JPS6396557A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は少くとも２個の抗体結合部位を有する抗原物質
の免疫学的測定法に関する。

大規模に抗原を定性的かつ定量的に測定するには免疫学
的測定法がますます用りられてきていることは知られて
いる。これらの方法は結合相手の一方が標識されている
、抗原と１種またはそれ以上の抗体との複合物の形成に
基づく。

それにより、抗原と１種またはそれ以上の抗体からなる
複合物が生成したか否かおよびいかなる量で生成したか
測定できる。この免疫学的測定法はモノクローナル抗体
（Ｍｉｌｓｔｅｉｎおよびに６ｈｌｅｒ。

１９７５年）の導入により決定的な改良がなされ、免疫
測定法におけるその使用は西Ｐイツ特許公開公報第３，
１５０，８３４号に詳細に記載されている。

免疫学的測定法は抗原または抗体のいずれが標識されて
いるかの如何により２つの大きな種類に分けられうる。

標識された結合体が常に過剰に使用される。

使用される抗体の一方が標識された免疫学的測定法が特
に興味を持たれた。かかる方法では抗原は三成分複合体
の形でサンＰイツチ状に結合され、そしてインキュベー
ション後に結合しなかった標識された抗体が反応混合物
と一緒にデカンテーションまたは洗去により除去される
。

これらの実施形は標識の種類に応じ、二側性免疫放射線
測定法（ＩＲＭＡ）　、免疫酵素測定法（ＩＥｍ）また
は免疫化学ルミネセンス測定法（ＩＣＭＡ）として知ら
れる。これらの方法では大抵の場合は未標識抗体が固相
に結合される。

前記したサンＰイツチ法は、三成分複合物を形成させる
反応段階が相異する種々の方法で実施されうる。抗原を
一容器反応で標識された抗体および未標識抗体と同時に
混合することができるが、しかし連続して操作して、抗
原をはじめ未標識抗体と反応させ、そして充分なインキ
ュベーション時間をおいたのちに標識された抗体と反応
せしめることもできる。終りに、これらの反応段階は逆
の顆序でも実施できる。

標識された抗体の使用に基づくサン２インチ法は標識さ
れた抗原の使用の下に実施される検定に比較して決定的
に分析上有利である。すなわち抗体を過剰に使用しそし
てその濃度を高めることにより均衡を三成分複合物の形
成の方向にシフトさせることができる。従ってわずかな
量の抗原でも結合させ標識にカップリングさせることが
できる。加えて標識から発せられるシグナルが抗原濃度
に正比例しているので低濃度の抗原により惹起される弱
いシグナルも明瞭に識別されうる。この理由で、標識さ
れた抗体を用いて操作されるサン１インチ法が、標識さ
れた抗原の使用に基づく検定よシ相当に感度が良い。

終りに、標識された抗体を用いて操作するサン１インチ
法のもう一つの利点は、その力学的測定範囲がかなり大
きｂことである、すなわち抗原の濃度が変化しても三成
分複合物から発せられるシグナルの強度が検出可能に変
動する比較的大きい領域が存在する。その他、商業的な
免疫学的測定法のルーチン使用にとってはそれらが最も
短いインキュベーション時間で行われうろこともまた重
要である。このことは、サン１インチ法における標識さ
れた抗体の使用がそうであるように、比較的高濃度の試
薬が使用されうる場合に保証される。

しかし々からこれらの方法の利点に対しては決定的な欠
陥が存在する。すなわち、測定されたシグナルが全濃度
範囲において明白に特定の抗ｉｉ−に相関しないことで
ある。むしろ、特に抗原濃度が高い場合は、比較的抗原
濃度が低い場合だおけるよシも弱いシグナルが得られる
。

このことは、発せられる測定シグナルの強度が抗原濃度
の函数として示されている第１図に表わされている。こ
のｔ／作用曲線は６種の領域に分けられる。

ａ）コア測定領域および拡大測定領域から表る標準曲線
領域（Ａ）、 ｂ）測定シグナルが最高標準物の測定シグナルよりも大
きい領域（Ｂ）、 Ｃ）抗原濃度が数倍高くても、測定シグナルが標準曲線
に対応する領域（Ｃ）。

第１図はコア測定領域にシいてのみ１回の測定で明白な
結果が得られうることを示す。これに対し拡大測定領域
で得られる結果には２種の全く異なる抗原濃度が割当て
られうる。この現象は「高濃度フック効果（ｈｉｇｈ−
ｄｏｓｅ　ｈｏｏｋ　ｅｆｆｅｃｔ）Ｊとして知られて
おシそしてこのことは試料中の抗原含量が、非常に低い
濃度で終る標準曲線に割当てられた場合には実際よシか
なシ低い値が出るという結果をもたらす。

