CN101324578A - 一种用于检测肿瘤标志物ca50的免疫放射分析试剂盒及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析方法试剂盒及其应用方法,该试剂盒中包括包被有二抗的磁性微粒子;标记的CA50单克隆抗体及125I标记的CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液。本发明与已知的测定CA50的放射免疫试剂盒相比,具有高通量、高灵敏度、线性范围宽、快速等诸多优点,在临床检验等方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种用于检测肿瘤标志物CA50的免疫放射分析试剂盒及其应用方法。
背景技术
癌症对人类的生存健康构成了严重威胁。目前肿瘤治疗的关键在于早期发现、早期治疗,这已是人们的共识。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代,越来越多肿瘤标志物的发现为建立发展快速、高灵敏、高特异肿瘤标志物的新型检测技术提出了更高的要求。糖类蛋白50(CA50)主要分布于糖脂和糖蛋白中,是一种广谱的肿瘤糖类抗原,属鞘糖脂类肿瘤标志物,其对多种上皮类恶性肿瘤有较高的阳性检出率。通常在消化道肿瘤的病人中可以观察到血清中CA 50含量的升高,将其与CEA、CA125、CA199等标志物联检,可为疾病的前期筛查、辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、癌细胞转移以及预后提供有参考价值的依据。
在实际的免疫检测中,由于待测样品中所含的杂质成分较多,一定程度上影响了检测灵敏度和准确性,所以从复杂的背景中快速分离、纯化出目的待测物,是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁性微粒子技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒子作载体,以化学偶联法包被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体),使其致敏为免疫磁性粒子,具有分离速度快、效率高、可重复性好;操作简单、不需要昂贵的仪器设备;不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点,在外加磁场作用下定向运动,使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
发明内容
本发明的目的在于通过一种检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析方法,即将驴抗鼠或兔抗鼠抗抗体、亲和素、抗FITC抗体中的任一种偶联或包被于磁颗粒表面作为反应固相,并对应捕获溶液中的免疫夹心物,形成抗抗体-单抗-抗原-单抗、亲和素-生物素化单抗-抗原-单抗、抗FITC抗体-FITC标记单抗-抗原-单抗等三种双夹心免疫复合物,洗涤分离后,根据放射性计数对样品中CA50进行定量测定。
本发明提供了一种检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其中包括包被有二抗的磁性微粒子;标记的CA50单克隆抗体及125I标记的CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液。
其中二抗指的是驴抗鼠或兔抗鼠抗抗体、亲和素、抗FITC抗体中的任一种,根据二抗体系的不同,试剂盒的组成可以具体表述为:(1)包被有驴抗鼠或兔抗鼠抗抗体的磁性微粒子;抗CA50单克隆抗体及125I标记的抗CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液;(2)包被有亲和素的磁性微粒子;生物素标记的抗CA50单克隆抗体及125I标记的抗CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液;(3)包被有抗FITC抗体的磁性微粒子;FITC标记的抗CA50单克隆抗体及125I标记的抗CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液。
本发明中包被二抗的磁性微粒子为粒径为2-3μm、使用浓度为5-10mg/mL、内核为四氧化三铁(Fe3O4)、表面包裹带有活性基团如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)的聚合物;所述二抗的包被是通过戊二醛两步法将磁性微粒子与二抗进行偶联,并以含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)、1%酪蛋白的pH为7.2,0.02mol/L的磷酸缓冲液进行封闭完成。
