CN117092566B - 一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法及其应用,涉及检测仪器领域。该方法包括:制备磁微粒浓度‑荧光素信号值的标准曲线;利用免疫分析仪检测磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条检测孔中的待测样品,并获取待测样品的荧光素信号值;基于磁微粒浓度‑荧光素信号值的标准曲线和待测样品的荧光素信号值,计算待测样品的磁微粒浓度,并基于待测样品的磁微粒浓度和初始磁微粒浓度计算免疫分析仪磁微粒的丢磁率。该方法检测分析完的样品可直接在免疫分析仪上检测荧光素信号值,可避免待测样品转移过程中的复杂操作和样品损耗,而且检测范围较宽,对精度要求更低,可真实反应磁微粒免疫荧光分析法中磁微粒的丢磁率。
Description
技术领域
本发明涉及检测仪器技术领域,尤其涉及一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法及其应用。
背景技术
免疫分析仪为磁微粒免疫荧光分析法的检测仪器,通过检测负载样本的磁微粒上的荧光信号,可获取样本中标志物的信息。免疫分析仪在进行一系列步骤操作的同时,磁微粒会有损耗,磁微粒的数量与荧光素信号值的高低密切相关,磁微粒损耗将导致荧光素信号值降低,使得测量结果不准确。因此,为了提高仪器测量的准确性,定量检测磁微粒的损耗是十分有必要的。
目前磁微粒的丢磁率是采用称重法计算。称重法是将反应前的磁微粒进行称重得到重量m1,经过一系列反应步骤后再次对磁微粒进行称重得到重量m2。通过(m1-m2)/m1来计算中间操作磁微粒的丢磁率。然而,由于称重法对天平的精密度要求较高,因而采用称重法计算丢磁率对高精密度的仪器与微量反应仪器并不适用。例如:微量天平XPR2U/AC量程为2.1 g;可读性为0.1 µg;而对于免疫分析仪,试剂条重量需精确到0.01µg,该种情况,上述微量天平无法读出试剂条精度最后一位的数据,无法满足测量需求。另一方面,称重法在实验过程中需要反复去皮等操作,而且每一步的液体残留量对称重结果也会有较大的影响,导致得到的丢磁率不能真实的反映仪器的丢磁率。
因此,提供一种可准确反映磁微粒丢磁率的检测方法,是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明公开了一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法及其应用,以解决相关技术中采用称重法测量磁微粒的丢磁率,存在对高精密度的仪器与微量反应仪器并不适用,而且称重法不能真实反映仪器丢磁率的技术问题。
为了解决上述问题,本发明采用下述技术方案:
本发明的第一个方面提供了一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法。
本发明免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,包括如下步骤:
步骤S1:制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线;
步骤S2:利用免疫分析仪检测磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条检测孔中的待测样品,并获取待测样品的荧光素信号值;
步骤S3:基于磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线和待测样品的荧光素信号值,计算待测样品的磁微粒浓度,并基于待测样品的磁微粒浓度和初始磁微粒浓度计算免疫分析仪磁微粒的丢磁率。
进一步的,制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线包括如下步骤:
步骤S11:将磁微粒标记荧光素,并配置不同浓度的多个磁微粒标准液;
步骤S12:测量各磁微粒标准液的荧光素信号值,并将所得的荧光素信号值与磁微粒标准液浓度值拟合得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线。
进一步的,将磁微粒标记荧光素,并配置不同浓度的多个磁微粒标准液包括如下步骤:
步骤S111:将荧光素溶解于第一缓冲溶液中,并将溶解有荧光素的第一缓冲溶液加入不同重量的磁微粒中,将磁微粒和第一缓冲溶液放入恒温震荡仪中反应;
步骤S112:将反应后的磁微粒取出并进行清洗;
步骤S113:将清洗后的磁微粒加入第二缓冲溶液中并混匀,所得溶液为磁微粒标准液。
进一步的,获取待测样品的荧光素信号值包括:获取反应结束时待测样品的荧光素信号值,和/或获取反应中间过程待测样品的荧光素信号值。
进一步的,获取反应结束时待测样品的荧光素信号值包括如下步骤:
步骤S21-1:获取反应结束时免疫分析仪各通道处的试剂条检测孔中待测样品的荧光素信号值;
步骤S22-1:计算所有通道处的试剂条检测孔中待测样品荧光素信号值的平均值,并以平均值作为反应结束时待测样品的荧光素信号值。
进一步的,获取反应中间过程待测样品的荧光素信号值包括如下步骤:
步骤S21-2:将磁微粒放入免疫分析仪各通道处的试剂条样本孔中,按照磁微粒免疫荧光分析法的步骤进行操作,待每一个步骤结束后,均获取各通道处的试剂条检测孔中待测样品的荧光素信号值;
步骤S22-2:计算所有通道处的试剂条各检测孔中待测样品荧光素信号值的平均值,并以平均值作为各步骤结束时待测样品的荧光素信号值。
进一步的,所述通道的数量为2~8个。
进一步的,通过如下公式计算免疫分析仪磁微粒的丢磁率:
丢磁率=(M-N)/M*100%,
其中,M为初始磁微粒浓度,N为待测样品的磁微粒浓度。
本发明的第二个方面提供了一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用。
