akseli esittää vas- 6

9211 O

ta-aineen sidoskohtien osittaista miehittymistä (F) antigeenillä; toisessa sarjassa y-akseli esittää näihin sidos-kohtiin sitoutuneen antigeenin osuutta (b%). Eri käyrät kussakin sarjassa esittävät neljän erilaisen antigeenikon-5 sentraation [An] ilmaistuna K:n avulla, nimittäin 10/K, 1,0/K, 0,1/K ja 0,01/K vastaavia suhteita. Käyrät osoittavat, että kun [Ab] laskee, F saavuttaa olennaisesti va-kiotason, jonka arvo on riippuvainen [An]:sta.

Tästä voidaan ymmärtää, että yllä mainittu GB-pa-10 tenttihakemus 2 099 578A, joka kvantitatiivisia arvioita varten perustuu suuriin sidosainemääriin ja olennaisesti kaiken analyytin eristämiseen kokonaan, epäonnistuu esillä olevassa keksinnössä saavutetun edun tunnistamisessa; esillä oleva keksintö puolestaan perustuu erilaiseen ana-15 lyyttiseen periaatteeseen, joka edellyttää sidosaineen osittaisen miehittymisen mittaamista ja joka siten edellyttää vain hyvin vähäistä osuutta näytteestä eristettävien, läsnä olevien analyyttimolekyylien kokonaismäärästä.

Kun seurataan havaintoa, että tällaisten pienten 20 sidosainemäärien käyttö on sallittua, tulee mahdolliseksi sijoittaa sidosaine, joka tarvitaan yksittäiseen konsen-traatiomittaukseen, pienelle alalla kiinteätä kantajaa ja siten sijoittaa useita erilaisille analyyteille spesifisiä erilaisia sidosaineita, joita on tai voi olla läsnä *, 25 samanaikaisesti analysoitavassa nesteessä, rinnakkain toi siinsa nähden mutta erillisiin kohtiin yksittäiseen kiinteään kantajaan. Kunkin erillisen kohdan asettaminen samanaikaisesti alttiiksi analysoitavalle nesteelle saa aikaan sen, että kukin paikalla oleva sidosainetäplä tarttuu 30 analyyttiin, jolle se on spesifinen analyyttikonsentraa-tiota nesteessä edustavassa määrässä (ts. osittainen si-doskohdan miehittyminen) sillä ehdolla, että liuoksen tilavuus ja analyytin konsentraatio siinä ovat tarpeeksi suuria, jotta vain merkityksetön osuus (tavallisesti alle 35 10 %, yleensä alle 5 %) analyytistä sitoutuu tähän koh- • * * 92110 7 taan. Kunkin sidosaineen osittainen sidoskohdan miehitty-minen voidaan sitten määrittää käyttäen erillistä paikan tunnistavaa reagenssia, joka tunnistaa eri sidosaineiden joko täyttymättömät tai täyttyneet sidoskohdat ja jotka 5 leimataan merkkiaineilla, jotka sallivat erilaisiin sidos-aineisiin sitoutuneiden erillisten reagenssien konsentraa-tiotasojen mittaamisen, esimerkiksi fluoresoivilla merkkiaineilla. Tällaiset mittaukset voidaan toteuttaa peräkkäin, esimerkiksi käyttäen laseria, joka skannaa kantajan 10 yli» tai samanaikaisesti, esimerkiksi käyttäen valokuvauslevyä, leimojen luonteesta riippuen. Muita kuvantamislait-teita, kuten esimerkiksi televisiokameraa, voidaan myös käyttää, milloin se on sopivaa. Koska sidosaineet ovat erillään toisistaan, on mahdollista käyttää vain pieniä 15 määriä erilaisia merkkiaineleimoja tai jopa samaa merkki-aineleimaa koko ajan tai skannata kukin sidosainepaikka erikseen leiman läsnä olon ja konsentraation määrittämiseksi. Kun käytetään keksintöä, voidaan suorittaa huomattavasti useampia kuin kolme analyysiä altistamalla kiin-20 teä kantaja yhden kerran analysoitavalle nesteelle, esimerkiksi 10, 20, 30, 50 ja jopa 100 tai satoja analyysejä.

Siksi esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittämiseksi tilavuudeltaan V litran nestemäisessä näyt-·. 25 teessä, jolloin menetelmässä useita erilaisia sidosaineita, joista kukin kykenee sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla läsnä nesteessä, ja on spesifinen tälle analyytille verrattuna nestemäisen näytteen toisiin komponentteihin, vie-30 dään kantajavälineeseen useisiin toisistaan erillään oleviin kohtiin siten, ettei yhdelläkään kohdalla ole enempää kuin 0,1 V/K moolia yksittäistä sidosainetta, jolloin K 1/mol on sidosaineen tasapainovakio analyytille, miehitetty kantajaväline ja analysoitava neste saa-35 tetaan kosketukseen siten, että kukin erillään olevista 8

9211 O

kohdista asetetaan kosketukseen samassa toimenpiteessä nestemäisen näytteen kanssa näytteen nestemäärän ollessa sellainen, että vain merkityksetön osuus nestemäisessä näytteessä mahdollisesti läsnä olevasta analyytistä sitou-5 tuu spesifiseen sidosaineeseensa, ja sidosaineiden analyyttien osittaista miehittymistä edustava parametri mitataan toisistaan erillään olevissa kohdissa kilpailevan tai kilpailemattoman määritysmenetelmän tekniikkana käyttäen kullekin sidosaineelle paikan 10 tunnistavaa reagenssia, joka kykenee tunnistamaan joko täyttymättömät sidoskohdat tai täyttyneet sidoskohdat, jolloin kyseisen kohdan tunnistava reagenssi on leimattu merkkiaineella mahdollistaen tietyssä kohdassa olevan kyseisen reagenssin määrän mittaamisen.