これに対しくＢ）領域で測定された最高標準物より高い
シグナルは明白であり、そして適当な希釈後に正確に特
定化されうる。

「高濃度フック」効果は、その測定法が一容器法で行わ
れる場合は実際上常に観察されるが、しかし連続的イン
キュベーションの場合にも出現する。

原因としては、一方では抗原濃度が高い場合知立体効果
の結果として、標識された抗体の後程の離脱を惹起する
、親和性定数の変化が論議され、もう一方では一容器法
においては高濃度の抗原に比較して標識された試薬が過
剰な状態はもはや通用しないことが論議される。このこ
とは、抗原が固相に結合した未標識抗体のすべての結合
点のみならず、標識された抗体の結合部位をも占めるこ
ととなυ、それにより三成分複合物の形成が不可能とな
る。この競合性は抗原濃度が比較的低い場合は存在しな
いので、三成分複合物が生成しそして抗原濃度に対応す
る測定シグナルが発せられうる。

連続的インキュベーションを用いる測定法においても、
抗原を含有する液体試料が、固定された未標識の抗体と
の反応後に標識された抗体の添加に先立ち定量的に除去
されない場合には同じく「高濃度フック」効果が現われ
うる。次に、高濃度の未結合抗原が試験管中に残留して
、次に添加された標識された抗体を遮断するという危険
が存在する。固相を洗い去ることにより。

標識された抗体の添加に先立ち液体試料の残分を定量的
だ除去することは困難である、何故なら各洗浄段階で、
抗原と未標識抗体とから形成される複合物の当然できる
だけ阻止されるべき解離も生じるからである。それゆえ
所望されるだけの数の洗浄段階をとシ行うことはできな
い。

「高濃度フック効果」による過った測定結果の検出は従
来法ではこれまで以下の方法で行われた。

ａ）分析すべき液体試料を２つの異々る希釈度で測定し
た。その場合希釈にも拘らず測定シグナルが強まったな
らば、第１図の観察から直ちに明らかであるように「高
濃度フック効果」の存在が結論できた。

ｂ）連続インキュベーションを用いる測定法を選択しそ
してその際多数の洗浄段階により、標識された抗体の添
加に先立ち何ら遊離の抗原が最早や存在しないように確
保する。

これら両測定法共多大なる費用がかかる。

今、本発明による測定法により、「高濃度フック効果」
の識別法が示された。それによれば第１回目の測定にお
いて、抗原をすべての生理学的に可能々濃度で含有しう
る液体試料中の抗原濃度をサンｒインチ法により測定し
、そして次に特定の選択された試料のみを後続の迅速試
験にかける。かくしてすべての試料にとって明白な結果
がわずかな工業的費用を用いて得られる。

それゆえ本発明は抗原物質（ａ）を含有する液体試料を
、固相に固定され、未標識であり、（ａ）に対して特異
的である抗体（ｂ）　ｂよびもう一つの、（ａ）に対し
て特異的である標識された抗体（ｃ）と連続してまたは
一段階でインキュベーションして、（ｍｌの量に相当す
る検出可能表シグナルを発する、同相に結合した（ａ）
、（ｂ）および（ｃ）からなる三成分複合物を形成させ
ることＫよシ少くとも２個の抗体結合部位を有する抗原
物質を免疫学的に測定するＩｃあたシ、ｇＪ１回目の測
定においてはコア測定領域および拡大測定領域を包含す
る全測定領域にわたり抗原濃度を測定しそして次に拡大
測定領域中において抗原の濃度が測定された試料を、抗
原および／または抗原等価物の量を高めたのちに第２回
目の測定にかける方法に関する。

第２回目の測定でシグナルの相異を生成させるだめには
下記の方法が可能である。

ａ）第２回目の測定を実施するに先立ち試料中に付加的
な抗原または抗原等価物を添加しうる。

抗原等価物としては抗イデイオタイプ抗体が使用されう
る。

ｂ）測定を比較的大量の試料を用いて実施できる。

その場合に現われる効果を第２図に示す。第２図には抗
原濃度の画数としての測定シグナルが種々の試料量につ
いて示されている。試料量が減少すると曲線が右側にシ
フトすることが明らかである。測定を中間試料量■２を
用いて実施するならば抗原濃度Ｃ１およびＣ２に対する
測定シグナルＭ２が得られる、すなわち２種の試料の抗
原濃度が大巾に相違しているとしてもそれらを区別でき
ない。今、抗原濃度を高めた場合、ＣｊのシグナルＭ２
はよυ高い値（Ｍ２’　）に劇的に移行し、一方Ｃ２に
属するシグナルＭ２”はわずかに弱まるのみである。第
１回目の測定で得られるシグナルを第２回目の測定シグ
ナルと比較することにより、試料には明白な濃度範囲が
割当てられつる、すなわちｒ高濃度フック効果」が確認
されるかまたは排除されうる。

抗原が容易には入手でき外い場合は、その代りにその抗
原等個物、抗イデイオタイプ抗体が用いられることもで
きる。抗イデイオタイプ抗体は抗原と相違して１個しか
抗体に対する結合部位を有しないので、三成分複合物の
形成を阻止しうる。それゆえ、この場合抗原濃度が低い
と測定シグナルの薯化を招くが、一方抗原濃度が高いと
ほとんど変化しない（これに関しては実施例６も参照さ
れたい）。