当本发明中包被二抗为驴抗鼠或兔抗鼠抗抗体时,所用两株抗CA50单克隆抗体一株不必标记,一株标记125I。
当本发明中包被二抗为亲和素时,所用两株抗CA50单克隆抗体一株标记生物素,一株标记125I。所述生物素的标记是以碳化酰二亚胺法制备生物素与单抗的偶联物。生物素标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液;所述生物素标记抗体液以20%小牛血清稀释存放。
当本发明中包被二抗为抗FITC抗体时,所用两株抗CA50单克隆抗体一株标记FITC,一株标记125I。所述FITC的标记是以碱性液标记法制备FITC与单抗的偶联物。FITC标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液;所述FITC标记抗体液以20%小牛血清稀释存放。
本发明中125I标记抗体采用氯胺T法进行,125I和标记物应妥善保管。
本发明中混合标记物液是按体积比为1∶1-1∶3,将标记的CA50单克隆抗体及125I标记的CA50单克隆抗体混合而成的标记物液。所述标记物混合液的溶剂成分为0.05%甘油、0.05%BSA、0.2g/L的硫柳汞。
本发明中标准品溶液为5个浓度梯度CA50的溶液;所述配制标准品的基质为50%马血清。
本发明中质控品及其含量是以正常人血清投入已知量的CA50标准品,并根据临床参考值以及剂量-反应曲线的工作范围而定。
本发明中浓缩洗涤液为pH值为7.4,含有0.1-0.5%吐温-20,0.1%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。
本发明中所用的反应管材料可为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等。
本发明提供的检测CA50的方法,是利用所述包被二抗的磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测血清中CA50。
所述检测CA50的方法还可包括样品的前处理。
本发明所提供的检测CA50的方法,包括以下步骤:
1)样品前处理
对临床血清血浆,3000rpm离心5分钟,取上层液即可进行分析测定。
2)利用上述检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测样品。
本发明的试剂盒可定性、定量检测人血清样品中CA50含量。
本发明所述的检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒主要采用二抗包被的磁性微粒子固相分离及双抗夹心的反应模式定性或定量检测人体血清血浆等样品中CA50含量;对样品的前处理要求低,样品前处理过程简单可靠,可快速、高通量检测大批样品。
CA50是一种糖类抗原,属蛋白大分子,对此类分子一般采用双抗体夹心的方法进行测定。上世纪70年代开始,科学家们通过杂交瘤技术陆续得到了糖类抗原的单克隆抗体,从而为建立双抗体夹心的免疫检测模式提供了保证。
本发明的检测原理是当反应液中有CA50单克隆抗体(或FITC标记CA50单克隆抗体、或生物素标记CA50单克隆抗体)和125I标记CA50单克隆抗体时,加入CA50系列标准品或样品溶液后,通过“识别”抗原分子上的抗原决定簇,在溶液中形成标记抗体-抗原-标记抗体复合物。然后加入包被有二抗的磁性微粒子,使其充分分散于溶液中,通过免疫反应即可将免疫复合物偶联富集到磁性微粒子表面,在试管底部施加磁场后即可将偶联有免疫复合物的磁性粒子富集于试管底部。洗涤分离后,即可将反应管直接置于自动放免仪中测定。样品的辐射强度与样品中抗原含量成正相关,与标准曲线比较即可得出相应的抗原含量。
本发明的检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒主要采用直接夹心法定性或定量检测人血清、血浆等样品中CA50的含量;对样品的前处理要求低,前处理过程简单,能快速、高通量检测大批样品;采用了高特异的单克隆抗体和超顺磁、高分散、比表面积大的磁性微粒子,主要试剂以工作液的形式提供,检验方法方便易行,具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利,与市场上的酶联免疫试剂盒、板式化学发光试剂盒相比,线性范围宽,有效避免弯钩效应,不需样品稀释,适用于大批量样品筛选的定性、定量。
本发明提供的检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析方法及其试剂盒,具有以下优点:(1)磁性微粒子大大提高蛋白的有效包被量从而节省原料,同时可检测的线性范围大为拓宽,从而有效避免弯钩效应的发生;(2)二抗体系可以克服抗体直接物理吸附于固相所造成的结合行为的非均一性,减少了反应的温育时间,重现性好;(3)改善了抗体直接包被固相后活性下降的状况,使得抗体的免疫活性在很大程度上可以得到保存;(4)分离速度快、效率高、操作简便,非常适合于自动化检测。