15 Keksintö tarjoaa myös laitteen käytettäväksi usei den analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittämiseksi tilavuudeltaan V litran nestemäisessä näytteessä, jolloin laite käsittää kiinteät kantajavälineet, joille on sijoitettu useisiin, toisistaan erillään oleviin kohtiin 20 suuri määrä erilaisia sidosaineita, jolloin kukin sidosai-ne kykenee sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla läsnä nestemäisessä näytteessä, ja on spesifinen tälle analyytille verrattuna muihin nestemäisessä näytteessä oleviin komponentteihin, kun kussakin kohdassa on 25 enintään 0,1 V/K, edullisesti alle 0,01 V/K, moolia eri sidosainetta, jolloin K 1/mol on tämän sidosaineen tasa-painovakio reaktiolle analyytin kanssa, jolle sidosaine on spesifinen.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi 30 tarkoitetut kitit käsittävät keksinnön mukaisen laitteen, useita standardinäytteitä, jotka sisältävät tunnettuja konsentraatioita analyyttejä, joiden konsentraatiot nestemäisessä näytteessä on määrä mitata, ja sarjan leimattuja, kohdan tunnistavia reagensseja reaktioille sidosaineiden 35 täyttyneiden tai täyttymättömien sidosaineiden sidoskoh-tien kanssa.

• · 9 92110

Yksityiskohtainen kuvaus

Kiinteän kantajan valinta on asia, joka jätetään käyttäjälle. Edullisesti kantaja ei ole huokoinen, jolloin sidosaine sijoitetaan sen pinnalle esimerkiksi monokerrok-5 sena. Huokoisten kantajien käyttö voi aiheuttaa sidosai-neen, sen molekulaarisesta koosta riippuen, kulkeutumisen kantajan huokosten sisälle, jossa sen olemiseen esillä analyytille, jonka konsentraatio on tarkoitus määrittää, huokosten geometria voi vaikuttaa siten, että havaitaan 10 väärä lukema. Huokoiset kantajat, kuten nitroselluloosa-paperi, joka on pilkutettu sidosainetäplin, ovat siksi vähemmän edullisia. Toisin kuin GB-julkaisussa 2 099 578A käytetyt kantajat, joiden on oltava huokoisia kiinnitettävien molekyylien suuresta määrästä johtuen, esillä olevas-15 sa keksinnössä käytettävät kantajat käyttävät paljon pienempiä määriä, ja siksi niiden ei tarvitse olla huokoisia. Kantajat, jotka eivät ole huokoisia, voivat esimerkiksi olla muovimateriaalia tai lasia, ja mitä tahansa sopivan jäykkää materiaalia voidaan käyttää. Polystyreeni on edul-20 linen muovimateriaali, vaikka muita polyolefiineja tai akryyleja tai vinyylipolymeerejä voitaisiin käyttää samalla tavalla.

Kantajavälineet voivat käsittää mikrohelmiä esim. sellaisista muovimateriaaleista, jotka voidaan päällystää 25 tasaisilla sidosainekerroksilla ja pitää tietyissä paikoissa, esim. onkaloissa, kantaja-alustalla. Vaihtoehtoisesti materiaali voi olla arkkina tai levynä, joka on täp-litetty sidosainetäpläjonoin. Voi olla eduksi, että kanta-javälineiden rakenne on sellainen, että tilavuudeltaan 30 noin V litran nestemäiset näytteet jäävät helposti kosketukseen useiden, toisistaan erillään olevien paikkojen kanssa, jotka on merkitty erilaisilla sidosaineilla. Erillään olevat paikat voidaan esimerkiksi järjestää kantaja-välineen syvennykseen, ja joukko syvennyksiä, joissa kus-35 sakin on sama ryhmä eri sidosaineita erillään olevissa v»· 10 92110 paikoissa, voidaan yhdistää mikrotiitterilevyn muodostamiseksi, jota voidaan käyttää näytejoukolle.

Kun kantajavälinettä käytetään yhdessä valoskan-nauksen sisältävän mittaussysteemin kanssa, kantajan mate-5 riaali, esim. muovi, on mieluiten valoa läpikuultamaton, se voidaan esimerkiksi täyttää samentavalla materiaalilla, joka voi mm. valkoista tai mustaa, kuten hiilimustalla, kun sidosaineesta tai paikan tunnistavista reagensseista mitattavat signaalit ovat valosignaaleja, kuten fluoresoi-10 vista tai luminoivista merkkiaineista mitattavat signaalit. Tavallisesti heijastavat materiaalit ovat edullisempia tässä tapauksessa lisäämään valon keräämistä ilmaisin-laitteeseen tai valokuvauslevylle. Optimimateriaalin lopullisen valinnan määrää sen kyky kiinnittää sidosaine 15 pinnalleen, taustasignaaliemission puuttuminen siitä ja muut ominaisuudet, jotka pyrkivät maksimoimaan signaali/ kohina-suhteen sen pinnalla olevaan sidosaineeseen kiinnitetylle tietylle merkkiaineelle tai kiinnitetyille merkkiaineille. Erittäin tyydyttäviä tuloksia on saatu alla ku-20 vatuissa esimerkeissä käyttäen valkoista, läpikuultamaton-ta polystyreenimikrotiitterilevyä, joka on kaupallisesti saatavana Dynatech'ista kauppanimellä White Microfluor -mikrotiitterisyvennykset.

Käytettävät sidosaineet voivat olla erilaisen spe-25 sifisyyden omaavia sidosaineita, toisin sanoen aineita, jotka ovat spesifisiä erilaisille analyyteille, tai kaksi tai useammat niistä voivat sidosaineita, joiden spesifisyys on sama mutta joiden affiniteetti on erilainen, toisin sanoen aineita, jotka ovat spesifisiä samalle analyy-30 tille, mutta joiden tasapainovakio K reaktiolle sen kanssa on erilainen. Jälkimmäinen vaihtoehto on erityisen käyttökelpoinen, kun analysoitavan analyytin konsentraatio tuntemattomassa näytteessä voi vaihdella huomattavan suurella alueella, esimerkiksi kaksi tai kolme kertaluokkaa, 35 kuten HCG-mittausten tapauksessa raskaana olevien naisten 11 92110 virtsasta, jossa se voi vaihdella 0,1 - 100 IU/ml tai enemmän.