しかしまた「高濃度フック効果」は、第２回の測定に対
し試料量を増大させることにより、検出すべき抗原量を
高めることによっても認識されうる。第２回目の測定を
第２図に示される試料量ｖ５で実施するならば、濃度Ｃ
１においてはシグナルＭ５１が、そして濃度Ｃ２におい
てはシグナルＭ５２が得られる。これらシグナルの強度
は第１回目の測定で得られるシグナルとは明らかに異な
る。従って「高濃度フック効果」が存在するか否か明白
に宣言しうる定量的迅速試験が可能である。

前記した２種の測定法には、第２の測定前に抗原濃度を
高めるかまたは抗イデイオタイプ抗体を添加すると測定
シグナルがシフトすることが共通してｂる。抗原濃度を
高めた場合に測定シグナルが強まるか、または抗イデイ
オタイプ抗体を添加した場合に弱まるならば、何ら「高
濃度フック効果」は存在しえない。これに対し抗原濃度
の増大または抗イデイオタイプ抗体の添加にも拘らず測
定シグナルがあまシ実質的な変化がない場合は、「高濃
度フック効果」が結論されねばならない。

実施に際しては本発明による測定法は第１回目の測定で
得られた測定結果を標準曲線と比較することにより用い
られる。この標準曲線は抗原濃度の画数として、３つの
測定領域に分けられる、すなわちコア測定領域、拡大測
定領域および外側領域である。

コア測定領域は生理学的試料において薬量応答曲線割当
てが明瞭である領域として定義される。拡大測定領域は
分析上の基準に従い測定されそしてなお高い精度で測定
されうる濃度にまで及ぶ。

得られる値がコア測定領域中に存在する場合は、それら
は明瞭でかつ最終的な結果として評価されうる。これに
対し測定結果が拡大測定領域！ｃ６る場合は、試験は「
高濃度フック効果」の存在に対して実施されねばならな
い。この試験が陰性である場合は、第１回目の測定で得
られる結果が明白なものと見なされる。これに対し「高
濃度フック効果」が存在するならば、その試料はさらに
測定した場合に明瞭な結果が得られうるまで希釈されね
ばならない。

第１回目の測定において拡大測定領域外に高い測定シグ
ナルが見られる場合は、「高濃度フック効果」が存在し
得ない。しかしながらその試料は第２の測定において信
頼しうる値が得られうるまで希釈されねばならない。

本発明による測定法は、固相に固定された未標識抗体が
モノクローナル抗体であるかまたはポリクローナル抗体
である場合に特（好都合に実施されうる。このものは固
相に吸着によるかまたは共有により結合されつる。固相
としては肉眼で見ることのできる支持体、例えばプラス
チックチューブ、ミクロ滴定プレート、または種々の種
類の形状をしたプラスチック成凰体例えばビーズまたは
プロペラが使用されうるが。

固相はまた、その粒径が一般に０．１μ憤〜１０　ｔｔ
ｍにある顕微鏡的粒子の懸濁液であることもできる。こ
れらの顕微鏡的粒子はポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミ２％ガラ
ス、二酸化珪素またはセファロースから成ることができ
る。

第２の、標識された抗体もモノクローナル抗体またはポ
リクローナル抗体であるべきである。

このものは放射性同位元素例えばｌ−１２５’！！たは
Ｃｏ−５７で標識でき、その場合、三成分複合体の形成
後に放射性照射を測定することＫより同一の条件下に準
備された標準曲線と比較して抗原の含量が測定できる。

しかしながら標識化はまたペルオキシダーゼのような酵
素を用いて行うこともでき、この方法では三成分複合体
の形成後に酵素活性を測定することにより抗原含量が測
定されうる。終シに、フルオレセインのような螢光基、
またはアクリジニウム誘導体のような化学ルミネセンス
基も指示薬として抗体に結合されうる。

本発明による免疫学的測定法を用いて、生理学的濃度の
抗原物質が少くとも１０５の範囲にわたシ確実に測定さ
れうる。この方法は非常に広い種類の抗原物質の測定、
例えばヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴｓＨ）あるいは腫
瘍胎児性タンノ々り質例えばα−フェトプロテイン、ヒ
ト絨毛ゴナＰトロピンまたは癌胚抗原（ＣＥＡ）の測定
に用いられうる。

この新規な本発明による免疫学的測定法は信頼しうる、
技術的に特に簡単で、迅速で確固とした方法である。こ
の方法は非常に多数の商業的なサンドインチキットに使
用されうる、何故なら構成分を変化させる必要がないか
らである。