附图说明
图1是以二抗(为驴抗鼠多克隆抗体)包被的磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测CA50的标准曲线(双对数曲线)
图2是以二抗(抗FITC抗体)包被的磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测CA50的标准曲线(双对数曲线)
图3是以二抗(链霉亲和素)包被的磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测CA50的标准曲线(双对数曲线)
具体实施方式
下述实施例的方法如无特别说明,均为常规方法。
下述实施例中的百分含量,如无特别说明,均为质量百分含量。
实施例1、包被驴抗鼠多克隆抗体的磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测血清中CA50。
包被驴抗鼠多克隆抗体的CA50磁性微粒子免疫放射分析试剂盒包括:
(1)包被有驴抗鼠多克隆抗体的磁性微粒子:粒径为2-3μm、使用浓度为5-10mg/mL,20mL/瓶,1瓶;
(2)CA50单克隆抗体液及标记125I的CA50单克隆抗体液混合作为标记物液:体积比为1∶1,15mL/瓶,1瓶。其中CA50单克隆抗体液以0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞和0.5%BSA稀释为2.5μg/mL,125I标记的CA50单克隆抗体液以0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞和0.5%BSA稀释为3.0μg/mL。
(3)CA50标准品及质控品:用50%马血清将CA50浓标准品稀释成标准溶液6瓶,0U/mL,10U/mL,20U/mL,40U/mL,80U/mL,140U/mL,0.5mL/瓶;质控品为2瓶,20U/mL、80U/mL,0.5mL/瓶;
(4)浓缩洗涤液:pH值为7.4,含有0.1-0.5%吐温-20,0.1%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。30mL/瓶,1瓶。使用时用蒸馏水稀释20倍;
(6)反应试管:所用的反应管材料为聚苯乙烯,铝膜真空封装,100支/包,1包。
其中,驴抗鼠多克隆抗体包被磁性微粒子、125I标记的CA50单克隆抗体制备方法如下:
一、驴抗鼠多克隆抗体包被磁性微粒子的制备
1、驴抗鼠多克隆抗体包被磁性微粒子的制备原理:磁性微粒子是内核为Fe3O4、表面包裹了带有活性基团氨基的聚合物,可采用戊二醛两步法将磁性微粒子与驴抗鼠多克隆抗体进行偶联。如此合成的包被有驴抗鼠多克隆抗体的颗粒,不仅有效包被量增加,而且在微观空间具有“长臂”,从而减少空间位阻,使得抗体IgG对抗原的识别域充分展开,有利于抗体-抗原的空间匹配与非共价结合。
2、驴抗鼠多克隆抗体包被磁性微粒子的制备方法:取浓度为50-100mg/mL、粒径为2-3μm的磁性微粒子5mL,加入0.5-1.5%的戊二醛0.1-0.5mL进行活化,室温搅拌,混匀3小时后,加磁场,静置10-15min,倒出上清,用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次,并用该溶液进行悬浮,浓度为50-100mg/mL;每毫升悬浮液中加入驴抗鼠多克隆抗体20-80μg,在4℃下搅拌过夜后,加磁场,静置10-15min,倒出上清,用含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH为7.2,0.02mol/L的磷酸缓冲液于室温封闭3-4小时;最后用pH值为7.4、含0.5%BSA的0.02mol/LTris-HCl缓冲液清洗三次,并用该溶液配制成5-10mg/mL的工作液。磁性微粒子分离剂在4℃保存,不应冻存,用时轻轻摇匀。
二、125I标记的CA50单克隆抗体的制备
1、125I标记的CA50单克隆抗体的制备原理:125I标记的CA50单克隆抗体以氯胺T标记法进行制备。氯胺T是一种氧化剂,在水溶液中可以缓慢地释放次氯酸,因而可以在标记的过程中形成一种能产生温和氧化效果的中间体,它可使放射性碘离子氧化而呈活泼形式的碘离子,并取代抗原分子中酪氨酸苯环羟基邻位的一个或二个氢原子,使之成为含有碘化酪氨酸的多肽链。
2、125I标记CA50单克隆抗体的制备方法:
(1)将抗体以0.5mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液稀释为20μg/μL,取5μL-10μL。