本发明中任一项技术方案所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,基于反应结束时待测样品的磁微粒量和磁微粒损失量之和,确定免疫分析仪检测初始阶段添加的磁微粒量。
本发明中任一项技术方案所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,基于磁微粒免疫荧光分析法各步骤的磁微粒丢磁率,调整磁微粒免疫荧光分析法各步骤的分析参数。
本发明采用的技术方案至少能够达到以下有益效果:
本发明免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,第一方面,利用免疫分析仪检测磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条检测孔中的待测样品,并获取待测样品的荧光素信号值,即本发明的方法利用免疫分析仪自身来检测磁微粒的丢磁率,因而检测分析完的样品可直接在免疫分析仪上检测荧光素信号值,而无需将待检测样品转移至另一检测仪器进行检测,不仅可避免待测样品转移过程中的复杂操作和样品损耗,而且相比于称重法,由于免疫分析仪可利用光学探测器检测荧光素信号值,具有可检测的范围较宽,对精度要求更低,避免了称重法测量磁微粒的丢磁率,对天平的精度要求较高,导致高精密度的仪器与微量反应仪器并不适用的问题;第二方面,本发明磁微粒丢磁率的检测方法,待测样品的检测仪器和检测参数与进行磁微粒免疫荧光分析法检测的检测仪器和检测参数相同,从而使得本发明的检测方法可真实反应磁微粒免疫荧光分析法中磁微粒的丢磁率,也解决了现有技术中采用称重法不能真实反映仪器丢磁率的技术问题。
此外,本发明优选技术方案还能够达到以下有益效果:
本发明优选技术方案免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,获取待测样品的荧光素信号值包括:获取反应结束时待测样品的荧光素信号值,和/或获取反应中间过程待测样品的荧光素信号值,即本发明优选技术方案免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,不仅可获取微粒免疫荧光分析法由开始到结束时磁微粒的损耗,以便控制磁微粒免疫荧光分析法开始时样品的加入量,而且还可获取微粒免疫荧光分析法中间过程每个检测步骤的磁微粒损耗,以便基于每个检测步骤的磁微粒损耗,调节磁微粒免疫荧光分析法各步骤的参数,从而提高仪器的检测精密度。另外,相比于现有技术中将待测样品转移至另一仪器进行检测的方法,由于本发明优选技术方案的检测方法可直接在免疫分析仪的原位上检测待检测样品的荧光素信号值,而无需将待检测样品转移至另一仪器进行检测,从而可快速且真实的获取每个检测步骤中的磁微粒损耗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例磁微粒浓度-荧光素信号值的第一标准曲线图;
图2是本申请实施例磁微粒浓度-荧光素信号值的第二标准曲线图;
图3是本申请实施例磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条的结构示意图;
图4是本申请实施例磁微粒浓度-荧光素信号值的第三标准曲线图。
图中:1、试剂条主体;2、手柄;3、样品孔;4、磁珠储存孔;5、第一反应孔;6、第一清洗孔;7、第二清洗孔;8、第二反应孔;9、第三清洗孔;10、第四清洗孔;11、第三反应孔;12、第五清洗孔;13、第六清洗孔;14、预留稀释孔;15、空白区域;16、检测孔;17、挡片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。
本申请的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施,且“第一”、“第二”等所区分的对象通常为一类,并不限定对象的个数,例如第一对象可以是一个,也可以是多个。此外,说明书以及权利要求中“和/或”表示所连接对象的至少其中之一,字符“/”,一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请的发明构思为:传统磁微粒丢磁率的检测方法,需要将待检测样品转移至天平上进行称量,该种方式,不仅操作过程繁琐、对天平精度要求较高,而且得到的丢磁率不能真实反映仪器的丢磁率,本申请利用免疫分析仪自身来检测磁微粒的丢磁率,因而检测分析完的样品可直接在免疫分析仪上检测荧光素信号值,而无需将待检测样品转移至另一检测仪器进行检测,不仅可避免待测样品转移过程中的复杂操作和样品损耗,而且可检测的范围较宽,对精度要求更低,也可真实反映免疫分析仪磁微粒的丢磁率。
本申请的免疫分析仪可以是全自动免疫分析仪、也可以是半自动免疫分析仪,也可以是手动分析仪。例如:全自动免疫分析仪可为本申请人的另一件公开号为CN116773841A,名称为“一种基于激光共聚焦技术的全自动免疫分析仪及其检测方法”专利中所述的结构和方法,因此全自动免疫分析仪及利用该分析仪检测荧光素信号值的方法在此不再赘述,具体内容详见上述专利。同样的,半自动免疫分析仪和手动免疫分析仪的结构及其检测方法也为现有技术,在此不再一一赘述。
下面结合附图1~图4,通过具体的实施例及其应用场景对本申请实施例提供的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法及其应用进行详细地说明。
本实施例的第一方面提供了一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法。
本实施例免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,包括如下步骤:
