CN105503759A - 三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。本发明提供的半抗原，为式（Ⅰ）所示的化合物。本发明还保护式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物（该偶联物为免疫原或包被原）。本发明还保护一种用于检测三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒，包括包被有所述偶联物的化学发光微孔板（偶联物作为包被原）。所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。本发明提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推广应用。式（Ⅰ）。

Description

三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原、抗原及其制备方法，具体涉及一种三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。

背景技术

三聚氰胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，分子式C3N6H6，分子量126.12。

由于三聚氰胺的分子式中含氮量为66%左右，而蛋白质的平均含氮量为16%左右，因此，由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，俗称“蛋白精”。虽然，目前广泛认为三聚氰胺毒性比较低微，但长期摄入仍不容忽视。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。

2011年4月6日，国家五部委发表联合公告，制定我国三聚氰胺在食品中的限量值。公告规定：婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。这项标准与国际食品法典委员会发布的限量一致，而国际食品法典委员发布的标准被公认为食品领域的国际标准。

目前，饲料和食品中三聚氰胺残留的检测方法采用仪器分析法和免疫分析法。例如，酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）、气质联用法（GC-MS）和液质联用法（LC-MS/MS）等。由于三聚氰胺属于极强性化合物，在色谱柱上几乎无保留，在进行分析时一般都要在流动相中加入离子对试剂来改善分离条件，在色谱柱上获得稳定的保留；同时，由于测定的样品中一般含有大量蛋白质，因此在进行提取时要加入蛋白质沉淀剂来除去蛋白。HPLC法具有定量准确等优点，但在检测时前处理相对复杂，在实际应用中存在方法灵敏度低等缺点。对于三聚氰胺残留的确证已有报道的方法有GC-MS和LC-MS/MS。由于三聚氰胺相对分子质量小于150，在进行GC-MS分析时在该质量数附近常用的毛细管气象色谱柱柱流失产物的碎片离子很多，对质谱有严重干扰，因此需对三聚氰胺进行衍生化，降低背景化学噪音带来的影响，该方法可进行确证检测，且灵敏度高，但前处理过程复杂，需进行衍生化处理。由于LC-MS/MS法具有灵敏度高、选择性好、定性定量准确，抗干扰能力强等优点，因此最常作为三聚氰胺残留检测的标准法。但该方法也存在前处理过程复杂，耗时比较长、成本高等缺点。

免疫分析法是以抗原和抗体的特异性、可逆性结合为基础，对动物性食品中药物或有害化合物残留进行定量及半确证的方法。本发明的化学发光法与传统酶联免疫法相比，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、没有酶免疫物OPD或TMB的致癌作用等优点。检测时样品中的三聚氰胺将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入酶标二抗工作液和化学发光底物液后，用化学发光仪测量微孔的光子数，将未知样品的读数和标准品的读数比较，就能得到样品中的三聚氰胺的浓度。

发明内容

本发明的目的是提供一种三聚氰胺半抗原、抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。

本发明提供的三聚氰胺半抗原，为式Ⅰ所示的化合物；

式Ⅰ。

本发明还公开了式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

①2-氯-4,6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；

②130mg4-氨基苯甲酸钠溶于10ml0.1mol/L碳酸氢钠溶液后，缓慢加入上述溶液，混匀，70℃搅拌反应24h；

③0.1mol/L盐酸调pH为6，过滤，固体少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。

本发明提供的三聚氰胺抗原，是将式Ⅰ所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。

所述式Ⅰ所示化合物与BSA偶联得到的三聚氰胺抗原的结构见图1。

本发明还公开了所述三聚氰胺抗原制备的方法，包括如下步骤：

①40mg三聚氰胺半抗原溶于5mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴中加入三正丁胺38μl，搅拌反应10min，加入氯甲酸异丁酯22μl，室温反应1h；

②BSA100mg溶于10ml0.1mol/L碳酸钠溶液，将活化三聚氰胺半抗原溶液逐滴加入，室温搅拌过夜，PBS（pH7.4）4℃透析72h，期间换透析液6次；

③将透析产物在无菌条件下通过0.2μm的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

所述三聚氰胺抗原可以作为免疫原制备三聚氰胺特异性抗体，也可以作为包被原制备化学发光免疫微孔板。

应用三聚氰胺抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明还公开了应用三聚氰胺抗原和三聚氰胺特异性抗体制备得到的化学发光免疫试剂盒，包括包被有所述偶联物的化学发光微孔板（偶联物作为包被原）。所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。所述抗体具体可为兔源单克隆抗体。