(2)取Na125I 5μL(含2mci-3mci)。
(3)将1mg氯胺T溶于0.5mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液0.1mL中。
(4)再将Na125I和氯胺T分别缓缓加入抗体液中,于冰浴中边加边搅拌,加完后再搅拌5min。
(5)加30mg/mL的偏重硫酸钠0.1mL,稀释液为0.5mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。
(6)过SephadexG50柱,第一峰即为碘标记抗体。
利用该试剂盒检测样品中CA50含量的方法如下:
一、样品前处理
对人血清血浆:取空腹晨血样本,3000rpm离心5min,取上层液25μL进行分析。待测样品2-8℃存放不得超过48小时,若48小时未检测,应于-20℃以下保存,但不应超过30天。
二、检测方法
向试管中加入50μL血清样品或同体积的系列标准品溶液,再加入标记物混合液50μL,37℃水浴反应30min。加入磁性微粒子溶液100μL,室温放置5min后,将试管架置于磁分离器上分离2min,然后倒转分离器倒出上清液,将倒转的试管放在滤纸上,拍击分离器以除去挂壁液体。每管加入洗涤液500μL,用圆周运动使其充分混匀,置于磁分离器上分离5min,然后倒转分离器倒出上清液,将倒转的试管放在滤纸上,拍击分离器以除去挂壁液体,重复3次。取出试管,测各管放射性计数。
三、结果分析
放射性计数-剂量反应曲线以双对数曲线表示,即所获得的每个浓度标准溶液或样本放射性计数的平均值(B)减去第一个零标准点的放射性计数(B0),再取对数,即
纵轴(Y轴)=ln(B-B0)
以CA50浓度的对数值为横轴(X轴),绘制标准曲线,如图1所示。相应每一个样品中CA50浓度可以从标准曲线上读出。也可以用多参数回归方程法进行拟合,计算出样本溶液中CA50的浓度。本试剂盒提供的线性范围为0-150U/mL,检测限为3.5U/mL,整个检测过程只需1.5个小时即可完成,完全符合临床要求。并且由于线性较宽,避免了高浓度样品的稀释,弯钩效应也可以得到避免。
实施例2、包被抗FITC抗体的磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测血清中CA50。
包被抗FITC抗体的CA50磁性微粒子免疫放射分析试剂盒包括:
(1)包被有抗FITC抗体的磁性微粒子:粒径为2-3μm、使用浓度为5-10mg/mL,20mL/瓶,1瓶;
(2)标记FITC的CA50单克隆抗体液及标记125I的CA50单克隆抗体液混合作为标记物液:体积比为1∶2,15mL/瓶,1瓶。其中FITC标记的CA50单克隆抗体液以0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞和0.5%BSA稀释为1.25μg/mL,125I标记的CA50单克隆抗体液以0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞和0.5%BSA稀释为2.5μg/mL。
(3)CA50标准品及质控品:用50%马血清将CA50浓标准品稀释成标准溶液6瓶,0U/mL,10U/mL,20U/mL,40U/mL,80U/mL,140U/mL,0.5mL/瓶;质控品为2瓶,20U/mL、80U/mL,0.5mL/瓶;
(4)浓缩洗涤液:pH值为7.4,含有0.1-0.5%吐温-20,0.1%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。30mL/瓶,1瓶。使用时用蒸馏水稀释20倍;
(6)反应试管:所用的反应管材料为聚苯乙烯,铝膜真空封装,100支/包,1包。
其中,抗FITC抗体包被磁性微粒子、FITC标记CA50单克隆抗体、125I标记的CA50单克隆抗体制备方法如下:
一、抗FITC抗体与磁性微粒子偶联物的制备
1、抗FITC抗体与磁性微粒子偶联物的制备原理:磁性微粒子是内核为Fe3O4、表面包裹了带有活性基团氨基的聚合物,可采用戊二醛两步法将磁性微粒子与抗FITC抗体进行偶联。如此合成的包被有抗FITC抗体的颗粒,不仅有效包被量增加,而且在微观空间具有“长臂”,从而减少空间位阻,使得抗体IgG对抗原的识别域充分展开,有利于抗体-抗原的空间匹配与非共价结合。
2、抗FITC抗体与磁性微粒子偶联物的制备方法:将粒径为2-3μm的磁性微粒子用戊二醛进行活化,室温搅拌,混匀3小时后,加磁场,静置10-15min,倒出上清,用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次,并用该溶液进行悬浮,浓度为50-100mg/mL;每毫升悬浮液中加入抗FITC抗体20-80μg,在4℃下搅拌过夜后,加磁场,静置10-15min,倒出上清,用含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH为7.2,0.02mol/L的磷酸缓冲液于室温封闭3-4小时;最后用pH值为7.4、含0.5%BSA的0.02mol/LTris-HCl缓冲液清洗三次,并用该溶液配制成5-10mg/mL的工作液。磁性微粒子分离剂在4℃保存,不应冻存,用时轻轻摇匀。