步骤S1:制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线。优选的,可基于抗原-抗体对荧光素信号值的影响,选择制备含有抗原-抗体的标准曲线,或者不含有抗原-抗体的标准曲线。具体的,不同的磁珠-抗体物质,可制备不同的标准曲线,使得标准曲线与待测样品具有一致性,避免抗体对荧光信号值造成干扰,从而可提高检测的可靠性。
步骤S2:利用免疫分析仪检测磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条检测孔中的待测样品,并获取待测样品的荧光素信号值。具体的,按照磁微粒免疫荧光分析法的步骤进行检测后的样品,作为磁微粒丢磁率检测的待测样品,通过免疫分析仪检测该待测样品的荧光素信号值。
步骤S3:基于磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线和待测样品的荧光素信号值,计算待测样品的磁微粒浓度,并基于待测样品的磁微粒浓度和初始磁微粒浓度计算免疫分析仪磁微粒的丢磁率。具体的,在计算丢磁率时,初始磁微粒浓度为已知值。
由于干的磁微粒无法使用,需要将其溶于缓冲溶液中,因此本申请实施例采用磁微粒浓度来表达溶液中磁微粒的含量。可知的,也可将磁微粒浓度换算成磁微粒质量,从而得到磁微粒质量-荧光素信号值的标准曲线。本申请实施例以磁微粒浓度来表达溶液中磁微粒含量为例进行说明。
磁微粒的数量与荧光素信号值的高低密切相关。一般来说,磁微粒的数量多,荧光素信号值高;磁微粒的数量少,荧光素信号值低。本申请通过标记方式将磁微粒与荧光素结合,荧光素结合在磁微粒上,通过检测荧光素信号则可确定磁微粒数量,从而可确定磁微粒丢磁率。优选的,考虑到标记效率的差异,可使用同一批标记的磁微粒进行一次实验,以尽可能减小差异。
优选的,荧光素的选取应当与免疫分析仪相适应。具体的,不同的分析仪有特定的激发光与接收光,同一种荧光素在不同的激发光下接收光不同,因此要根据分析仪本身性能选取该分析仪可识别波段下的荧光素。例如:若免疫分析仪上安装近红外的激发光与接受光,则本实施例在制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线时,所选用的荧光素也应当是用近红外波段的荧光素。近红外光(Near Infrared,NIR)是介于可见光(ⅥS)和中红外光(MIR)之间的电磁波,按ASTM(美国试验和材料检测协会)定义,近红外光是指波长在780~2526nm范围内的电磁波。近红外光可分为近红外短波(780~1100nm)和近红外长波(1100~2526nm)两个区域。更优选的,免疫分析仪使用的是近红外波段的荧光素,本实施例在制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线时,所选用的荧光素为790nm波段的荧光素。
本实施例免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,第一方面,利用免疫分析仪检测磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条检测孔中的待测样品,并获取待测样品的荧光素信号值,即本实施例的方法利用免疫分析仪自身来检测磁微粒的丢磁率,因而检测分析完的样品可直接在免疫分析仪上检测荧光素信号值,而无需将待检测样品转移至另一检测仪器进行检测,不仅可避免待测样品转移过程中的复杂操作和样品损耗,而且相比于称重法,由于免疫分析仪可利用光学探测器检测荧光素信号值,具有可检测的范围较宽,对精度要求更低,避免了称重法测量磁微粒的丢磁率,对天平的精度要求较高,导致高精密度的仪器与微量反应仪器并不适用的问题;第二方面,本实施例磁微粒丢磁率的检测方法,待测样品的检测仪器和检测参数与进行磁微粒免疫荧光分析法检测的检测仪器和检测参数相同,从而使得本实施例的检测方法可真实反应磁微粒免疫荧光分析法中磁微粒的丢磁率,也解决了现有技术中采用称重法不能真实反映仪器丢磁率的技术问题。
根据一个优选实施方式,制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线包括如下步骤:
步骤S11:将磁微粒标记荧光素,并配置不同浓度的多个磁微粒标准液;
优选的,将磁微粒标记荧光素,并配置不同浓度的多个磁微粒标准液包括如下步骤:
步骤S111:将荧光素溶解于第一缓冲溶液中,并将溶解有荧光素的第一缓冲溶液加入不同重量的磁微粒中,将磁微粒和第一缓冲溶液放入恒温震荡仪中反应;
步骤S112:将反应后的磁微粒取出并进行清洗;
步骤S113:将清洗后的磁微粒加入第二缓冲溶液中并混匀,所得溶液为磁微粒标准液。
步骤S12:测量各磁微粒标准液的荧光素信号值,并将所得的荧光素信号值与磁微粒标准液浓度值拟合得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线。
本实施例优选技术方案免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,通过制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,即可获得磁微粒浓度与荧光素信号值之间的关系,再通过获取待测样品的荧光素信号值,即可计算出待测样品的磁微粒浓度。可知的,磁微粒标准液的数量越多,获得的磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线越准确。一般情况下磁微粒标准液的数量为5~10个。
具体的,配置浓度为0mg/ml、1mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、100mg/ml的磁微粒标准液。以磁微粒浓度为1mg/ml为例,说明标磁微粒准液的配置过程:
(1)取1mg购买的磁微粒(磁微粒的大小、颜色、基团与抗体修饰手法由仪器本身决定),加入10μL含有荧光素的第一缓冲溶液(荧光素购买来为冻干粉末,经第一缓冲溶液复溶使其终浓度为1mg/ml),将磁微粒和第一缓冲溶液放入恒温震荡仪中反应2h;