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例　１ モノクローナル抗体に基づく２個性ＩＨＭＡおよび２段
階実施法による、患者血清中のα−フェトプロテインの
放射線免疫検定 腫瘍胎児α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は２つの適応
分野において重要である、すなわち（１）胎児における
神経管欠損に関するスクリーニングのためのパラメータ
ーとして（妊娠第１５〜２２週内の妊婦血清中における
測定、確認するために、ＡＦＰをさらに羊水中で測定）
。

（２）　　とシわけトロホブラスト腫瘍の進行監視にお
ける腫瘍マーカーとして。

正常な範囲および病的範囲はこの２種の適応にとってパ
ラメーターが非常に異なる。（１）項で示される適応分
野においては、血清試料はＡＦＰ５〜８０　Ｄ　ＯＩＴ
Ｊ／−の範囲に適用でき、羊水試料ではＡ−ＦＰ１００
０〜２５００００ＩＵ／ｌｊの範囲である。後者試料で
はＡＦＰ　１０〜２５００　ＩＵ／ｍＡ！なる値を期待
するには’／１ａａの予備希釈が強制的に行われうる。

診断上の切シ捨て一インドはＡＦＰ約１００ＩＵ／ｄで
ある。

腫瘍学においては、腫瘍マーカーが陰性である試料では
ＡＦＰ　１０　工Ｕ／ａｌよシ低い値が見出され、一方
高度に病的な試料ではＡＦＰ　１００００００Ｉ　Ｕ７
４７？よシ高い値が示されうる。従って「高濃度フック
効果」の結果としての不明瞭性彦る前記した開運は後者
の適応にとってのみしか重要でない。しかしながら、臨
床的なルーチン診断においては効率性ゆえに、２種の適
応は１つの検定法によりカバーされるべきである。その
場合どの適応分野に患者の試料があてはまるか在住にし
て未知でさえある。

第３図はＡＦＰルーチン測定の代表的な頻度分布を示す
。はとんど大部分の測定値がＡＦＰ１０００工Ｕ／欝ま
での範囲内に見出され、いくつか少数のみがＡＦＰ　１
００，０００　Ｉ　Ｕ／ｄよシ大きｈことが明らかであ
る。さらに、この分布においては相当して最適化された
ＡＦＰ分析系に関する薬量−作用（濃度／シグナル）−
関連性が示される。

この関連ゆえに、標準測定領域がコア測定領域（ＡＦＰ
　Ｏ〜１５０ＩＵ／ｇ／）と拡大測定領域（ＡＦＰ１５
０〜６００ＩＵ／ｍ７）Ｋ分けられる。すべての未希釈
腫瘍試料の９０多以上がコア測定領域に存在する。拡大
測定領域とは’Ｚｏｏに希釈された腫瘍試料（これら試
料の約９８％がＡＦＰ　６００ＩＴＪ、ろａよシ下にあ
る）、および妊婦試料（血清または１Ａｏｏ希釈された
羊水試料、ここでは９９９６以上がＡＦＰ　６００　Ｉ
Ｕ／ｄ！、９下にある）があてはまる。

前記した予想値ゆえに、異々る種類の試料（希釈／未希
釈腫瘍、妊娠血清／希釈羊水試料）にとって制限されず
に利用できる測定範囲は前記方法で限定されうる。

第１回目の測定に関する操作法 〔商業的なテストキットＲＩＡ認＠　ＡＦＰ　Ｃ，ｔ。

（Ｂｅｈｒｉｎｇ　ｖｒｅｒｋｅ　、　？−ルプルグ〕
の構成分が使用されうる〕 充分な数の被覆された試験管中に標準液（または患者試
料）２０μｌをピペットで加える。その場合各試料には
新たなピペット先を使用しなければならない。各試験管
につきｌ−１２５抗ＡＦＰ２００μｌずつが分配される
。この２種の工程は分配器／希釈器システムの使用によ
り自動化されうる。

次疋試験管を１７〜２７℃で２時間振盪する。

各試験管に洗浄用緩衝液１ｄずつを加え、上澄み液をデ
カンテーション（吸引）しそして１ｄを用いて試験管を
洗浄する。次に試験管をガンマカウンター中１分間測定
し、そして適当な評価法（例えばスプライン内挿法）で
評価する。