Käytettävät sidosaineet ovat edullisesti vasta-aineita, edullisemmin monoklonaalista vasta-aineita. Mono-5 klonaalisia vasta-aineita suurelle joukolle biologisten nesteiden aineosia on saatavana kaupallisesti tai niitä voidaan valmistaa tunnetun tekniikan avulla. Käytettävillä vasta-aineilla voi olla tavanomamiset affiniteettivakiot, esimerkiksi yli 108 tai 109 1/mol, esim. suuruusluokkaa 1010 10 tai 1011 1/mol, mutta suuren affiniteetin omaavia vasta-aineita, joiden af f initeettivakiot ovat 1012 - 1013 1/mol, voidaan myös käyttää. Keksinnössä voidaan käyttää sellaisia sidosaineita, jotka eivät itsessään ole leimattuja. On kuitenkin myös mahdollista ja usein toivottavaa käyttää 15 leimattuja sidosaineita siten, että systeemi sidosaine/ analyytti/paikan tunnistava reagenssi käsittää kaksi erilaista saman tyypin leimaa, esim. fluoresoivan, kemilumi-noivan, entsyymin tai radioisotooppisen, yhden sidosai-neessa ja yhden paikan tunnistavassa reagenssissa. Mit-20 tausoperaatio mittaa tällöin kahden signaalin intensiteetin suhteen ja eliminoi siten tarpeen viedä sama määrä leimattua sidosainetta kantajaan, kun signaalit mitataan standardinäytteistä kalibrointitarkoituksiin, kuten mitattaessa signaaleja tuntemattomista näytteistä. Koska sys-; 25 teemi on kokonaan riippuvainen sidoskohtien miehitystä edustavan suhteen mittauksesta, ei myöskään ole tarvetta mitata signaalia koko täplästä, vaan vain osan skannaus on riittävä. Kukin sidosaine on edullisesti leimattu samalla leimalla, mutta eri leimoja voidaan käyttää.

30 Sidosaineet voidaan viedä kantajaan millä tahansa tunnetulla tai tavanomaisesti käytetyllä tavalla, joita käytetään kantajien, kuten putkien, päällystämiseen sidos-aineilla, esimerkiksi antamalla kunkin kantajassa erillään olevan kohdan joutua kosketukseen pienen pisaran muodossa 35 olevan sidosaineliuoksen kanssa, esimerkiksi 0,5 μΐ 1 mm2:n • ·

> 2 Ί Ί O

12 kohtaan, ja antamalla niiden jäädä kosketukseen joksikin aikaa, ennen kuin pisarat pestään pois. Karkeasti vakio, pieni osa sidosainetta, joka on läsnä pisarassa, adsorboituu kantajaan tämän menettelyn seurauksena. On huomattava, 5 että sidosaineen päällystystiheyden mikrotäplässä ei tarvitse olla pienempi kuin päällystystiheyden tavanomaisissa vasta-aineella päällystetyissä putkissa; väheneminen molekyylien määrässä kussakin kohdassa voidaan saada aikaan yksistään pienentämällä kohdassa pikemminkin kokoa kuin 10 päällystystiheyttä. Suuri päällystystiheys on yleensä toivottavaa signaali/kohina-suhteen maksimoimiseksi. Täplien koot ovat suotuisasti alle 10 mm , edullisesti alle 1 mm . Erottuminen on toivottavaa mutta ei välttämätöntä, 2 tai 3 kertaa täplän säde tai enemmän. Tätä ehdotettua geometriaa 15 voidaan kuitenkin muuttaa tarvittaessa; geometriaa rajoittaa yksistään sidosainemolekyylien lukumäärä kussakin täplässä, näytteen minimitilavuus, johon täpläjono asetetaan, ja paikallisesti käytettävissä olevat välineet valmistaa helposti täpläjono edellä kuvatulla tavalla.

20 Kun sidosaine on päällystetty kantajan päälle, on tavanomaista, kun sidosaineet ovat vasta-aineita, pestä kantaja liuoksella, joka sisältää albumiinia tai muuta proteiinia, jäljelle jäävien ei-spesifisten adsorptiokoh-tien kyllästämiseksi kantajassa ja muualla. Jotta varmis-,· 25 tutaan, että sidosainemäärä yksittäisessä täplässä on pie nempi kuin maksimimäärä (0,1 V/K), joka tarvitaan esillä olevan keksinnön periaatteen mukaisesti, yksittäisessä kohdassa läsnä olevan sidosaineen määrä voidaan tarkistaa leimaamalla sidosaine havaittavalla, tunnetun spesifisen 30 aktiivisuuden omaavalla merkkiaineella (ts. tunnettu määrä merkkiainetta sidosaineen yksikköpainoa kohti) ja mittaamalla läsnä olevan merkkiaineen määrä. Täten jos leimatun sidosaineen käyttö ei ole toivottavaa kiinteässä kantajassa, jota käytetään keksinnön menetelmässä, voidaan sidos-35 aine kuitenkin leimata esikokeessa, ja identtisiä olosuh- » » • · 13 92110 teitä, joiden esikokeessa havaittiin saavan aikaan oikean sidosaineiden miehityksen, voidaan käyttää leimaamattomien sidosaineiden viemiseen kantajiin, joita todella käytetään.

5 Nestemäisen näytteen minimikoko (V litraa) korre loidaan sidosaineen moolien lukumäärään (alle 0,1 V/K) siten, että vain merkityksetön osa nestemäisessä näytteessä läsnä olevasta analyytistä sitoutuu sidosaineeseen. Tämä osuus on yleisen säännön mukaan alle 10 %, yleensä 10 alle 5 % ja toivottavasti 1 tai 2 % tai alle, riippuen määritysmenetelmälle toivotusta tarkkuudesta (suurempi tarkkuus saadaan muiden tekijöiden ollessa yhtäläisiä, kun pienempiä analyytin osuuksia sidotaan) ja muiden läsnä olevien, virhettä aiheuttavien tekijöiden suuruudesta.