(2)然后经清洗、除上清液、储存等步骤得到标记有荧光素的磁微粒(经清洗后磁微粒为不含第一缓冲液的状态);
(3)向标记有荧光素的磁微粒中加入1ml第二缓冲溶液并混匀,得到磁微粒浓度为1mg/ml的磁微粒母液(1mg/ml为磁微粒的理论浓度)。
更具体的,第一缓冲溶液和第二缓冲溶液可为现有技术中常见的缓冲溶液,由于缓冲溶液的种类对检测结果造成的影响可忽略(详见后文表5和表6所示),因此,此处并不对缓冲溶液的种类进行限定,一般使用常见的磷酸盐缓冲溶液,只要使待检测样品保持湿润状态即可。
其余磁微粒浓度的配置方法参照上述过程,在此不再赘述。
测量各磁微粒标准液的荧光素信号值,并将所得的荧光素信号值与磁微粒标准液浓度值拟合得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,包括如下步骤:
(2)将上述八个磁微粒标准液放入单人份检测试剂条的检测孔,利用免疫分析仪进行检测,得到8个不同荧光素信号值,具体所得数据如下表1所示;
(3)将得到的8个荧光素信号值与磁微粒标准液浓度值进行线性拟合,得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线(该标准曲线为不含抗体的磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,其余含有抗体的磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,也可以参照该方法获取)。
表1 各磁微粒标准液所得的荧光素信号值表
检测对象 | 磁微粒浓度(mg/ml) | 荧光素信号值(counts) |
第一标准液 | 0 | 780 |
第二标准液 | 1 | 1300 |
第三标准液 | 10 | 32773 |
第四标准液 | 20 | 85674 |
第五标准液 | 30 | 152183 |
第六标准液 | 40 | 197654 |
第七标准液 | 50 | 305806 |
第八标准液 | 100 | 589219 |
,
对上述数据进行拟合,得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线图如图1所示。具体的,磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线方程为:y=6017.3x-18120,R²=0.9921。
根据一个优选实施方式,获取待测样品的荧光素信号值包括:获取反应结束时待测样品的荧光素信号值,和/或获取反应中间过程待测样品的荧光素信号值。本实施例优选技术方案免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,不仅可获取微粒免疫荧光分析法由开始到结束时磁微粒的损耗,以便控制磁微粒免疫荧光分析法开始时样品的加入量,而且还可获取微粒免疫荧光分析法中间过程每个检测步骤的磁微粒损耗,以便基于每个检测步骤的磁微粒损耗,调节磁微粒免疫荧光分析法各步骤的参数,从而提高仪器的检测精密度。另一方面,相比于现有技术中将待测样品转移至另一仪器进行检测的方法,由于本实施例优选技术方案的检测方法可直接在免疫分析仪上检测待检测样品的荧光素信号值,而无需将待检测样品转移至另一仪器进行检测,从而可快速且真实的获取每个检测步骤中的磁微粒损耗。
优选的,获取反应结束时待测样品的荧光素信号值包括如下步骤:
步骤S21-1:获取反应结束时免疫分析仪各通道处的试剂条检测孔中待测样品的荧光素信号值;
步骤S22-1:计算所有通道处的试剂条检测孔中待测样品荧光素信号值的平均值,并以平均值作为反应结束时待测样品的荧光素信号值。
本实施例优选技术方案免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,可通过一台免疫分析仪先后对多个待测样品进行测量,而且还通过多个样品荧光素信号值的平均值作为反应结束时待测样品的荧光素信号值,可提高检测结果的准确性。
优选的,获取反应中间过程待测样品的荧光素信号值包括如下步骤:
步骤S21-2:将磁微粒放入免疫分析仪各通道处的试剂条样本孔中,按照磁微粒免疫荧光分析法的步骤进行操作,待每一个步骤结束后,均获取各通道处的试剂条检测孔中待测样品的荧光素信号值;
步骤S22-2:计算所有通道处的试剂条各检测孔中待测样品荧光素信号值的平均值,并以平均值作为各步骤结束时待测样品的荧光素信号值。
本实施例优选技术方案免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,待每一个步骤结束后,均获取各通道处的试剂条检测孔中待测样品的荧光素信号值,即可通过一台免疫分析仪先后对每个步骤结束后的多个待测样品进行测量,而且还通过多个样品荧光素信号值的平均值作为每个步骤反应结束时待测样品的荧光素信号值,可提高检测结果的准确性。
根据一个优选实施方式,通道的数量为2~8个。优选的,免疫分析仪的数量通常为8通道,检测磁微粒丢磁率时,一般选用8个通道,相比于现有技术中一般仅通过三个待测样品的检测结果取平均值的方式,本实施例优选技术方案的检测结果准确性更高。不限于此,也可以只使用2个通道、3个通道、4个通道、5个通道、6个通道或7个通道来检测磁微粒丢磁率。
根据一个优选实施方式,通过如下公式计算免疫分析仪磁微粒的丢磁率:丢磁率=(M-N)/M*100%,其中,M为初始磁微粒浓度,N为待测样品的磁微粒浓度。具体的,当检测反应结束时磁微粒的丢磁率时,M为初始磁微粒浓度,N为反应结束时待测样品的磁微粒浓度;当检测反应中间某一步骤磁微粒的丢磁率时,M为该步骤初始磁微粒浓度,N为该步骤结束时待测样品的磁微粒浓度。M为已知量(例如可用已知浓度的标准液),N为测量结果,从而可计算出整体的丢磁率或中间步骤的丢磁率。