二、FITC标记的CA50单克隆抗体的制备
1、FITC标记的CA50单克隆抗体的制备原理:FITC分子与CA50单克隆抗体的偶联物是以常见的碱性液标记法对抗体进行标记。
2、FITC标记的CA50单克隆抗体的制备方法:
(1)A液:取CA50单克隆抗体0.5mg置于50mmol/L pH值为9.3的Na2CO3-NaHCO3缓冲液中;
(2)B液:取FITC 2mg溶于1mL 50mmol/L pH值为9.3的Na2CO3-NaHCO3缓冲液中;
(3)将A液置于磁力搅拌器,取B液缓缓滴加至A液中,约在5-8分钟间加完,防止出现气泡,然后置4℃搅拌12~16小时;
(4)将反应液装透析袋,置10mmol/L pH值为7.4的磷酸缓冲液中透析2天,每天更换透析液2次;
(5)将标记物以20%小牛血清稀释为1.25μg/mL,加入适量proclin300,分装,20℃下保存。
三、125I标记的CA50单克隆抗体的制备方法同实施例1
利用该试剂盒检测样品中CA50含量的方法如下:
一、样品前处理
对人血清血浆:取空腹晨血样本,3000rpm离心5min,取上层液25μL进行分析。待测样品2-8℃存放不得超过48小时,若48小时未检测,应于-20℃以下保存,但不应超过30天。
二、检测方法
向试管中加入50μL血清样品或同体积的系列标准品溶液,再加入标记物混合液50μL,37℃水浴反应30min。加入磁性微粒子溶液100μL,室温放置5min后,将试管架置于磁分离器上分离2min,然后倒转分离器倒出上清液,将倒转的试管放在滤纸上,拍击分离器以除去挂壁液体。每管加入洗涤液500μL,用圆周运动使其充分混匀,置于磁分离器上分离5min,然后倒转分离器倒出上清液,将倒转的试管放在滤纸上,拍击分离器以除去挂壁液体,重复3次。取出试管,测各管放射性计数。
三、结果分析
放射性计数-剂量反应曲线以双对数曲线表示,即所获得的每个浓度标准溶液或样本放射性计数的平均值(B)减去第一个零标准点的放射性计数(B0),再取对数,即
纵轴(Y轴)=ln(B-B0)
以CA50浓度的对数值为横轴(X轴),绘制标准曲线,如图2所示。相应每一个样品中CA50浓度可以从标准曲线上读出。也可以用多参数回归方程法进行拟合,计算出样本溶液中CA50的浓度。本试剂盒提供的线性范围为0-150U/mL,检测限为4.0U/mL,整个检测过程只需1.5个小时即可完成,完全符合临床要求。并且由于线性较宽,避免了高浓度样品的稀释,弯钩效应也可以得到避免。
实施例3、包被链霉亲和素的磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测血清中CA50。
包被链霉亲和素的CA50磁性微粒子免疫放射分析试剂盒包括:
(1)包被有链霉亲和素的磁性微粒子:粒径为2-3μm、使用浓度为5-10mg/mL,20mL/瓶,1瓶;
(2)标记链霉亲和素CA50单克隆抗体液及标记125I的CA50单克隆抗体液混合作为标记物液:体积比为1∶3,15mL/瓶,1瓶。其中链霉亲和素标记的CA50单克隆抗体液以0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞和0.5%BSA稀释为1.25μg/mL,125I标记的CA50单克隆抗体液以0.05%甘油、0.2g/L的硫柳汞和0.50%BSA稀释为2.5μg/mL。
(3)CA50标准品及质控品:用50%马血清将CA50浓标准品稀释成标准溶液6瓶,0U/mL,10U/mL,20U/mL,40U/mL,80U/mL,140U/mL,0.5mL/瓶;质控品为2瓶,20U/mL、80U/mL,0.5mL/瓶;
(4)浓缩洗涤液:pH值为7.4,含有0.1-0.5%吐温-20,0.1%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。30mL/瓶,1瓶。使用时用蒸馏水稀释20倍;
(6)反应试管:所用的反应管材料为聚苯乙烯,铝膜真空封装,100支/包,1包。
其中,链霉亲和素包被磁性微粒子、生物素标记CA50单克隆抗体、125I标记的CA50单克隆抗体制备方法如下:
一、链霉亲和素包被磁性微粒子的制备
1、链霉亲和素包被磁性微粒子的制备原理:磁性微粒子是内核为Fe3O4、表面为包裹了带有活性基团氨基的聚合物,可采用直接包被法将链霉亲和素包被于聚合物表面。