15 Suuruudeltaan yksi tai muutamia millilitroja olevat tai pienemmät, esim. 100 ^l:aan asti tai sen alle, olevat näytteen koot ovat usein edullisia, mutta saattaa syntyä olosuhteita, joissa suuremmat tilavuudet ovat käytännöllisemmin määritettäviä, ja geometria voidaan asettaa niiden 20 mukaisesti. Näytettä voidaan käyttää sen luonnollisella konsentraatiotasolla tai, jos halutaan, sitä voidaan laimentaa tunnettuun määrään.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyt paikan tunnistavat reagenssit voivat itse olla vasta-aineita, ·. 25 esim. monoklonaalisia vasta-aineita, ja ne voivat olla an- ti-idiotyyppisiä tai antianalyyttivasta-aineita jälkimmäisen tunnistaessa miehitetyt paikat. Vaihtoehtoisesti esimerkiksi pienen molekyylikoon omaavien analyyttien, kuten tyroksiinin (T4), miehittämättömät paikat voidaan tunnis-30 taa käyttäen joko analyyttiä itseään, sopivasti leimattuna, tai kovalenttisesti toiseen molekyyliin - esim. pro-teiinimolekyyliin - kytkettyä analyyttiä, joka on suoraan tai epäsuorasti leimattu. Paikan tunnistavat reagenssit voidaan leimata suoraan tai epäsuorasti tavanomaisilla 35 flouresoivilla leimoilla, kuten fluoreseiinilla, rodamii- » · · 14 921 1 0 14 nilla tai Texas Red'11a, tai materiaaleilla, joita voidaan käyttää aikaerotteisessa pulssitluoresenssissa, kuten eu-ropiumilla tai muita lantanidikelaateilla, tavanomaiseen tapaan. Muita leimoja, kuten kemiluminoivia, entsyymi- tai 5 radioisotooppileimoja voidaan käyttää, jos se on tarkoituksenmukaista. Kukin paikan tunnistava reagenssi on edullisesti leimattu samalla leimalla, mutta eri leimoja voidaan käyttää eri reagensseissa. Paikan tunnistavat rea-genssit voivat olla spesifisiä yhdelle yksittäiselle si-10 dosaineelle/analyyttitäplälle kussakin täplän ryhmässä tai tietyissä olosuhteissa, kuten kun kyseessä ovat glykopro-teiinihormonit, kuten HCG ja FSH, joilla on yhteinen si-doskohta, ne voivat olla ristiin reagoivia reagensseja, jotka kykenevät reagoimaan miehitettyjen sidoskohtien 15 kanssa useammassa kuin yhdessä täplässä.

Määritysmenetelmän tekniikassa signaalit, jotka edustavat sidosaineen osittaista miehittymistä tuntemattoman konsentraation omaavien analyyttien koenäytteissä, voidaan kalibroida vertaamalla niitä annos-vastekäyriin, 20 jotka saadaan standardinäytteistä, jotka sisältävät tunnettuja konsentraatioita samoja analyyttejä. Tällaisten standardinäytteiden ei tarvitse sisältää kaikkia analyyttejä yhdessä sillä ehdolla, että kukin analyytti on läsnä jossakin standardinäytteessä. Osittainen miehittyminen 25 voidaan mitata arvioimalla miehitetyt sidoskohdat (kuten antianalyyttivasta-aineen tapauksessa) tai miehittymättö-mät sidoskohdat (kuten anti-idiotyyppisen vasta-aineen tapauksessa), koska toinen on toisen käänteinen suure. Suurempaa tarkkuutta varten on toivottavaa mitata osuus, 30 joka on lähempänä nollaa, koska muutos osittaisessa mie-hittymisessä 0,01 on suhteellisesti suurempi tässä tapauksessa, vaikka osittaiselle miehittymiselle 25 - 75 %:n alueella kummatkin vaihtoehdot ovat tavallisesti tyydyttäviä.

15 92110 Tässä esillä olevan keksinnön suoritusmuodossa, joka perustuu kahteen fluoresoivaan merkkiaineeseen, kahdesta merkkiaineesta tulevien signaalien, toinen sidosai-neesta ja toinen paikan tunnistavasta reagenssista, suh-5 teellisen intensiteetin mittaaminen voidaan suorittaa sa-mapolttopisteisellä laser-pyyhkäisymikroskoopilla, kuten Bio-Rad Lasersharp MRC 500 -laitteella, joka on saatavana Bio-Rad Laboratories Ltd. -yhtiöstä ja jossa on kaksikanavainen ilmaisinsysteemi. Tämä laite perustuu siihen, että 10 laser-säde skannaa kantajassa olevat täplät tai vastaavat aiheuttaen merkkiaineiden fluoresenssin, ja aallonpituuden suodattimet erottavat ja mittaavat emittoituvan fluoresenssin määrän. Aikaerotteisia fluoresenssimenetelmiä voidaan myös käyttää. Interferenssi (niin kutsuttu ylikuulu-15 minen) kahden kanavan välillä voidaan kompensoida standar-dikorjauksin, jos sitä tapahtuu, tai voidaan ponnistella tavanomaisesti sen vähentämiseksi. Kaksinkertaisesti leimattujen täplien emittoimien kahden fluoresoivan signaalin erottaminen saadaan aikaan tämän laitteen nykyisessä 20 muodossa suodattimin, jotka pystyvät erottamaan kahden fluoresoivan säteilyn ominaisaallonpituudet; fluoresoivia aineita voidaan kuitenkin erottaa muiden fysikaalisten ominaisuuksien avulla, kuten eroavien fluoresenssin hajoa-misaikojen, vaalenemisaikojen jne. avulla, ja mitä tahansa : : 25 näistä keinoista voidaan käyttää joko yksistään tai yhdis telminä kahden fluoroforin erottamiseksi toisistaan, ja näin on mahdollista mitata kahden yksittäisessä täplässä läsnäolevan fluoresoivan, leimatun kokonaisuuden (sidosai-neen ja paikan tunnistavan reagenssin) suhde käyttäen 30 fluoresenssimittausten alalla hyvin tunnettua tekniikkaa.