コア測定領域＝ＡＦＰ　Ｏ〜１５０エル郁拡大測定領域
：ＡＦＰ１５０〜６００工則個参考試料：　ＡＦＰ　Ｉ
　Ｄｏ　ＩＵ肩第１表： 標準曲線 総活性：　１２５，７７４ 標準物　Ｓ　Ｏ（ＡＦＰ　ＯＩＶｌｌ）　　　　　１３
５　ｃｐｍ３１　（ＡＦＰ５　工Ｕ／ｌ／）　　　　　
７９３ｃｐｍ８２（＃　　１５　１　）　　　　２．０
８９　ｃｐｍ８３（ｐ　　５０　　ｚ　）　　　　＜Ｓ
、７１５　ｃｐｍＳ　４　（＃　　１００　ｇ　）　　
　　１２，７ｆｆ　　ｃｐｍＳ　５　（ｔ　　２００　
　ｇ　）　　　　２４，８０４　ｃｐｍ８６　（＃　　
６００　　＃　）　　　　６９，９９７　ｃｐｍ患者試
料： ６４Ｂ　　　　　１２，６４２　ｃｐｍ　＝　ＡＦＰ　
９９．４　ＩＱ／＆ｅ６４９　　　　７７５０　ｃｐｍ
　＝　　　５８．６ｚ６５０　　　　１１４．００６　
ｃｐｍ＝）６００　　工Ｑ／’ｍ／＜５５１　　　　１
０１，８４６　　ｃｐｍ＝＞６００　　　＃６５２　　
　　　　１９．６９８　　ｃｐｍ＝　　１５７．８　　
　ｚ６５３　　　　　　５１．９００　　ｃｐｍ＝　　
４３９．８　　　ｇ６５４　　　　１１８．１１５　　
ｃｐｍ＝＞６００　　　　＃６５５　　　　　　　３．
５２０　　ｃｐｍ＝　　　２４．３　　　＃６５６　　
　　　　１２．５３５　　ｃｐｍ＝　　　９８．５　　
　ｇ６５７　　　　１１８．７８７　　ｃｐｍ＝＞６０
０　　　　ｇ６５Ｂ　　　　　１１３，５４２　　ｃｐ
ｍ＝）６００　　　　＃６５９　　　　　　　！１，３
２８　　ｃｐｍ　＝　　　２４．３　　　ｔ６６０　　
　　　２″７，４２７　　ｃｐｍ＝　　２２３　　　　
ｇ６６１　　　　　　　２８２ｃｐｍ＝　　　　ｔｌ　
　　＃６６２　　　　　３へ４３２　　ｃｐｍ＝　　３
０２　　　　ｚコア測定領域−試料番号６４８，６４９
，６５５．６５６．６５９、および６６１これらの結果
は何らそれ以上の検査を必要としない。

拡大測定領域：試料番号６５２．６５３．６６０および
６６２゜とれらの試料は「高濃度フック（Ｅ（ＤＥ（）
　Ｊ試験に用いられねばならない。

測定領域外：試料番号６５０．６５１．６５４．６５７
および６５８゜これらの試料は測定範囲内まで希釈され
ねばならない。

１、ａ）ｒ高濃度フック（ＨＤＨ）　Ｊ試験の操作（第
２測定） 第１回目の測定と同様にするが、しかし標準系列物の代
シに参考試料（例えば第１回目の測定の試験血清）のみ
を使用しそして試料量２０μｌの代シに５０μｌを試験
管に加えることが相異する。インキュベーション時間を
１０分間に減少させる。参考試料ＡＦＰ　１００　ＩＵ
／ｄと比較することにより評価する。もし患者の試料の
シグナル（ｃｐｍ）が参考試料よシ下にあるならば、第
１回目の測定により得られる結果はＦ（Ｄｉ（効果によ
り歪曲されておシ、またｃｐｍ値が第１回目の測定より
上にある々らば、第１回目の測定で得られる結果が確認
される。

参考試料Ｒ（ＡＦＰ　１００　ＩＵ／ｍ／）　　３ｊ、
５５６ｃｐｍ患者試料； ６５２　　　　　　　１６３４　ｃｐｍ　＋＋＋　ＨＤ
Ｈ６５５３，４９７ｃｐｍ　＋＋＋　ＨＤＨ６６０３４
，８４８ｃｐｍ　−−− ６６２５９，９９７ｃｐｍ　−−− 試料６５２および６５３にはＨＤＨ効果が存在する。

測定領域内まで希釈することにより含量は以下のように
測定された、すなわち試料６５２　：　ＡＦＰ６００．
０００　工Ｕ／ｆｘｌ　；試料６５３　：　ＡＦＰ　２
００．０００　ＩＵ／ｄ。

試料番号６６０および６６２はＨＤＨ陰性であり、従っ
て第１回目の測定で本来得られた結果が確認される。試
料６＋５０：ＡＦＰ　２２３１Ｕ／ｄ、そして試料６６
２　：　ＡＰ’Ｐ　３０２　工ＵＡｌ。

