CN102590495A - 检测三聚氰胺的化学发光试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测三聚氰胺的化学发光试剂盒及其制备方法。本发明所提供的化学发光方法检测三聚氰胺的试剂盒，可以采取三聚氰胺包被载体，酶标记的抗抗体为酶标志物,也可以采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物。试剂盒还包括三聚氰胺校准品、上述酶作用的化学发光底物、浓缩洗涤液。本发明的化学发光试剂盒与酶联免疫法相比，具有更高的灵敏度与精密性，并且没有酶免底物OPD、TMB的致癌作用，操作步骤上，减少了一步显色温育与中止，操作更为方便，时间也有所缩短。与胶体金相比，可以更准确地定量确定样品中的三聚氰胺含量高低，具有更好的应用价值。另外，本试剂盒的主要试剂都是即开即用的液体形式，最大程度地方便了操作。

Description

检测三聚氰胺的化学发光试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体地，本发明提供了一种三聚氰胺的化学发光定量测定试剂盒的制备方法。

背景技术

食品安全检测是依据国家有关标准，评价食品质量、判断优劣的主要手段，为食品安全监管工作提供重要的技术支撑。随着国家对食品安全的日益重视，食品安全检测也在逐步发展中。

化学发光免疫分析（CLIA）是将具有高灵敏度的酶催化发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，用以检测抗原的分析技术。化学发光是近十年来在国内外最流行的免疫检测技术，其灵敏度、准确性均要高于传统的酶联免疫分析技术。

三聚氰胺（Melamine）是一种低毒、无味的纯白色单斜棱晶体，形似蛋白粉，属于三嗪类含氮杂环有机化合物，广泛应用于塑料、染料、化肥的生产和纺织行业。由于三聚氰胺分子含氮量高达66%，只要添加到食品或饲料中就可在检测中造成蛋白质含量较高的假象。目前在饲料、牛奶、奶粉、饼干、奶糖等相关产品均发现有三聚氰胺残留现象。动物实验结果表明，三聚氰胺的摄入可能会导致繁殖障碍、膀胱炎、慢性肾炎、肾结石、甚至膀胱癌。因此，食品安全领域需要高精密度与灵敏度的三聚氰胺检测方法。

目前三聚氰胺的检测方法主要采用气相色谱-质谱联用、液相色谱等物理方法，以及胶体金、酶联免疫等生化方法。色谱与质谱方法需要昂贵的仪器与复杂的操作，不适合现场监控与大量样品的筛查。免疫生化方法具有简便、快速的特点，但精密性与重复性存在缺陷。胶体金方法灵敏度低，精密度差，尚不能进行定量测定。酶联免疫方法可以进行定量测定，但精密性、灵敏度仍存在一定的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测三聚氰胺的化学发光试剂盒，具有简便、快速、灵敏、精密性好的特点。

制备上述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的化学发光方法检测三聚氰胺的试剂盒，采取以下两种可实现的模式中的任何一种：

1）采取三聚氰胺包被载体，酶标记的抗抗体为酶标志物。包被抗原与样本中的抗原竞争结合抗三聚氰胺抗体，酶标志物则结合在抗三聚氰胺抗体上。最后形成的［包被抗原-抗三聚氰胺抗体-酶标记抗抗体］复合物数量与样本中的抗原数量成反比例。

2）采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物。酶标志物与样本中的抗原竞争结合抗三聚氰胺抗体，再被包被抗抗体捕获，最后形成的［包被抗抗体-抗体-酶标记三聚氰胺］复合物数量与样本中的抗原数量成反比例。

所述的抗体可以为单克隆抗体即鼠抗三聚氰胺，也可为多克隆抗体即兔或羊抗三聚氰胺。针对鼠抗体的抗抗体可为兔抗鼠、羊抗鼠，针对兔抗体的抗抗体可为羊抗兔、驴抗兔，针对羊抗体的抗抗体可为驴抗羊。

所述的化学发光试剂盒还包括三聚氰胺校准品、上述酶作用的化学发光底物、浓缩洗涤液。

其中，所述化学发光底物可以为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物可以为（金刚烷）-1，2-二氧乙烷、3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3”-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）。