2、链霉亲和素包被磁性微粒子的制备方法:将亲和素溶于50mmol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0),与磁性微粒子搅拌混合,4℃下放置15h后,用相同的缓冲液悬浮清洗三次,倒出上清后,用含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH为7.2,0.02mol/L的磷酸缓冲液于室温封闭3-4小时;最后用pH值为7.4、含0.5%BSA的0.02mol/LTris-HCl缓冲液清洗三次,并用该溶液配制成5-10mg/mL的工作液。磁性微粒子分离剂在4℃保存,不应冻存,用时轻轻摇匀。
二、亲和素标记的CA50单克隆抗体的制备
1、亲和素标记的CA50单克隆抗体的制备原理:以碳化酰二亚胺法制备生物素与单抗的偶联物,生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。
2、亲和素标记的CA50单克隆抗体的制备方法:
(1)用二甲基亚砜配制10mg/mL的N-羟琥珀酰亚胺生物素;
(2)用0.1mol/L、pH值为8.0的硼酸钠缓冲液稀释CA50抗体溶液至1~4mg/mL;
(3)按照每毫克抗体加入50-250μg的生物素酯,混匀后,室温搅拌4小时;
(4)按照每180μg生物素酯加入20uL的1mol/L NH4Cl终止反应,室温放置10min;
(5)以磷酸盐缓冲液充分透析除去游离生物素和盐类,标记的抗体在-4℃冻存。
三、125I标记的CA50单克隆抗体的制备方法同实施例1
利用该试剂盒检测样品中CA50含量的方法如下:
一、样品前处理
对人血清血浆:取空腹晨血样本,3000rpm离心5min,取上层液25μL进行分析。待测样品2-8℃存放不得超过48小时,若48小时未检测,应于-20℃以下保存,但不应超过30天。
二、检测方法
向试管中加入25μL血清样品或同体积的系列标准品溶液,再加入标记物混合液50μL,37℃水浴反应30min。加入磁性微粒子溶液50μL,室温放置5min后,将试管架置于磁分离器上分离2min,然后倒转分离器倒出上清液,将倒转的试管放在滤纸上,拍击分离器以除去挂壁液体。每管加入洗涤液300μL,用圆周运动使其充分混匀,置于磁分离器上分离5min,然后倒转分离器倒出上清液,将倒转的试管放在滤纸上,拍击分离器以除去挂壁液体,重复3次。取出试管,测各管放射性计数。
三、结果分析
放射性计数-剂量反应曲线以双对数曲线表示,即所获得的每个浓度标准溶液或样本放射性计数的平均值(B)减去第一个零标准点的放射性计数(B0),再取对数,即
纵轴(Y轴)=ln(B-B0)
以CA50浓度的对数值为横轴(X轴),绘制标准曲线,如图3所示。相应每一个样品中CA50浓度可以从标准曲线上读出。也可以用多参数回归方程法进行拟合,计算出样本溶液中CA50的浓度。本试剂盒提供的线性范围为0-140U/mL,检测限为3.5U/mL,整个检测过程只需1.5个小时即可完成,完全符合临床要求。
提示:在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (19)
1.一种用于检测肿瘤标志物CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括:
包被有二抗的磁性微粒子;
标记的CA50单克隆抗体及125I标记的CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;
CA50标准品溶液及质控品;
浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述包被磁性微粒子的二抗可以是驴抗鼠或兔抗鼠多克隆抗体、抗FITC多克隆或单克隆抗体、亲和素或链霉亲和素中的任一种。
3.根据权利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括包被有驴抗鼠或兔抗鼠抗抗体的磁性微粒子;抗CA50单克隆抗体及125I标记的抗CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液。
4.根据权利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括包被有亲和素或链霉亲和素的磁性微粒子;生物素标记的抗CA50单克隆抗体及125I标记的抗CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液。
5.根据权利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括包被有抗FITC抗体的磁性微粒子;FITC标记的抗CA50单克隆抗体及125I标记的抗CA50单克隆抗体混合而成的标记物液;CA50标准品溶液及质控品;浓缩洗涤液。