１、ｂ）抗原の添加による高濃度の試料の検出実施例Ｉ
Ｋおけると同様にして第１回目の測定を行った。

第２表： 標準系列物 Ｓ　Ｏ（ＡＦＰ　ＯＩＵ／ｓ／）　　　　　２１５　ｃ
ｐｍ８１（４，５ｇ　　）　　　　　８４１　　ｃｐｍ
Ｓ２（２２＃　　）　　　　３，２２３　ｃｐｍＳ３（
８８ｚ　　）　　　　１１，７６７　ｃｐｍ８４（４４
０＃　　）　　　　５４，２５６　ｃｐｍＳ５（８４０
ｔ　　）　　　　９０．１５！ｌ　ｃｐｍ患者試料ニ ア９　　　　　１．７３５　ｃｐｍ　ＡＦＰ　　１０．
４　ＩＵ／ｄ８０　　　　１５．２８０ｃｐｍ　　　　
１１５　　　ｇ８１　　　　　４．４５８ｃｐｍ　　　
　３２　　　＃８２　　　　１９．１２５　ｃｐｍ１４
５　　　＃８３　　　　２８．６６５　ｃｐｍ　　　　
２２１　　　＃８４　　　　２ｔ６３３ｃｐｍ　　　　
１６５　　　ｚ８５　　　　　　８３５８４４　　ｃｐ
ｍ　　　　７５５　　　Ｉル値８６　　　　　　　Ｂ７
，９６９　　ｃｐｍ　　　　　８０９　　　　ｔ８７　
　　　　　９１．８３５　　ｃｐｍ　　　　）８４０　
　　　ｐ８８　　　　　　９２．５５５　　ｃｐｍ　　
　　＞８４０　　　　ｔ８９　　　　　　９２．７９７
　　ｃｐｍ　　　）８４０　　　１９０　　　　　　９
５．０３５　　ｃｐｍ　　　　）８４０　　　　ｚ９１
　　　　　　９１．９５３ｃｐｍ　　　：）８４０　　
　　ｚ９２　　　　　　８４．５４１　　ｃｐｍ　　　
　　７６４　　　　ｇ９３　　　　　　７５．７７２　
　ｃｐｍ　　　　　６５７　　　　ｇ９４　　　　　　
７１．７０３ｃｐｍ　　　　　６１′５　　　ｔ９５　
　　　　　５Ｑ７３２ｃｐｍ　　　　　４０８　　　　
ｚ９６　　　　　　４＆１１０　　ｃｐｍ　　　　　３
４１９７　　　　　　３３．２５８ｃｐｍ　　　　　２
５８　　　　＃９８　　　　　　２ス６７３　ｃｐｍ　
　　　　２１５　　　　ｐ９９　　　　　　２１．０８
１　　ｃｐｍ　　　　　１６１試料７９．８０．８１お
よび８２については明瞭な結果が得られ（コア測定領域
）〜そして試料８７〜９１は測定領域外である。

試料８３．８４．８５．８６および９２〜９９は拡大測
定領域内にあシ、これらは続く「高濃度フック（ＨＤＨ
）　Ｊ試験にかけられるべきである。

Ｅ（ＤＨ試験のための操作法 第１回目の測定におけると同様に操作するが、インキュ
ベーション混合物はＡＦＰ　２０００　ＩＵ／ｍヲ含有
する試料１０μｌを加えることが相異する。

第３表： 患者試料： ８５　　　９１．９２４　ｃｐｍ　−−−ＨＤＨ８４９
１，５６１ｃｐｍ　−−−ＨＤ）１８５　　　９２、ｆ
２１　ｃｐｍ　−−−ＨＤＨ８６９０，９０４ｃｐｍ　
−−−ＨＤＨ９２８４，５４ｆ　　ｃｐｍ　＋＋＋　Ｈ
ＤＨ５０，０００＄９３　　　７４．７７２　ｃｐｍ　
＋＋＋　ＨＤＨ７５，０ＤＤ９４　　　７ｔ２８９　ｃ
ｐｍ　＋＋＋　ＨＤＨ１００，０００９５５３，２７８
ｃｐｍ　　＋＋＋　ＨＤＨ２００，０００９６３５，０
０９ｃｐｍ　　＋＋＋　ＨＤＨ３００，０００９７３１
，７３７ｃｐｍ　　＋＋＋　ＨＤＨ４００，０００９８
２ス４５６　　ｃｐｍ　　＋＋＋　Ｅ（ＤＨ５００，０
００９９１Ｂ、４６６　　ｃｐｍ　　＋＋＋　　ＨＤＨ
６５０，０００ψＡＦＰ　１１１／ｒｄは希釈により測
定。

実施例　２ モノクローナル抗体に基づく２側性工ＨＭＡおよび２段
階実施法による５、１１者血清中におけるヒト絨毛ゴナ
ドトロぎン（ｈｃｃ））の免疫学的測定ＡＦＰと同様Ｋ
　ｈｃＧは２つの適応分野で重要である。

（１）　　あシりる流産を早期に識別するための妊娠経
過の監視 （２）トロホブラスト腫瘍についての腫瘍マーカ妊娠経
過監視のための正常値はｈＣ’Ｇ約１００〜２５０．０
００ｎ　エフ３／ｒｔｔｌの範囲にわたるが、一方腫瘍
における腫瘍マーカー陰性試料は１０よシ小さい筈であ
り、そして陽性試料はｈＣＧ　１，０００，０００惧Ｉ
ＴＪ／ｌｌに達しうる。