对于不同的待测样品,均可采用图1所示的第一标准曲线。进一步的,为了使得标准曲线与待测样品具有更高的一致性,对于不同的磁珠-抗体待测样品,可制备不同的标准曲线,避免抗体对荧光信号值造成干扰,从而可提高检测的可靠性。
下面以磁微粒-CA125第一抗体-CA125抗原-CA125第二抗体为例,说明磁微粒-CA125第一抗体-CA125抗原-CA125第二抗体标准曲线的制备过程。具体如下:
(1)取0.02mg的CA125第二抗体、30µg的荧光素(CA125第二抗体、荧光素和下述CA125第一抗体的加入量不限于此,具体是基于项目实际情况确定,例如可为该物质在项目中的上限值);
(2)将CA125第二抗体和荧光素加入离心管中,反应过夜后经过透析收集定容到200μL,得到第一混合溶液;
(3)取1mg的磁微粒、15µg的CA125第一抗体;
(4)将磁微粒和CA125第一抗体加入离心管中,反应2~3h后将得到的磁微粒用磁微粒储存液(也可以说是缓冲溶液)进行定容保存,所得磁微粒终浓度为1mg/ml,得到第二混合溶液;
(5)将第二混合溶液取出50μL-200μL放入新的离心管中,去除掉磁微粒储存液,加入100 μL的CA125抗原,反应30min以后经过清洗,然后加入100μL经过300-1200倍稀释后的第一混合溶液,反应10min,经过清洗后加入1ml的磁微粒储存溶液,得到第三混合溶液;
(6)将第三混合溶液进行梯度(不限于对倍稀释,可以有3倍或者其他的稀释方案)稀释,得到6个不同磁微粒含量的磁微粒标准溶液;
(7)将不同磁微粒含量的磁微粒标准溶液放入试剂条的检测孔中进行检测,得到对应的信号值,根据磁微粒浓度-荧光素信号值,形成标准曲线。
表2 各磁微粒标准液所得的荧光素信号值表
检测对象 | 磁微粒浓度(mg/ml) | 荧光素信号值(counts) |
第一标准液 | 1 | 282327 |
第二标准液 | 0.5 | 137231 |
第三标准液 | 0.25 | 54484 |
第四标准液 | 0.125 | 23018 |
第五标准液 | 0.063 | 9476 |
第六标准液 | 0.031 | 3057 |
,
对上述数据进行拟合,得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线图如图2所示。具体的,磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线方程为:y=292477x-11049,R²=0.9983。
具体的,基于上述第二标准曲线,下面对反应结束时磁微粒的丢磁率以及反应中间某一步骤磁微粒的丢磁率的检测过程分别进行详细说明。
首先对本实施例所用免疫分析仪以及试剂条进行说明。
磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条的结构如图3所示。
如图3所示,磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条包括:试剂条主体1、手柄2、挡片17、样品孔3、磁珠储存孔4、第一反应孔5、第一清洗孔6、第二清洗孔7、第二反应孔8、第三清洗孔9、第四清洗孔10、第三反应孔11、第五清洗孔12、第六清洗孔13、预留稀释孔14、空白区域15、检测孔16。其中,磁珠储存孔4、第一反应孔5、第一清洗孔6、第二清洗孔7、第二反应孔8、第三清洗孔9、第四清洗孔10、第三反应孔11、第五清洗孔12、第六清洗孔13、预留稀释孔14构成了反应清洗段。
使用上述试剂条对血清样本中的糖类抗原CA125进行检测,步骤如下:
(1)、在样品孔3中取血清样本100μL至第一反应孔5;
(2)、在磁珠储存孔4中吹打均匀磁珠,将全部磁珠液吸取至枪头中,磁铁靠近,待磁珠与液体分离后弃掉上清液,此时第一抗体包被磁珠,形成磁珠-包被CA125抗原的第一抗体;
(3)、将弃掉上清液的磁珠转移至第一反应孔5,反复吹打将磁珠与样本混合均匀,待混合均匀以后保存吹打状态10min,形成磁珠-包被CA125抗原的第一抗体-CA125抗原三元复合物;
(4)、将第一反应孔5中的磁珠液体混合物全部吸入枪头中,磁铁靠近枪头并吸附磁珠,待磁珠完全吸附后吐出枪头内的液体留下磁珠,将枪头转移到第一清洗孔6中;
(5)、枪头在第一清洗孔6中反复吹打将磁珠与液体混合均匀,待混合均匀以后保存吹打状态2min;
(6)、将第一清洗孔6中的磁珠液体混合物全部吸入枪头中,磁铁靠近枪头并吸附磁珠,待磁珠完全吸附后吐出枪头内的液体留下磁珠,将枪头转移到第二清洗孔7中;
(7)、枪头在第二清洗孔7中反复吹打将磁珠与液体混合均匀,待混合均匀以后保存吹打状态2min;
(8)、将第二清洗孔7中的磁珠液体混合物全部吸入枪头中,磁铁靠近枪头并吸附磁珠,待磁珠完全吸附后吐出枪头内的液体留下磁珠,将枪头转移到第二反应孔8中,第二反应孔8中装有荧光素标记的第二抗体;
(9)、枪头在第二反应孔8中反复吹打将磁珠与液体混合均匀,待混合均匀以后保存吹打状态5min,形成磁珠-包被CA125抗原蛋白的第一抗体-CA125抗原蛋白-抗CA125抗原的第一抗体的第二抗体-荧光素;
(10)、将第二反应孔8中的磁珠液体混合物全部吸入枪头中,磁铁靠近枪头并吸附磁珠,待磁珠完全吸附后吐出枪头内的液体留下磁珠,将枪头转移到第三清洗孔9中;
(11)、枪头在第三清洗孔9中反复吹打将磁珠与液体混合均匀,待混合均匀以后保存吹打状态2min;
(12)、将第三清洗孔9中的磁珠液体混合物全部吸入枪头中,磁铁靠近枪头并吸附磁珠,待磁珠完全吸附后吐出枪头内的液体留下磁珠,将枪头转移到第四清洗孔10中;
(13)、枪头在第四清洗孔10中反复吹打将磁珠与液体混合均匀,待混合均匀以后保存吹打状态2min;
(14)、将第四清洗孔10中的磁珠液体混合物全部吸入枪头中,磁铁靠近枪头并吸附磁珠,待磁珠完全吸附后吐出枪头内的液体留下磁珠,将枪头转移到预留稀释孔14中;
(15)、枪头转移到预留稀释孔14中吸取50μL的液体;
(16)、枪头转移到检测孔16中,混合吹打均匀,进行检测读数。