其中，所述浓缩洗涤液可以为PH值7.0～8.0的磷酸盐缓冲液，可以含有1%～2%的吐温-20，0.05～0.1%的叠氮化钠。

进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：

1）以三聚氰胺纯品配制三聚氰胺校准品；

2）以三聚氰胺或抗抗体包被载体；

3）以酶标记抗抗体或三聚氰胺；

4）稀释酶标志物、抗体至应用浓度；

5）分装以及组装试剂盒；

在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体为固相载体，可以为微孔板、塑料珠、塑料管或磁珠。优选为微孔板。所述酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

化学发光方法的原理包括免疫竞争反应及发光反应。免疫竞争反应如前所述，样本中的抗原与系统中的抗原竞争结合限量抗体，样本中的抗原数量与最终被固相捕获的酶数量成反相关。发光反应是指酶催化发光底物，发射出单光子信号，可以通过单光子计数器进行检测。

样本中的三聚氰胺的浓度是通过一条参考曲线（或称校准曲线）进行计算的。系列校准品含有不同浓度的三聚氰胺，检测后产生不同的单光子计数。在一定的浓度范围内，浓度与单光子计数之间符合logit-log或四参数曲线模型。根据样品的计数，可以从曲线推算出其浓度。

使用本发明的试剂盒时，可以将校准品或样本、酶标志物、抗体一起加入固相载体中，经过30分钟的免疫反应，经洗涤除去未被固相载体捕获的部分，再加入发光底物，用单光计数仪进行测量。

本发明的化学发光试剂盒与酶联免疫法相比，具有更高的灵敏度与精密性，并且没有酶免底物OPD、TMB的致癌作用，操作步骤上，减少了一步显色温育与中止，操作更为方便，时间也有所缩短。与胶体金相比，可以更准确地定量确定样品中的三聚氰胺含量高低。具有更好的应用价值。另外，本试剂盒的主要试剂都是即开即用的液体形式，最大程度地方便了操作。

附图说明

图1为三聚氰胺的结构式。

图2为试剂盒加样及反应模式。

图3为试剂盒组份图

其中：1. 系列校准品  2. 酶标志物  3. 抗体  4. 浓缩洗涤液  5. 预包被板  6. 底物A  7. 底物B

图4为羊抗鼠包被微孔板，酶标记三聚氰胺组建试剂盒的标准曲线。

图5为Melamine-BSA包被微孔板，酶标记羊抗鼠组建试剂盒的标准曲线。

具体实施方式

实施例1：采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒的制备与使用

一、采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒的检测原理

试剂盒反应体系中加入的液体包括样本（可能含有三聚氰胺）、酶标记三聚氰胺、抗三聚氰胺抗体。抗三聚氰胺抗体能特异性地识别三聚氰胺，能结合样本中的三聚氰胺与酶标记的三聚氰胺。由于抗体是限量的，因而样本中的三聚氰胺数量越多，其结合的抗体也越多，相应地，与酶标记三聚氰胺结合的抗体就越少。这种现象称为竞争反应。固相载体上的抗抗体能捕获抗体，最终在固相载体表面形成【抗抗体】-【抗三聚氰胺抗体】-【样本三聚氰胺】或【抗抗体】-【抗三聚氰胺抗体】-【酶标记三聚氰胺】两种复合物。其中后者与样本中的三聚氰胺数量成反相关的关系。洗涤除去未捕获的液体，加入发光底物，在酶的催化作用下发射光子。光子数量取决于被结合的酶标记三聚氰胺，因而与样本中的三聚氰胺反相关。用一定浓度的三聚氰胺校准品可以得出一条随浓度增加而发射光子数量减少的曲线，根据样本的发光值可以从曲线上推导其浓度。

二、采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒一般可以包括：

1、包被有抗抗体的固相载体，包被浓度可以从5mg/ml～20mg/ml。

2、酶标志物工作液，三聚氰胺与酶的偶联物，用稀释液稀释至工作浓度。稀释液一般包括0.01M~0.02M磷酸盐缓冲液，PH值7.0～8.0，0.5～1%的牛血清白蛋白。

3、抗三聚氰胺抗体工作液，可以为兔抗三聚氰胺多克隆抗体，也可以为鼠抗三聚氰胺单克隆抗体。用稀释液稀释至工作浓度。稀释液一般包括0.01M~0.02M磷酸盐缓冲液，PH值7.0～8.0，0.5～1%的牛血清白蛋白。