Kun läsnä on vain yksi fluoresoiva leima, voidaan samaa tekniikkaa käyttää sillä ehdolla, että huolehditaan siitä, että koko täplä skannataan kussakin tapauksessa ja että täplät sisältävät oleellisesti saman määrän sidosainetta 35 määritysmenetelmästä toiseen, kun käytetään tuntemattomia näytteitä ja standardinäytteitä.

• · I

16 92110

Muiden leimojen, kuten radioisotooppisten leimojen, kemiluminoivien leimojen tai entsyymileimojen, tapauksessa tunnetaan hyvin analogisia keinoja yksittäisten signaalien erottamiseksi yhdestä tai kustakin tällaisesta leimaparis-5 ta. Esimerkiksi kaksi radioisotooppia, kuten 125I ja 131I, voidaan helposti erottaa niiden vastaavien radioaktiivisten säteilyjen erilaisten energioiden perusteella. Vastaavasti on mahdollista tunnistaa kahden entsyymireaktion tuotteet, jotka ovat peräisin kaksinkertaisesti entsyymi-10 leimatuista vasta-ainepareista ja ovat esim. erivärisiä, tai kahdesta kerniluminoivasta reaktiosta, esim. erilaisista kemiluminesenssin elinajasta tai valosäteilyn aallonpituudesta, käyttäen hyvin tunnettua tekniikkaa vastaavilla aloilla.

15 Keksintöä voidaan käyttää biologisissa nesteissä läsnä olevien analyyttien, esimerkiksi ihmisen kehon nesteiden, kuten veren, seerumin, syljen tai virtsan analyyttien, analysointiin. Niitä voidaan käyttää lukuisten hormonien, proteiinien, entsyymien tai muiden analyyttien 20 analysointiin, joita voi olla läsnä luonnostaan nestemäisessä näytteessä tai joita voi olla läsnä keinotekoisesti, kuten lääkeaineiden, myrkkyjen tai vastaavien analysointiin.

Keksintöä voidaan esimerkiksi käyttää antamaan 25 käyttöön laite erilaisten raskauteen ja suvun jatkamiseen liittyvien hormonien, kuten FSH:n, LH:n, HCG:n, prolaktiinin ja steroidihormonien (esim. progesteronin, estradio-lin, testosteronin ja androsteenidionin), tai adrenaaliai-volisäkerungon hormonien, kuten kortisolin, ACTH:n ja al-30 dosteronin, tai kilpirauhaseen liittyvien hormonien, kuten T4:n, T3:n ja TSH:n ja niitä sitovan proteiinin, TBG:n, tai virusten, kuten hepatiitin, AIDSin tai herpesviruksen, tai bakteerien, kuten stafylokokin, streptokokin, pneumokokin, gonokokin ja enterokokin, tai kasvaimiin liittyvien 35 peptidien, kuten AFP:n tai CEA:n, tai lääkeaineiden, kuten 92110 17 kiellettyjen, urheilijoiden suorityskykyä luvattomasti parantavien lääkeaineiden, tai elintarvikkeiden epäpuhtauksien kvantitatiiviseen analysointiin. Kussakin tapauksessa käytetyt analyytit ovat spesifisiä analysoitavalle 5 sidosaineelle (verrattuna muihin näytteessä oleviin) ja voivat olla monoklonaalisia vasta-aineita.

Metodologian lähempiä yksityiskohtia löytyy PCT-patenttijulkaisustani W088/01058, jonka sisältö liitetään tähän viitteeksi.

10 Keksintöä kuvataan seuraavin esimerkein.

Esimerkki 1

Anti-TFN (kasvainkuoliotekijä) vasta-aine, jonka TNF: n af f initeettivakio 25 °C:ssa on noin 1 x 109 1/mol, leimataan käyttäen Texas Red'ia. Valmistetaan vasta-aine-15 liuos, jonka konsentraatio on 80 μ9/ιη1, ja 0,5 μ1:η näytteet liuosta lisätään pisaroiden muodossa kuhunkin täyt-teisen, 12 syvennystä sisältävän Dynatech Microfluor -po-lystyreenimikrotiiterilevyn (läpinäkymätön, valkoinen) syvennykseen.

20 Anti-HCG (ihmisen koriongonadotropiini) -vasta-ai ne, jonka HCG:n af f initeettivakio 25 °C:ssa on noin 6 x 108 1/mol, leimataan myös käyttäen Texas Red'ia. Valmistetaan vasta-aineliuos, jonka konsentraatio on 80 μg/mol, ja 0,5 μ1:η näytteet tätä liuosta lisätään pisaroiden muodossa • 25 saman Dynatech Microfluor -mikrotiiterilevyn kuhunkin sy vennykseen.

Pisaroiden lisäyksen jälkeen levy jätetään muutamaksi tunniksi kosteaan ympäristöön pisaroiden haihtumisen estämiseksi. Tänä aikana jotkut pisaroiden vasta-ainemole-30 kyylit adsorboituvat levylle. Seuraavaksi syvennyksiä pes tään useita kertoja fosfaattipuskurilla, ja sitten ne täytetään 400 μίτΐΐβ l-%:ista albumiiniliuosta ja jätetään seisomaan useaksi tunniksi jäljelle jääneiden sidoskohtien kyllästämiseksi syvennyksissä. Sen jälkeen ne pestään 35 uudelleen fosfaattipuskurilla.