このことは妊婦からの試料を予めｊＡｏｏまで希釈しそ
して腫瘍試料を未希釈で使用することが必要であること
を意味する。

従って、ルーチン診断において大部分の試料が見出され
るコア測定領域がｈＣＧ　Ｏ〜４００　ｒｎ　ＩＵ／ｌ
ｌ、そして後続のＨＤＨ試験で検査されねばならない拡
大測定領域がｈｃＧ４００〜１０００　ｍ　ＩＵ／ｍ／
となる。

参考試料はｈＣＧ　３００　ｍ　ＩＵ／ｄで選択される
。

第１回目の測定のための操作 （’ＲＩＡ認識ＨＣＧ　ｃ、ｔ、の構成分（Ｂｅｈｒｉ
ｎｇ　ｗｅｒｋｅ　、　−ｒ−ルプルグ）が用いられう
る〕 実施例１におけると同様にして実施、試料量２０μｌ、
）レーサー量２００μｌ、インキュベーション時間１時
間。

第４表： 標準曲線 総括性＝６ス２５２　ｃｐｍ 標準物　Ｓ　Ｏ（ｈＣＧ　ＯｍＩＴＪ／ｌｌ）　　　　
９９　ｃｐｍ８１（１１ｔ　　）　　　１７５ｃｐｍ８
２（３５ｇ　　）　　　４０４ｃｐｍ８３（１０５ｚ　
　）　　１，１８６ｃｐｍ８４（３００＃　　）　　３
，３３５　ｃｐｍＳ５（６００Ｎ　　）　　１５．７＋
５７　ｃｐｍＳ６（１０００ｔ　　）　　１１．３０５
　ｃｐｍ患者試料： ５８　　　１．５１　ｔ　ｃｐｍ　　　１３５　　（ｈ
Ｃ（）ｍＩＵｚ＆／）５９　　　　１３９ｃｐｍ　　　
　７．３６０　　　５．７００　ｃｐｍ　　　５１０６
１　　　　１９２ｃｐｍ　　　１２．７６２　　　４１
．０２１　ｃｐｍ　＞１０００６５　　　　　　　６６
９　ｃｐｍ　　　　５　Ｂ、２　　（ｈｃＧｍＩＵ、４
）６４　　　　１４，０７６　ｃｐｍ　）１０００　　
　　　　＃６５　　　　　　６．９７２ｃｐｍ　　　６
１７　　　　　　＃６６　　　　　　５．１１０ｃｐｍ
　　　４６１　　　　　　　ｐ６７　　　　　　５．２
０５ｃｐｍ　　　４６９　　　　　　　＃６Ｂ　　　　
　　　４，４６７ｃｐｍ　　　４０４　　　　　１コア
測定領域；試料５８．５９．６１および６３拡大測定領
域：試料６０．６５．６６．６７および６８測定領域外
；試料６２および６４ ｒ　ＨＤＨ試験」のための操作 実施例１の記載と同様にして実施、試料量１００μ１．
）レーサー量２００μｊ１インキュベーション時間１０
分。

参考試料Ｒ（ｈＣＧ　３００　ｍｒＵ／ｍ７）　　５，
３８０　ｃｐｍ患者試料： ６０　　　　　　９．７５４　ｃｐｍ　−−−ＨＤＨ６
５８５１ｃｐｍ　十＋＋　　ＨＤＨ ６６７０４ｃｐｍ　＋＋＋　　ＨＤＨ ６７６０５ｃｐｍ　＋＋＋　　ＨＤＨ ６８５０６ｃｐｍ　＋＋＋　ＨＤＨ ＨＤｉ（−陽性試料の含量は希釈することにより以下の
ように測定された。

６５　　　　　　　ｈｃｃ）　１００，０００　ｍＩＵ
／＃６６　　　　　　　　１５０．０００　　　＃６７
　　　　　　　　２００．０００　　１６８　　　　　
　　　２５０．０００　　１実施例　３ ２種のモノクローナル抗体建基づく２個性ＩＦｔＭＡお
よび２段階実施法によるヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈＴ
ｓＨ）の免疫学的測定 抗イデイオタイプ抗体による抗原等個物増量の原理によ
る。

第１回目の測定のための操作 （ＲＩＡ認識ＴＳＨｃ、ｔｌ、の構成分（Ｂｅｈｒｉｎ
ｇ　ｗｅｒｋｅ　、マールプルグ）が用すられうる〕 実施例１におけると同様にして実施、試料量２００μ／
、　　）レーサー量１００μ１１インキュベーション時
間２時間。