4、三聚氰胺校准品，浓度分别为0、3、10、30、100、300ng/ml，配制标准品的稀释液为5～10%二甲基甲酰胺，0.05～0.1M 磷酸盐缓冲液，PH7.0～8.0。

5、发光底物液，由A液与B液组成。A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为异鲁米诺或鲁米诺。

6、浓缩洗涤液，PH值7.0～8.0，1：20稀释后使用。稀释后的洗涤液含有0.01M～0.02M磷酸盐缓冲液，PH值7.0～8.0，0.05～0.1%的吐温20。

三、采取抗抗体包被载体，酶标记三聚氰胺作为酶标志物试剂盒的具体组成及其制备

1、包被有抗抗体的固相载体

原料：10mg/ml的羊抗鼠IgG

稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液（PB），pH7.2

封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液（PB），pH7.2，1%牛血清白蛋白。

配制方法：原料按1：500稀释，混匀，静置30分钟以达到平衡，称为包被液。按每孔100ml等体积加入发光微孔板的各孔中，4℃放置24小时。弃去包被液，用0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.2加满各孔，静置1分钟，弃去，再加入等体积的封闭液，4℃放置24小时。弃去封闭液，真空抽干，用铝箔袋真空密封后可长期保存。

2、酶标志物工作液

原料：三聚氰胺-辣根过氧化物酶偶联物(Melamine-HRP)，浓度1mg/ml。

稀释液：0.01M PB，0.5% BSA，pH7.2，0.1%Proclin-300

配制方法：原料按1：5000稀释，混匀，按7ml/瓶分装备用。

3、抗三聚氰胺抗体工作液

原料：抗三聚氰胺单克隆抗体

稀释液：0.01M PB，0.5% BSA，pH7.2，0.1%Proclin-300

配制方法：原料按1：2000稀释，混匀，按7ml/瓶分装备用。

4、三聚氰胺校准品

原料：三聚氰胺纯品，用二甲基甲酰胺溶解配制为1mg/ml。

稀释液：10%二甲基甲酰胺，0.1M 磷酸盐缓冲液，PH7.2。

配制方法：原料分别按1：333333、1：100000、1：33333、1：10000、1：3333稀释，配制为系列校准品，浓度分别为3、10、30、100、300ng/ml。以稀释液为0ng/ml。

5、发光底物液A，发光底物液B：分别含3mmol/L的过氧化氢与2mmol/L的鲁米诺。

6、浓缩洗涤液：配制0.2M磷酸盐缓冲液，PH7.2，3%Tween-20，按15ml/瓶进行分装。使用前按照1：20进行稀释为洗涤液工作液。

四、检测操作过程：

1.    向微孔板各孔中加入50ml三聚氰胺校准品或待测样本。

2.    向微孔板各孔中加入50ml酶标志物（三聚氰胺-辣根过氧化物酶偶联物）。

3.    向微孔板各孔中加入50ml抗体（抗三聚氰胺单克隆抗体）。

4.    将微孔板室温振荡反应30分钟。

5.    吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗6次，每次1分钟，末次洗板后将板拍干。

6.    各孔中加入50ml底物液A与50ml底物液B。

7.    将微孔板放入化学发光仪上检测各孔发光值。

五、数据处理：

1、联机处理：由电脑自动处理得出结果。可以使用logit-log数据处理模式。

       拟合方程为：logit(Y)=Alog(X)+B ，Y为光子计数，X为浓度。A，B为直线参数。A代表斜率，B代表截距。

       logit计算：各校准品管或样本管的logit值计算公式如下：logit=( B/B0)/(1―B/B0)。其中B/B0为百分结合率。

百分结合率计算：设0校准管计数为B0，各校准品管或样本管计数为B，则百分结合率=B/B0×100%。

       2、测定实例如下表

校准品X	S0	S1=3	S2=10	S3=30	S4=100	S5=300	Sample
								复孔1	1212600	928809	582298	354208	180671	92678	380541
复孔2	1419520	941752	635128	344807	185143	99602	368211
								B/B0	-	71.1%	46.3%	26.6%	13.9%	7.3%	28.4%

计算后的拟合方程为：logit(Y)=－1.71Log(X)+1.62

曲线相关系数R=0.9979，计算sample测值为30.5ng/ml。

3、准确性试验

在奶粉样本中添加三聚氰胺浓品，添加后使样本中三聚氰胺浓度增加分别为10ng/ml、50ng/ml、200ng/ml，添加体积为5%。未添加样本加入同等体积稀释液作为空白对照。双孔测定含添加前后的样本浓度，结果如下表：