需要说明的是,本实施例方案中,第三反应孔11、第五清洗孔12、第六清洗孔13不参与反应过程。
对磁微粒免疫荧光分析法反应结束时磁微粒的丢磁率进行检测,也即样品按照上述步骤操作后,磁微粒最终处于检测孔16中,通过全自动免疫荧光分析仪读取8个通道待测样品的荧光素信号值,将8个通道的荧光素信号值取平均,即可获得待测样品的荧光素信号值;将上述荧光素信号值带入磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,即可计算出待测样品的磁微粒浓度;而后通过丢磁率计算公式即可获得磁微粒免疫荧光分析法整个反应过程的丢磁率。8个通道的荧光素信号值检测结果如下表3所示。
表3 各通道检测孔中待测样品的荧光素信号值表
通道 | 荧光素信号值 |
第一通道 | y1 |
第二通道 | y2 |
第三通道 | y3 |
第四通道 | y4 |
第五通道 | y5 |
第六通道 | y6 |
第七通道 | y7 |
第八通道 | y8 |
,
荧光素信号值的平均值为:y0=(y1+y2+y3+ y4+y5+y6+ y7+y8)/8。
将y0代入磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,计算出磁微粒浓度x0。
而后根据磁微粒丢磁率的计算公式即可获得待测样品的丢磁率。
不限于此,也可基于每个通道的荧光素信号值计算其对应的磁微粒浓度,而后将8个通道的磁微粒浓度取平均值,计算出磁微粒浓度x0。
对磁微粒免疫荧光分析法每个步骤磁微粒的丢磁率进行检测,也即样品按照上述每个步骤操作后,均通过全自动免疫荧光分析仪读取8个通道的荧光素信号值,将8个通道的荧光素信号值取平均,即可获得待测样品在完成一个步骤后的荧光素信号值;将上述荧光素信号值带入磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,即可计算出待测样品在完成一个步骤后的磁微粒浓度;而后通过丢磁率计算公式即可获得磁微粒免疫荧光分析法在完成一个步骤后的丢磁率。按照上述步骤,以检测第一反应孔5、第一清洗孔6、第二清洗孔7、第二反应孔8、第三清洗孔9、第四清洗孔10、检测孔16为例(不限于这7个孔),8个通道的荧光素信号值检测结果如下表4所示。
表4 各通道各检测孔中待测样品的荧光素信号值表
通道 | 第一反应孔5 | 第一清洗孔6 | 第二清洗孔7 | 第二反应孔8 | 第三清洗孔9 | 第四清洗孔10 | 检测孔16 |
第一通道 | y5-1 | y6-1 | y7-1 | y8-1 | y9-1 | y10-1 | y16-1 |
第二通道 | y5-2 | y6-2 | y7-2 | y8-2 | y9-2 | y10-2 | y16-2 |
第三通道 | y5-3 | y6-3 | y7-3 | y8-3 | y9-3 | y10-3 | y16-3 |
第四通道 | y5-4 | y6-4 | y7-4 | y8-4 | y9-4 | y10-4 | y16-4 |
第五通道 | y5-5 | y6-5 | y7-5 | y8-5 | y9-5 | y10-5 | y16-5 |
第六通道 | y5-6 | y6-6 | y7-6 | y8-6 | y9-6 | y10-6 | y16-6 |
第七通道 | y5-7 | y6-7 | y7-7 | y8-7 | y9-7 | y10-7 | y16-7 |
第八通道 | y5-8 | y6-8 | y7-8 | y8-8 | y9-8 | y10-8 | y16-8 |
,
以形成磁珠-包被CA125抗原的第一抗体-CA125抗原三元复合物的步骤为例:该步骤荧光素信号值的平均值为:
y5-0=(y5-1+y5-2+y5-3+y5-4+y5-5+y5-6+y5-7+y5-8)/8。
将y5-0代入磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,计算出磁微粒浓度x5-0。
而后根据磁微粒丢磁率的计算公式即可获得待测样品的丢磁率。
不限于此,也可基于每个通道的荧光素信号值计算其对应的磁微粒浓度,而后将8个通道的磁微粒浓度取平均值,计算出磁微粒浓度x5-0。
其余步骤磁微粒丢磁率的计算方法与上述步骤磁微粒丢磁率的计算方法相同,在此不再赘述。
本实施例还研究了不同类型检测液对磁微粒检测信号值的影响。试验方法为:采用与表1中标准溶液相同的方法制备磁微粒浓度为3mg/ml的磁微粒进行测试,然后选取目前较为常用的15种缓冲溶液,在15种缓冲溶液中加入相同量的磁微粒混合均匀进行测试,一个缓冲溶液测试6次,测试信号值求平均值与偏差然后求变异系数,从而可获得不同类型检测液对磁微粒检测信号值的影响结果。检测数据如下表5所示:
表5 不同类型缓冲溶液下磁微粒检测信号值表
,
表5中,A1~A15分别代表:
A1:羟乙基哌秦乙硫磺酸缓冲溶液(HEPES);
A2:PBS磷酸盐缓冲溶液;
A3:甘氨酸–盐酸缓冲溶液;
A4:甘氨酸-氢氧化钠缓冲;
A5:Tris缓冲溶液;
A6:Tris-盐酸缓冲液;
A7:碱性磷酸酶缓冲溶液;
A8:磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液;
A9:磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液;
A10:磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液;
A11:磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液;
A12:柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液;
A13:磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液;