• · 921 ΊΟ 18

Tuloksena syntyvän levyn kussakin syvennyksessä on kaksi täplää, kumpikin alaltaan noin 1 mm2. Fluoresenssin määrän mittaukset osoittavat, että kussakin syvennyksessä toinen täplä sisältää noin 5 x 109 molekyyliä anti-TNF-vas-5 ta-ainetta ja toinen sisältää noin 5 x 109 molekyyliä anti-HCG-vasta-ainetta. Syvennykset on suunniteltu käytettäviksi tilavuudeltaan 400 μΐ olevien nestemäisten näytteiden kanssa siten, että 0,1 V/K on 4 x 10'14 moolia (vastaa 2,4 x lO10 molekyyliä) anti-TNF-vasta-aineelle ja 7 x 10*14 moo-10 lia (vastaa 4 x lO10 molekyyliä) anti-HCG-vasta-aineelle.

Esimerkki 2

Mikrotiitterilevyä, joka valmistettiin kuten esimerkissä 1 kuvattiin, käytetään keinotekoisesti valmistettujen TNFrää ja HCG:tä sisältävien liuosten määrityksessä.

15 Liuoksen koenäyte, jonka määrä on noin 400 μΐ, lisätään yhteen syvennyksistä ja sallitaan inkuboitua usean tunnin ajan. Noin 400 μΐ erilaisia standardiliuoksia, joiden TNF-ja HCG-konsentraatiot (0,02, 0,2, 2 ja 20 ng/ml) ovat tunnettuja, lisätään levyn muihin syvennyksiin ja myös niiden 20 annetaan inkuboitua usean tunnin ajan. Syvennykset pestään sitten useita kertoja puskuriliuoksella.

Paikan tunnistavina reagensseina käytetään TNF-täp-liä varten anti-TNF-vasta-ainetta, jonka TNF:n affiniteet-tivakio 25 °C:ssa on noin 1 x lO10 1/mol, ja HCG-täplille 25 anti-HCG-vasta-ainetta, jonka HCG:n affiniteettivakio on 25 °C:ssa noin 1 x 1011 1/mol. Molemmat vasta-aineet on leimattu fluoreseiinilla (FITC). 400 μ1:η näytteet näiden leimattujen vasta-aineiden liuosta lisätään syvennyksiin ja annetaan seistä muutaman tunnin ajan. Syvennykset pes-30 tään sitten puskurilla.

Kuhunkin täplään syntynyt fluoresenssisuhde määri tetään Bio-Rad Lasersharp MCR 500 samapolttopisteisellä mikroskoopilla. Standardiliuoksista muodostetaan annos-vastekäyrät TNFrää ja HCGrtä varten, TNFrlle luvut ovat 35 seuraavanlaisia: 19 92110 TNF-konsentraatio FITC-fluoresenssi_ TNF-täplässä ng/1 Texas Red -fluoresenssi 0,02 1,1 0,2 4,6 5 2 7,9 20 42,5 ja vastaavat luvut HCG:le varten ovat seuraavanlaisia: HCG-konsentraatio FITC-fluoresenssi HCG-täplässä ng/1 Texas Red -fluoresenssi 10 0,02 1,8 0,2 7,2 2 16,0 20 28,2 15 Keinotekoisesti valmistettujen liuosten todettiin antavan suhteelle lukemia 5,9 TNF-täplässä ja 10,5 HCG-täplässä, jotka vastaavat hyvin todellisia TNF (0,5 ng/ml) konsentraatiota ja HCG (0,5 ng/ml) konsentraatioita, jotka saadaan annos-vastekäyrältä.

20 Esimerkki 3 Käyttäen samanlaisia menetelmiä, joita esimerkissä 1 on kuvattu, valmistetaan mikrotiitterilevy, joka sisältää leimatun anti-T4 (tyroksiini) -vasta-aineen (affini-teettivakio on noin 1 x 1011 1/mol 25 °C:ssa) täpliä, leima- * 25 tun anti-TSH (kilpirauhasta stimuloiva hormoni) -vasta- aineen (affiniteettivakio noin 5 x 109 1/mol 25 °C:ssa) täpliä ja leimatun anti-T3 (trijodityroniini) -vasta-aineen (affiniteettivakio noin 1 x 1011 1/mol 25 °C:ssa) täpliä kussakin yksittäisessä syvennyksessä, täplien sisältä-30 essä alle 1 x 10*12 V moolia anti-T4-vasta-ainetta tai alle 2 x 10’11 V moolia anti-TSH-vasta-ainetta tai alle 1 x 10' 12 V moolia anti-T3-vasta-ainetta.

Kehitevasta-aine (paikan tunnistava reagenssi) TSH-määritykseen on anti-TSH-vasta-aine, jonka TSH:n affini-35 teettivakio on 2 x 1010 1/mol 25 °C:ssa. Tämä vasta-aine 4·· 20 92110 leimataan fluoreseiinilla (FITC). Paikan tunnistavia rea-gensseja T4- ja T3-määrityksissä ovat polylysiiniin yhdistetyt, FITC:llä leimatut T4 ja T3, ja ne tunnistavat täyttymättömät kohdat vastaavissa ensimmäisissä vasta-aineis-5 sa.

Kun käytetään 400 μ1:η määriä standardiliuoksia, jotka sisältävät erilaisia tunnettuja määriä T4:ää, T3:a ja TSH:ta, annos-vastekäyrät saadaan käyttäen menetelmiä, jotka ovat analogisia esimerkin 2 menetelmien kanssa, kor-10 reloiden fluoresenssisuhteet T4-, T3- ja TSH-konsentraa- tioihin. Levyä käytetään T4-, T3- ja TSH-tasojen mittaamiseen ihmispotilaiden seerumista tulosten vastatessa hyvin muilla menetelmillä saatuja tuloksia.

Esimerkki 4 15 Käyttäen samanlaisia menetelmiä, joita esimerkissä 1 on kuvattu, valmistetaan mikrotiitterilevy, jossa on ensiksi leimattua anti-HCG-vasta-ainetta (affiniteettivakio on noin 6 x 108 1/mol 25 °C:ssa), toiseksi leimattua anti-HCG-vasta-ainetta (affiniteettivakio noin 1,3 x 1011 20 1/mol 25 °C:ssa) ja leimattua anti-FSH (munarakkulaa stimuloiva hormoni) -vasta-ainetta (affiniteettivakio noin 1,3 x 1081/mol 25 °C:ssa) sisältäviä täpliä kussakin yksittäisessä syvennyksessä, kunkin täplän sisältäessä alle 0,1 V/K moolia vastaavaa vasta-ainetta. Ristiin reagoiva (alfa- • 25 alayksikkö) monoklonaalinen vasta-aine 8D10, jonka affini- teettivakio on 1 x 1011 1/mol, käytetään yhteisenä kehite-vasta-aineena sekä HCG- että FSH-määritysmenetelmiin.