第５表： 総括性： 標準物　Ｓ　Ｏ（ＴＳＨＯμＩＵ／ｌｌ）　　　５６　
ｃｐｍ８１　（０，１３ｇ　　）　　　２０９　ｃｐｍ
８２　（０，４５ｚ　　）　　　５５３　ｃｐｍＳ５　
（１，４５ｇ　　）　　’Ｌ５５０　ｃｐｍ８４（５＃
　　）　　４，７８１　　ｃｐｍ８５　（５ｚ　　）　
　１０，９７６　ｃｐｍ８６（５０＃　　）　　１８．
６２９　ｃｐｍ患者血清： １　Ｂ６　　　　　１，８８５　ｃｐｍ　ＴＳＨ１，９
μＩＵ／ｄ１８７　　　　　２．５１８　ｃｐｍ　　　
２．７　　　ｚｌ　８８　　　　　５．０７２　ｃｐｍ
　　　６．０　　＃１　Ｂ９　　　　　　　　９，３６
５　　ｃｐｍ　　　　１３．０　　　　＃１９０　　　
　　　　　　ス２３０ｃｐｍ　　　　　９５　　　　＃
増強した試料（ＴＳＨ添加） １　　　　１２．２３（Ｓ　　　　２２．４２　　　　
１８．４３６５０．０ ３　　　　２０．５２５　　　＞５０ ４　　　　２０．９００　　　＞５０ ５　　　　２１．１１１　　　）５０ ６　　　　２０．９６８　　　＞５０ ７　　　　１５．３９４　　　３６．７コア測定領域：
　’Ｉ’ＳＨＯ〜１５μ工Ｕ肩拡大測定領域：　ＴＳＨ
１５〜５０μＩＵ／ｌｌコア測定領域：試料１８６〜１
９０ 拡大測定領域：試料１．２および７ 測定領域外：試料３．４．５および６ 抗イディオタイプ抗体は抗原と対照的に抗体に対しただ
１個の結合部位しか有しないので、このものは標識され
たかまたは未標識抗体と結合しうるがしかし何ら三成分
複合物を形成できない。それゆえ抗原濃度が低い場合に
抗イデイオタイプ抗体を添加すると測定シグナルが減弱
する、何故なら、抗原にとって三成分のシグナル生成性
複合物を形成させるに充分な量の抗体をもはや入手利用
できないからである。これに対し抗原濃度が高いと（第
１図の領域Ｃ）、三成分複合物の形成が強く阻止される
ので、抗イデイオタイプ抗体の添加は実際上何ら付加的
効果がない。

ＨＤＨ試験のための操作 反応体（試料２００μ！および標識された抗体１００μ
りに加え、米国特許第４，５３６，４７７号の記載に従
い調製された抗イデイオタイプ抗体１η家を含有する溶
液２０μ）を加える。それ以外はすべての操作は第１回
目の測定と同じである。

試料 １　　９．６５３−ＨＤＨ ２１瓜１２５−ＨＤＨ ７１５，３９７＋＋＋　ＨＤＨ ＨＤＨ陽性の試料７は希釈することによｌ）　ＴＳＨ２
０００μ工Ｕ肩と測定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗原濃度の函数としての測定シグナルを示す。 第２図は抗原濃度の曲数としての測定シグナルを種々の
試料量について示す。 第３図はＡＦＰルーチン測定の代表的な頻度分布を示す
。 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）抗原物質（ａ）を含有する液体試料を、固相に固定
   され、未標識であり、（ａ）に対して特異的である抗体
   （ｂ）およびもう一つの、（ａ）に対して特異的である
   標識された抗体（ｃ）と連続してまたは一段階でインキ
   ュベーションして、（ａ）の量に相当する検出可能なシ
   グナルを発する、固相に結合した、（ａ）、（ｂ）およ
   び（ｃ）からなる三成分複合物を形成させることにより
   少くとも２個の抗体結合部位を有する抗原物質を免疫学
   的に測定するにあたり、第１回目の測定においてはコア
   測定領域および拡大測定領域を包含する全測定領域にわ
   たり抗原濃度を測定し、そして次に拡大測定領域中にお
   いて抗原の濃度が測定された試料を、抗原および／また
   は抗原等価物の量を高めたのちに第２回目の測定にかけ
   ることを特徴とする方法。 ２）第２回目の測定において抗原量を高めるために比較
   的大量の試料を使用しそして第１回目の測定より短時間
   インキュベーションしたのち抗原量を測定することを特
   徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）第２回目の測定に先立ち、さらに抗原および／また
   は抗イデイオタイプ抗体を添加することにより抗原濃度
   を高めることを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４）固相に固定された未標識抗体（ｂ）がモノクローナ
   ル抗体であるかまたはポリクローナル抗体であることを
   特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）未標識抗体（ｂ）が固相に吸着によるかまたは共有
   により結合していることを特徴とする、特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６）固相がプラスチックチューブ、ミクロ滴定プレート
   、プラスチックビーズまたはプラスチックプロペラから
   成るかまたは液体中に懸濁された顕微鏡的小ささのプラ
   スチックビーズからなることを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ７）標識された抗体（ｃ）がモノクローナル抗体または
   ポリクローナル抗体であり、そしてインデイケーターと
   して放射性同位元素、酵素、螢光基または化学ルミネセ
   ンス基を担持することを特徴とする、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ８）測定される抗原物質がヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈ
   ＴＳＨ）であるかまたは腫瘍胎児性タンパク質であるα
   −フェトプロテイン、ヒト絨毛ゴナドトロピンまたは癌
   胚抗原であることを特徴とする、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。