样本	未添加	添加1	添加2	添加3
					测值	5.4ng/ml	14.5ng/ml	53.7ng/ml	203.1 ng/ml
差值	-	9.1	48.3	197.7
					投入浓度	-	10	50	200
回收率	-	91.0%	96.6%	98.9%

平均回收率为95.5%。

4、特异性试验

配制高浓度的三嗪、三嗪二铵，浓度为1mg/ml作为样本，使用本试剂盒进行测定，结果如下表：

样本	三嗪	三嗪二铵
			配制浓度	1mg/ml	1mg/ml
测定浓度	2ng/ml	0.8ng/ml
			交叉反应率	0.2%	0.08%

5、精密性实验

用奶粉样本配为浓度约为10～20ng/ml、50～100ng/ml的两份质控。质控用本试剂盒连续测定10孔，分别计算各孔测值，再计算变异系数CV。结果如下表：

孔别	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											QC1	14.1	13.4	14.0	15.2	15.2	13.4	15.2	15.0	14.0	13.5
QC2	78.0	80.3	81.0	80.4	82.6	75.2	79.9	77.6	73.7	83.5

QC1的测定CV=5.4%，QC2的测定CV=3.9%。

6、灵敏度实验。

重复测定20孔S0，计算其发光计数的均值及标准差。均值减去2倍标准差的对应计算浓度为方法的分析灵敏度。

1551214	1367863	1324355	1332958	1335307	1279211	1313712	1227609	1233158	1303268
										1299369	1225312	1259512	1341686	1246825	1351853	1232040	1269554	1244912	1234324

计算发光计数的均值为1298702，标准差为75502，均值减去2倍标准差为1147698，对应计算浓度为0.13ng/ml。

7、试剂盒置37℃放置7天，取出后再次评价其性能，结果各项指标仍保持良好。

校准品X	S0	S1=3	S2=10	S3=30	S4=100	S5=300
							复孔1	1256127	785445	500236	303500	169716	95830
复孔2	1182889	796618	538213	292415	162460	81237
							B/B0	-	64.9%	42.6%	24.4%	13.6%	7.3%

计算后的拟合方程为：logit(Y)=－1.57Log(X)+1.30，曲线相关系数R=0.9985。

测定平均回收率为94.6%，交叉反应率三嗪为0.15%，三嗪二胺为0.17%。精密性试验，CV%（QC1）＝4.5%，CV%（QC2）＝3.3%，灵敏度实验结果为0.08ng/ml。

 

实施例2：采取三聚氰胺包被载体，酶标记抗抗体作为酶标志物试剂盒的制备与使用

一、采取三聚氰胺包被载体，酶标记抗抗体作为酶标志物试剂盒的检测原理

试剂盒反应体系中加入的液体包括样本（可能含有三聚氰胺）、酶标记抗抗体、抗三聚氰胺抗体。抗三聚氰胺抗体能特异性地识别三聚氰胺，能结合样本中的三聚氰胺与固相载体上的三聚氰胺。由于抗体是限量的，因而样本中的三聚氰胺数量越多，其结合的抗体也越多，相应地，与固相载体上的三聚氰胺结合的抗体就越少。这种现象称为间接竞争反应。酶标记抗抗体能结合在抗体上，最终在固相载体表面形成【固相三聚氰胺】-【抗三聚氰胺抗体】-【酶标记抗抗体】复合物。复合物数量与样本中的三聚氰胺数量成反相关的关系。洗涤除去未捕获的液体，加入发光底物，在酶的催化作用下发射光子。光子数量取决于被结合的酶标记抗抗体，因而与样本中的三聚氰胺反相关。用一定浓度的三聚氰胺校准品可以得出一条随浓度增加而发射光子数量减少的曲线，根据样本的发光值可以从曲线上推导其浓度。

二、采取三聚氰胺包被载体，酶标记抗抗体作为酶标志物试剂盒一般可以包括：

1、包被有三聚氰胺的固相载体，包被浓度可以从1mg/ml～2mg/ml。

2、酶标志物工作液，抗抗体与酶的偶联物，用稀释液稀释至工作浓度。稀释液一般包括0.01M~0.02M磷酸盐缓冲液，PH值7.0～8.0，2～5%的小牛血清。

3、抗三聚氰胺抗体工作液，可以为兔抗三聚氰胺多克隆抗体，也可以为鼠抗三聚氰胺单克隆抗体。用稀释液稀释至工作浓度。稀释液一般包括0.01M～0.02M磷酸盐缓冲液，PH值7.0～8.0，2～5%的小牛血清。