Kun käytetään 400 μ1:η määriä standardiliuoksia, jotka sisältävät erilaisia tunnettuja HCG- ja FSH-konsent-30 raatioita, annos-vastekäyrät saadaan käyttäen menetelmiä, jotka ovat analogisia esimerkin 2 menetelmien kanssa, korreloiden fluoresenssisuhteet HCG- ja FSH-konsentraatioi-hin, jolloin käyrä, joka saadaan suuremman affiniteetin omaavalla anti-HCG-vasta-aineella, antaa konsentraatioher-35 kempiä tuloksia alhaisemmassa HCG-konsentraatiossa, kun * · « 92110 21 taas pienemmän affiniteetin omaavan anti-HCG-vasta-aineen käyrä on konsentraatioherkempi suuremmissa HCG-konsentraa-tiossa. Levyä käytetään naisten virtsassa olevien HCG- ja FSH-konsentraatioiden mittaamiseen raskaustestissä ja saa-5 daan hyvä korrelaatio muilla keinoilla saatujen tulosten kanssa ja saadaan aikaan tehokkaat HCG:n konsentraatio-mittaukset suuruudeltaan kahden tai kolmen kertaluvun kon-sentraatioalueella, kun valitaan oikein paras HCG-täplä ja annos-vastekäyrä.

10 Leimattujen vasta-aineiden valmistaminen

Vasta-aineiden leimaaminen fluoresoivilla leimoilla voidaan toteuttaa käyttäen hyvin tunnettua ja standar-ditekniikkaa, katso Leslie Hudson ja Frank C. Hay, "Practical Immunology", Blackwell Scientific Publications 15 (1980), sivut 11 - 13, esimerkiksi seuraavasti:

Monoklonaalinen vasta-aine anti-FSH 3G3, FSH-spesi-finen (beeta-alayksikkö) vastaine, jonka affiniteettivakio (K) on 1,3 x 10® 1/mol, valmistettiin Middlesex Hospital Medical School'ssa, ja se leimattiin TRITC:llä (rodamiini-20 isotiosyanaatti) tai Texas Red:11a, jotka antavat punaisen fluoresenssin.

Monoklonaalinen vasta-aine anti-TSH 8D10, ristiin reagoiva (alfa-alayksikkö) vasta-aine, jonka affiniteetti-vakio (K) on 1 x 1011 1/mol, valmistettiin vastaavasti *· 25 Middlesex Hospital Medical School'ssa ja leimattiin FITC:llä (fluoresiini-isotiosyanaatti), joka antaa kel-tavihreän fluoresenssin.

Tavanomaisesti käytetty menettely käsittää vesivat-sanesteen puhdistuksen (ammoniumsulfaattisaostus ja T-gee-30 likromatografia), joita seuraa leimaaminen, seuraavien vaiheiden mukaisesti: l.a. Ammoniumsulfaattipuhdistus 1. Lisää 4,1 ml kyllästettyä ammoniumsulfaatti-liuosta 5 ml:aan vasta-ainevalmistetta (viljelysuperna-35 tantti tai 1:5 laimennettu vesivatsaneste) tasaisesti sekoittaen (45-%:inen kyllästys).

22 92110 2. Jatka sekoittamista 30 - 90 minuutin ajan. Sent-rifugoi 2 500 kerrosta minuutissa 30 minuutin ajan.

3. Heitä pois supernatantti ja liuota sakka PBSrään (lopullinen tilavuus 5 ml.). Toista vaiheet 1 ja 2, TAI

5 4. Lisää 3,6 ml kyllästettyä ammoniumsulfaattia (40-%:inen kyllästys) sekoittaen tasaisesti. Toista vaihe 2.

5. Heitä pois supernatantti ja liuota nappi haluttuun puskuriin.

10 6. Dialysoi yön yli kylmässä samaa puskuria vastaan (käyttäen tuoretta, deionisoidussa vedessä keitettyä dia-lyysipussia).

7. Määritä proteiinikonsentraatio joko A280:ssa tai Lowryn arviota käyttäen.

15 l.b. T-geelikromatografia: (Puskuri: 1 M Tris-Cl, pH 7,6. kiinteä kaliumsulfaatti) 1. Puhdista 2 ml vesivatsanestettä sentrifugoimalla 4 000 kierrosta minuutissa.

2. Lisää 1 M Tris-Cl-liuos saadaksesi lopulliseksi 20 konsentraatioksi 0,1 M.

3. Lisää riittävä määrä kiinteätä kaliumsulfaattia. Lopullinen konsentraatio = 0,5 M.

4. Laita vesivatsaneste T-geelipylvääseen.

5. Pese pylväs 0,1 M Tris-Cl-puskurilla, joka si- : 25 sältää 0,5 M kaliumsulfaattia, kunnes proteiinikuvio (A280:ssä) palaa nollaan.

6. Eluoi adsorboitunut proteiini käyttäen 0,1 M Tris-Cl-puskuria eluenttina.

7. Yhdistä vasta-ainetta sisältävät fraktiot ja 30 konsentroi käyttäen Amicon 30 -väkevöimislaitetta.

8. Jos HPHT-puhdistus toteutetaan, käytä HPHT-kro-matografin aloituspuskuria vaiheen 7 aikana.

2. Vasta-aineiden FITC/TRITC-yhdistelmien leimaaminen: 35 1. Dialysoi puhdistettu 1 g proteiinia 0,25 M kar- 23 92110 bonaattibikarbonaattipuskuriin, pH 9,0, konsentraatioon 20 mg/ml.