6.根据权利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述二抗的包被是通过戊二醛两步法将磁性微粒子与驴抗鼠或兔抗鼠多克隆抗体、或者抗FITC多克隆或单克隆抗体进行偶联;或者通过物理吸附法将亲和素或链霉亲和素进行包被。
7.根据权利要求6所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:包被时使用的封闭液为含有0.5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述包被有二抗的磁性微粒子为粒径为2-3μm、内核为四氧化三铁(Fe3O4)、表面包裹带有活性基团如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)的聚合物,其使用浓度为5-10mg/mL。
9.根据权利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述二抗为抗FITC多克隆或单克隆抗体,FITC分子与CA50单克隆抗体的偶联物是以碱性液标记法对抗体进行标记,FITC标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液,存放FITC标记抗体液的溶液为20%小牛血清。
10.根据权利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述二抗为亲和素或链霉亲和素,生物素的标记是以碳化酰二亚胺法制备生物素与CA50单克隆抗体的偶联物,生物素标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液,存放生物素标记抗体液的溶液为20%小牛血清。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述标记的单克隆抗体都是CA50特异性单克隆抗体。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述放射性核素标记抗体的标记物为125I,标记方法为氯胺T法。
13.根据权利要求2所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述混合标记物液选自体积比为1∶1-1∶3的下述溶液混合液:
(1)当包被二抗为驴抗鼠或兔抗鼠抗抗体时,以抗CA50单克隆抗体液与标记125I的抗CA50单克隆抗体液混合;
(2)当包被二抗为亲和素或链霉亲和素时,以标记生物素的抗CA50单克隆抗体液与标记125I的抗CA50单克隆抗体液混合;或
(3)当包被二抗为抗FITC抗体时,以标记FITC的抗CA50单克隆抗体液与标记125I的抗CA50单克隆抗体液混合,
所述标记物混合液溶剂成分为0.05%甘油、0.05%BSA、0.2g/L的硫柳汞。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述标准品溶液为5个浓度梯度CA50的溶液;所述配制标准品的基质为50%马血清。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述质控品及其含量是以正常人血清投入已知量的CA50标准品,并根据临床参考值以及剂量-反应曲线的工作范围而定。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:所述浓缩洗涤液为pH值为7.4,含有0.1-0.5%吐温-20,0.1%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。
17.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:还包括使用的反应管,其材料可为聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等,优选为聚苯乙烯。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒,其特征在于:待检物质为血清或血浆样品中的CA50。
19.一种应用根据权利要求1-18所述的任一种CA50二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测CA50的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)样品前处理:
对临床血清血浆,3000rpm离心5分钟,取上层液即可进行分析测定;
(2)利用权利要求1-18中任一所述的检测CA50的二抗包被磁性微粒子免疫放射分析试剂盒检测样品。
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Application publication date: 20081217 |