A14:柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液;
A15:碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。
从上述试验结果可知,所测得的信号值包括磁微粒、荧光素和缓冲溶液的信号值之和,三者的信号值之和均在10000以下。从表5的数据可以看出,不同的缓冲溶液对检测结果虽然有影响,但均与对照组的检测结果处于同一数量级,相比于表1和表2中不同磁微粒浓度对荧光素信号值的影响(磁微粒浓度不同,荧光素信号值可以相差一个数量级或两个数量级),不同缓冲溶液对荧光素信号值的影响可以忽略不计。
在进行缓冲溶液选取时,首先基于项目实际需求,选取适合该项目的缓冲溶液类型,而后在可选取的缓冲溶液类型中,选择平均值较小和/或变异系数较小的缓冲溶液使用。例如,对于肿瘤标志物测试项目,可适用的缓冲溶液类型为A1~A6,从上述表5中可知,A2的荧光素信号值较低,为首选,其变异系数为3.19%,属于可接受的范围内。因此,对于肿瘤标志物测试项目,通常选取PBS磷酸盐缓冲溶液。进一步的,从上述表5中还可知:A1~A6的荧光素信号值为1000~4000,对检测结果的影响不大,可以忽略。
进一步的,选取较为常用的PBS磷酸盐缓冲溶液,在其中加入可增强缓冲液活性和稳定性的物质,再次测试加入物对磁微粒检测信号值的影响。检测数据如下表6所示:
表6 不同加入物下磁微粒检测信号值表
,
表6中,a1~a11分别代表:
a1:1%甘氨酸;
a2:1%蔗糖;
a3:1%牛血清白蛋白(BSA);
a4:0.5%BSA;
a5:0.1%BSA;
a6:0.5%脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠(AES);
a7:5%BSA;
a8:0.5%BSA+0.5%AES;
a9:10%BSA;
a10:20%BSA;
a11:50%BSA。
从上述表6的检测结果可知:基于项目实际需求,加入可增强缓冲液活性和稳定性的不同物质后,荧光素信号值也为2000左右,与未加入任何物质的PBS磷酸盐缓冲溶液相差不大,属于可接受范围内。即:在PBS磷酸盐缓冲溶液加入可增强缓冲液活性和稳定性的物质后,荧光素信号值差异不大,因此,可根据项目需求选择需要加入的物质以及加入量。
可知的,对于其余抗体,如磁微粒-IgG抗体,可采用与上述血清样本中的糖类抗原CA125相似的检测方法。即先制备磁微粒-IgG抗体荧光素的标准曲线,然后再基于该标准曲线,检测反应结束时磁微粒的丢磁率以及反应中间某一步骤磁微粒的丢磁率。
磁微粒-IgG抗体标准曲线的制备过程为:
(1)取0.5mg的IgG抗体、0.8mg的荧光素(IgG抗体和荧光素的加入量不限于此,具体是基于项目实际情况确定,例如可为该物质在项目中的上限值);
(2)将IgG抗体和荧光素加入离心管中,反应过夜后经过透析收集定容到200μL,得到第一混合溶液;
(3)取1mg的磁微粒;
(4)将磁微粒和第一混合溶液加入离心管中,反应2~3h后将得到的磁微粒用磁微粒储存液进行定容保存,所得磁微粒终浓度为1mg/ml,得到第二混合溶液;
(5)将第二混合溶液进行梯度(不限于对倍稀释,可以有3倍或者其他的稀释方案)稀释得到6个不同磁微粒含量的磁微粒标准溶液;
(6)将不同磁微粒含量的磁微粒标准溶液放入试剂条的检测孔中进行检测,得到对应的信号值,根据磁微粒浓度-荧光素信号值,形成标准曲线。
表7 各磁微粒标准液所得的荧光素信号值表
检测对象 | 磁微粒浓度(mg/ml) | 荧光素信号值(counts) |
第一标准液 | 1 | 321095 |
第二标准液 | 0.5 | 173239 |
第三标准液 | 0.125 | 23651 |
第四标准液 | 0.0625 | 9676 |
第五标准液 | 0.0313 | 5871 |
第六标准液 | 0.0156 | 4084 |
,
对上述数据进行拟合,得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线,磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线图如图4所示。具体的,磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线方程为:y=332879x-6621.6,R²=0.9954。
基于上述标准曲线,对反应结束时磁微粒的丢磁率以及反应中间某一步骤磁微粒的丢磁率的检测过程在此不再详述,可参照磁微粒免疫荧光分析法的操作步骤。
本实施例提供了第一标准曲线、第二标准曲线和第三标准曲线,可通过如下方式选取适用的标准曲线:对于抗原抗体对荧光素信号值影响不大的待检测物,可选用第一标准曲线;对于抗原抗体对荧光素信号值影响较大的待检测物,可参照第二标准曲线的制备方式制备与待检测物含有相同抗原抗体的标准曲线;对于抗体对荧光素信号值影响较大的待检测物,可参照第三标准曲线的制备方式制备与待检测物含有相同抗体的标准曲线。
本实施例第二个方面提供了一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用。
本实施例中任一项技术方案的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,基于反应结束时待测样品的磁微粒量和磁微粒损失量之和,确定免疫分析仪检测初始阶段添加的磁微粒量。
具体的,按照前述方法,可获取免疫分析仪磁微粒的丢磁率,再基于磁微粒免疫荧光分析法操作后样本的磁微粒浓度,可计算出在进行磁微粒免疫荧光分析法操作前,所需的磁微粒浓度,以弥补磁微粒免疫荧光分析法操作过程中的磁微粒损失。