4、三聚氰胺校准品，浓度分别为0、5、20、80、300、1000ng/ml，配制标准品的稀释液为5～10%二甲基甲酰胺，0.05～0.1M 磷酸盐缓冲液，PH7.0～8.0。

5、发光底物液，由A液与B液组成。A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为异鲁米诺或鲁米诺。

6、浓缩洗涤液，PH值为7.0～8.0，1：20稀释后使用。稀释后的洗涤液含有0.01M～0.02M磷酸盐缓冲液，PH值7.0～8.0，0.05～0.1%的吐温20。

三、采取三聚氰胺包被载体，酶标记抗抗体作为酶标志物试剂盒的具体组成及其制备

1、包被有三聚氰胺的固相载体

原料：1mg/ml的Melamine-BSA

稀释液：0.01M碳酸盐缓冲液（CB），pH9.6

封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液（PB），pH7.2，1%牛血清白蛋白。

配制方法：原料按1：1000稀释，混匀，静置30分钟以达到平衡，称为包被液。按每孔100ml等体积加入发光微孔板的各孔中，4℃放置24小时。弃去包被液，用0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.2加满各孔，静置1分钟，弃去，再加入等体积的封闭液，4℃放置24小时。弃去封闭液，真空抽干，用铝箔袋真空密封后可长期保存。

2、酶标志物工作液

原料：羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶偶联物(HRP-GAM)，浓度1mg/ml。

稀释液：0.01M PB，2%小牛血清，pH7.2，0.1%Proclin-300

配制方法：原料按1：1000稀释，混匀，按7ml/瓶分装备用。

3、抗三聚氰胺抗体工作液

原料：抗三聚氰胺单克隆抗体

稀释液：0.01M PB，2%小牛血清，pH7.2，0.1%Proclin-300

配制方法：原料按1：5000稀释，混匀，按7ml/瓶分装备用。

4、三聚氰胺校准品

原料：三聚氰胺纯品，用二甲基甲酰胺溶解配制为1mg/ml。

稀释液：10%二甲基甲酰胺，0.1M 磷酸盐缓冲液，PH7.2。

配制方法：原料分别按1：200000、1：50000、1：12500、1：3333、1：1000稀释，配制为系列校准品，浓度分别为5、20、80、300、1000ng/ml。以稀释液为0ng/ml。

5、发光底物液A，发光底物液B：分别含3mmol/L的过氧化氢与2mmol/L的鲁米诺。

6、浓缩洗涤液：配制0.2M磷酸盐缓冲液，PH7.2，3%Tween-20，按15ml/瓶进行分装。使用前按照1：20进行稀释为洗涤液工作液。

四、检测操作过程：

1.    向微孔板各孔中加入50ml三聚氰胺校准品或待测样本。

2.    向微孔板各孔中加入50ml酶标志物。

3.    向微孔板各孔中加入50ml抗体（抗三聚氰胺单克隆抗体）。

4.    将微孔板放入37℃水浴锅中，温育反应30分钟。

5.    吸出或倒出反应液，加入洗涤液洗6次，每次1分钟，末次洗板后将板拍干。

6.    各孔中加入50ml底物液A与50ml底物液B。

7.    将微孔板放入化学发光仪上检测各孔发光值。

五、数据处理：

1、联机处理：由电脑自动处理得出结果。可以使用logit-log数据处理模式。

拟合方程为：logit(Y)=Alog(X)+B ，Y为光子计数，X为浓度。A，B为直线参数。A代表斜率，B代表截距。

logit计算：各校准品管或样本管的logit值计算公式如下：logit=(B/B0)/(1―B/B0)。其中B/B0为百分结合率。

百分结合率计算：设0校准管计数为B0，各校准品管或样本管计数为B，则百分结合率=B/B0×100%。

       2、测定实例如下表

校准品X	S0	S1=5	S2=20	S3=80	S4=300	S5=1000	Sample
								复孔1	8184347	6813243	4929600	3585686	2010464	968481	4526812
复孔2	8251363	6624980	5063860	3069021	1867066	943979	4722563
								B/B0	-	81.8%	60.8%	40.5%	23.6%	11.6%	56.3%