2. Lisää FITC/TRITC saadaksesi suhde 1:20 proteiinin kanssa (ts. 0,05 mg kutakin 1 mg proteiinia kohti).

5 3. Sekoita ja inkuboi 4 °C:ssa 16 - 18 tunnin ajan.

4. Erota konjugoitunut proteiini konjugoitumatto-masta seuraavasti: a. Sephadex G-25 -kromatografia FITC-leimaa varten tai 10 b. DEAE-Sephacel-kromatografia TRITC/FITC-leimaa varten.

Puskurisysteemi: PBS (a):ta varten; 0,005 M fosfaatti, pH 8,0, ja 0,18 M 15 fosfaatti, pH 8,0, (b):tä varten.

FITC:n laskeminen: Proteiinin kytkeytymissuhde: 2,87 X O.D.495 nm O.D.280 nm - 0.35 x O.D.495 nm u ·

Claims (11)

9211 O 24

1. Menetelmä useiden analyyttien vallitsevien kon-sentraatioiden määrittämiseksi tilavuudeltaan V-litraises- 5 sa nestemäisessä näytteessä, tunnettu siitä, että viedään useita erilaisia sidosaineita, joista kukin kykenee sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla läsnä nestemäisessä näytteessä, ja on spesifinen tälle analyytille verrattuna muihin nestemäisen näytteen 10 komponentteihin, kantajavälineeseen useisiin, toisistaan erillään oleviin kohtiin siten, ettei yhdessäkään kohdassa ole enempää kuin 0,1 V/K moolia yksittäistä sidosainetta, jolloin K 1/mol on sidosaineen tasapainovakio analyytille; 15 saatetaan miehitetty kantajaväline kosketukseen analysoitavan nestemäisen näytteen kanssa siten, että kukin erillään oleva kohta saatetaan kosketukseen samassa toimenpiteessä nestemäisen näytteen kanssa, jolloin näytteessä oleva nesteen määrä on sellainen, että ainoastaan 20 merkityksetön osuus nestemäisessä näytteessä läsnä olevasta analyytistä sitoutuu sille spesifiseen sidosaineeseen, ja mitataan sellainen parametri, joka edustaa sidosai-neiden osittaista miehittymistä analyyteillä toisistaan « 25 erillään olevissa kohdissa kilpailevalla tai kilpailemat- tomalla määritysmenetelmällä käyttäen kullekin sidosai-neelle paikan tunnistavaa reagenssia, joka kykenee tunnistamaan täyttymättömän sidoskohdan tai täyttyneen sidos-kohdan sidosaineessa, jolloin kyseinen paikan tunnistava 30 reagenssi leimattu merkkiaineella, joka sallii kyseisen reagenssin määrän mittauksen tietyssä kohdassa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kussakin erillään olevassa kohdassa on alle 0,01 V/K moolia yksittäistä sidosainetta. • 1 25 92110

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettyjen sidosaineiden ta-sapainovakiot analyyteille ovat 108 - 1013 1/mol.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että käytettyjen sidosaineiden ta-sapainovakiot analyyteille ovat suuruusluokkaa 1010 tai 1011 1/mol kohti.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nestemäisen näytteen tilavuus 10 on enintään 0,1 litraa.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nestemäisen näytteen tilavuus on 400 - 1 000 μΐ.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että kantajavälineeseen miehitetyt sidosaineet ovat vasta-aineita analyytille, jonka konsent-raatio on tarkoitus määrittää.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sidosaineet on leimattu merk- 20 kiaineilla, jotka mahdollistavat sidosaineen konsentraa- tiotasojen mittaamisen.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sidosaineet ja paikan tunnistavat reagenssit leimataan fluoresenssimerkkiaineilla si- : 25 ten, että yksittäisissä, erillään olevissa kohdissa määri tysmenetelmän sidosaineiden osittaista miehittymistä mit-taava tekniikka mittaa fluoresoivien merkkiaineiden emit-toimien signaalien suhteita.

10. Laite käytettäväksi patenttivaatimuksen I mu- 30 kaisessa menetelmässä useiden analyyttien vallitsevien konsentraatioiden määrittämiseen nestemäisessä, tilavuudeltaan V-litraisessa näytteessä, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän kantajavälineen, jolle on sijoitettu useisiin erillään oleviin kohtiin useita erilaisia 35 sidosaineita, kunkin sidosaineen ollessa kykenevä sitomaan • · 26 92110 palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla läsnä nestemäisessä näytteessä, ja ollessa spesifinen tälle analyy-tille verrattuna muihin nesteen komponentteihin, ja kussakin kohdassa on enintään 0,1 V/K moolia yksittäistä si-5 dosainetta, jolloin K 1/mol on tämän sidosaineen tasapai-novakio reaktiolle analyytin kanssa, jolle se on spesifinen.

11. Kitti käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä useiden analyyttien vallitsevien 10 konsentraatioiden määrittämiseen nestemäisessä, tilavuudeltaan V-litraisessa näytteessä, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän kantajavälineen, jolle on sijoitettu useisiin erillään oleviin kohtiin useita erilaisia sidosainei-15 ta, kunkin sidosaineen kyetessä sitomaan palautuvasti analyytin, joka on tai voi olla läsnä nestemäisessä näytteessä, ja ollessa spesifinen tälle analyytille verrattuna muihin nestemäisen liuoksen komponentteihin, ja kussakin kohdassa on enintään 0,1 V/K, edullisesti alle 0,01 V/K, 20 moolia yksittäistä sidosainetta, jolloin K 1/mol on tämän sidosaineen tasapainovakio reaktiolle analyytin kanssa, jolle se on spesifinen, tunnettuja konsentraatioita useita standardinäyt-teitä, jotka sisältävät analyyttejä, joiden konsentraatiot : 25 nestemäisessä näytteessä mitataan, ja sarjan leimattuja, paikan tunnistavia reagensseja reaktiolle täyttyneiden ja täyttymättömien sidoskohtien kanssa sidosaineissa. 27 921 1 0