本实施例中任一项技术方案的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,通过反应结束时待测样品的磁微粒量和磁微粒损失量之和,计算出免疫分析仪检测初始阶段添加的磁微粒量,即预先将磁微粒免疫荧光分析法检测过程中各步骤损耗的磁微粒加入初始样品中,从而可保证磁微粒免疫荧光分析法检测完成后样品中的磁微粒数量,进而可确保磁微粒免疫荧光分析法检测结果的可靠性和准确性。
本实施例中任一项技术方案的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,基于磁微粒免疫荧光分析法各步骤的磁微粒丢磁率,调整磁微粒免疫荧光分析法各步骤的分析参数。
具体的,基于磁微粒免疫荧光分析法各步骤的磁微粒丢磁率,调整磁微粒免疫荧光分析法各步骤的分析参数,可使各步骤的磁微粒丢磁率相同;或者调整磁微粒免疫荧光分析法各步骤的分析参数,可降低各步骤的磁微粒丢磁率。
优选的,调整磁微粒免疫荧光分析法各步骤的分析参数,例如是调整免疫分析仪上磁棒与移液枪头之间的距离、和/或调整反应时移液枪头进入试剂液面的深度。具体的,磁棒与移液枪头之间的距离之间的距离越小,丢磁率越小;磁棒与移液枪头之间的距离越大,丢磁率越大。移液枪头进入试剂液面的深度越深,丢磁率越小;移液枪头进入试剂液面的深度越浅,丢磁率越大。
本实施例中任一项技术方案的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,通过磁微粒免疫荧光分析法各步骤的磁微粒丢磁率,调整磁微粒免疫荧光分析法各步骤的分析参数,从而可提高免疫分析仪的检测精密度。
需要说明的是,在本文中,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
此外,需要指出的是,本申请实施方式中的方法和装置的范围不限按示出或讨论的顺序来执行功能,还可包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序来执行功能,例如,可以按不同于所描述的次序来执行所描述的方法,并且还可以添加、省去、或组合各种步骤。另外,参照某些示例所描述的特征可在其他示例中被组合。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤S1:制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线;
步骤S2:利用免疫分析仪检测磁微粒免疫荧光分析法所用试剂条检测孔中的待测样品,并获取待测样品的荧光素信号值;
步骤S3:基于磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线和待测样品的荧光素信号值,计算待测样品的磁微粒浓度,并基于待测样品的磁微粒浓度和初始磁微粒浓度计算免疫分析仪磁微粒的丢磁率;
其中,获取待测样品的荧光素信号值包括:获取反应结束时待测样品的荧光素信号值,和/或获取反应中间过程待测样品的荧光素信号值;
制备磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线包括如下步骤:
步骤S11:将磁微粒标记荧光素,并配置不同浓度的多个磁微粒标准液;
步骤S12:测量各磁微粒标准液的荧光素信号值,并将所得的荧光素信号值与磁微粒标准液浓度值拟合得到磁微粒浓度-荧光素信号值的标准曲线;
将磁微粒标记荧光素,并配置不同浓度的多个磁微粒标准液包括如下步骤:
步骤S111:将荧光素溶解于第一缓冲溶液中,并将溶解有荧光素的第一缓冲溶液加入不同重量的磁微粒中,将磁微粒和第一缓冲溶液放入恒温震荡仪中反应;
步骤S112:将反应后的磁微粒取出并进行清洗;
步骤S113:将清洗后的磁微粒加入第二缓冲溶液中并混匀,所得溶液为磁微粒标准液。
2.根据权利要求1所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,其特征在于,获取反应结束时待测样品的荧光素信号值包括如下步骤:
步骤S21-1:获取反应结束时免疫分析仪各通道处的试剂条检测孔中待测样品的荧光素信号值;
步骤S22-1:计算所有通道处的试剂条检测孔中待测样品荧光素信号值的平均值,并以平均值作为反应结束时待测样品的荧光素信号值。
3.根据权利要求1所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,其特征在于,获取反应中间过程待测样品的荧光素信号值包括如下步骤:
步骤S21-2:将磁微粒放入免疫分析仪各通道处的试剂条样本孔中,按照磁微粒免疫荧光分析法的步骤进行操作,待每一个步骤结束后,均获取各通道处的试剂条检测孔中待测样品的荧光素信号值;
步骤S22-2:计算所有通道处的试剂条各检测孔中待测样品荧光素信号值的平均值,并以平均值作为各步骤结束时待测样品的荧光素信号值。
4.根据权利要求2或3所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,其特征在于,所述通道的数量为2~8个。
5.根据权利要求1所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法,其特征在于,通过如下公式计算免疫分析仪磁微粒的丢磁率:
丢磁率=(M-N)/M*100%,
其中,M为初始磁微粒浓度,N为待测样品的磁微粒浓度。
6.一种根据权利要求1至5中任一项所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,其特征在于,基于反应结束时待测样品的磁微粒量和磁微粒损失量之和,确定免疫分析仪检测初始阶段添加的磁微粒量。
7.一种根据权利要求1至5中任一项所述的免疫分析仪磁微粒丢磁率的检测方法的应用,其特征在于,基于磁微粒免疫荧光分析法各步骤的磁微粒丢磁率,调整磁微粒免疫荧光分析法各步骤的分析参数。
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