计算后的拟合方程为：logit(Y)=－1.50Log(X)+2.49

曲线相关系数R=0.9989，计算sample测值为30.9ng/ml。

3、准确性试验

在奶粉样本中添加三聚氰胺浓品，添加后使样本中三聚氰胺浓度增加分别为10ng/ml、50ng/ml、200ng/ml，添加体积为5%。未添加样本加入同等体积稀释液作为空白对照。双孔测定含添加前后的样本浓度，结果如下表：

样本	未添加	添加1	添加2	添加3
					测值	7.3	16.8	53.9	186.9
差值	-	9.5	46.6	179.6
					投入浓度	-	10	50	200
回收率	-	95.0%	93.2%	89.8%

平均回收率为92.7%。

4、特异性试验

配制高浓度的三嗪、三嗪二铵，浓度为1mg/ml 。作为样本，使用本试剂盒进行测定，结果如下表：

样本	三嗪	三嗪二铵
			配制浓度	1mg/ml	1mg/ml
测定浓度	5ng/ml	4.2ng/ml
			交叉反应率	0.5%	0.42%

5、精密性实验

用奶粉样本配为浓度约为10～20ng/ml、50～100ng/ml的两份质控。质控用本试剂盒连续测定10孔，分别计算各孔测值，再计算变异系数CV。结果如下表：

孔别	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											QC1	15.1	16.6	16.4	15.7	17.2	16.8	16.5	16.1	15.7	15.5
QC2	86.0	96.9	89.2	97.0	89.9	78.3	89.7	91.9	94.0	77.8

QC1的测定CV=4.1%，QC2的测定CV=7.6%。

6、灵敏度实验。

重复测定20孔S0，计算其发光计数的均值及标准差。均值减去2倍标准差的对应计算浓度为方法的分析灵敏度。

8461319	8710138	8644624	8693758	8991004	8373728	8737904	8249450	8424737	8665371
										8098894	9032888	9003595	8290128	8258072	8847586	8105330	8954476	8522155	8999853

计算发光计数的均值为8603251，标准差为310756，均值减去2倍标准差为7981737，对应计算浓度为0.23ng/ml。

7、试剂盒置37℃放置7天，取出后再次评价其性能，结果各项指标仍保持良好。

校准品X	S0	S1=3	S2=10	S3=30	S4=100	S5=300
							复孔1	6577026	5866675	4290515	3037097	1789771	832144
复孔2	6192385	5295774	4754355	3102194	1605581	809452
							B/B0	-	87.4%	70.8%	48.1%	26.6%	12.9%

计算后的拟合方程为：logit(Y)=－1.66Log(X)+3.08，曲线相关系数R=－0.9999。

测定平均回收率为93.2%，交叉反应率三嗪为0.28%，三嗪二胺为0.46%。精密性试验，CV%（QC1）＝3.5%，CV%（QC2）＝4.9%，灵敏度实验结果为0.30ng/ml。

 

实施例3：

按照本领域中常规的制造与检定规程制定试剂盒的质量标准，见下表：

试生产三个批次的检验结果均符合标准，说明三聚氰胺化学发光定量测定试剂盒的准确性、特异性、精密性、灵敏度及稳定性均达到了预定的产品质量标准。

 

实施例4：

化学发光方法与酶联免疫方法进行比较

以上结果表明化学发光法在灵敏度与精密性方面均明显优于酶联免疫法。

Claims (7)

1.一种检测三聚氰胺的化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

三聚氰胺校准品；

包括有三聚氰胺或抗抗体的载体；

酶标记的抗抗体或三聚氰胺；

抗三聚氰胺抗体；

上述酶作用的化学发光底物。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为固相载体。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁珠。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺，（金刚烷）-1，2-二氧乙烷、3-（2’-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3”-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，载体包被三聚氰胺时，酶标志物使用酶标记抗抗体，载体包被抗抗体时，酶标志物使用酶标记的三聚氰胺。

7.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

以三聚氰胺纯品配制三聚氰胺校准品；

以三聚氰胺或抗抗体包被载体；

以酶标记抗抗体或三聚氰胺；

稀释酶标志物、抗体至应用浓度；

分装以及组装试剂盒。

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