所述“包被有所述偶联物的化学发光微孔板”的制备方法具体如下：（1）取所述偶联物，用包被缓冲液稀释（包被缓冲液具体可为pH9.6、0.03M的碳酸盐缓冲液），得到包被原稀释液（蛋白浓度具体可为2ng/mL）；（2）将包被原稀释液加入化学发光微孔板（具体可100μL/孔），孵育（具体可37℃孵育16小时），洗涤，拍干；（3）完成步骤（2）后，进行封闭（每孔可加入200μL封闭液，37℃温育2h；封闭液的具体配方：将10g牛血清白蛋白、0.1mLproclin300和1000mLpH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液），倾去孔内的液体，干燥。

本发明还保护所述试剂盒在检测待测样本中是否含有三聚氰胺中的应用。

本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分析物。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对三聚氰胺样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的三聚氰胺抗原，通过免疫动物可产生了针对三聚氰胺的特异性抗体，用于快速检测食品中的三聚氰胺残留，具有操作简单、快速，处理样品量大，灵敏度高，特异性强等诸多优点。

附图说明

图1为三聚氰胺半抗原质谱图。

图2为三聚氰胺半抗原核磁共振图。

图3为三聚氰胺化学发光免疫检测试剂盒标准曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、三聚氰胺半抗原的制备与鉴定

一、三聚氰胺半抗原的制备方法，具体操作步骤包括：

①2-氯-4,6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；

②130mg4-氨基苯甲酸钠溶于10ml0.1mol/L碳酸氢钠溶液后，缓慢加入上述溶液，混匀，70℃搅拌反应24h；

③0.1mol/L盐酸调pH为6，过滤，固体少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。

半抗原的结构式见式Ⅰ：

式Ⅰ。

二、三聚氰胺半抗原的鉴定

取上述目的产物经ESI质谱测定其结构，发现其分子离子峰为244.8（M-1),247(M+1)（见图1）；经1HNMR（CDCl3）鉴定，δ：7.58-7.69（D，2H），6.42-6.44（D，2H），5.11（S，2H），6.56（S，2H），6.29（S，1H）（见图2），说明三聚氰胺半抗原合成成功。

实施例2、三聚氰胺人工抗原的制备

三聚氰胺免疫抗原的合成

①40mg三聚氰胺半抗原溶于5mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴中加入三正丁胺38μl，搅拌反应10min，加入氯甲酸异丁酯22μl，室温反应1h；

②BSA100mg溶于10ml0.1mol/L碳酸钠溶液，将活化三聚氰胺半抗原溶液逐滴加入，室温搅拌过夜，PBS（pH7.4）4℃透析72h，期间换透析液6次；

③将透析产物在无菌条件下通过0.2μm的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

免疫原的结构式见式Ⅱ。

式Ⅱ。

用OVA代替BSA，同法合成三聚氰胺包被原。

包被原的结构式见式Ⅲ。

式Ⅲ。

实施例3、三聚氰胺特异性抗体制备

一、三聚氰胺多克隆抗体的制备

取实施例2制备的免疫原溶液，用pH7.4、0.01M的PBS缓冲液稀释，得到免疫原稀释液，用于多克隆抗体的制备。采用新西兰大白兔作为免疫动物。

免疫过程如下：

首次免疫：将免疫原稀释液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为2.5mg/只；

加强免疫：首次免疫4周后、8周后和12周后，各进行一次加强免疫，将免疫原稀释液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，颈背部皮下多点注射，单次免疫剂量为2.5mg/只；

末次免疫：首次免疫16周后进行末次免疫，直接颈背部皮下多点注射免疫原稀释液，免疫剂量为2.5mg/只。

末次免疫1周后，采血并分离血清，即为免疫原对应的多克隆抗体。

二、三聚氰胺单克隆抗体的制备

①取实施例2制备的免疫原溶液，按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

②按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

③细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被化学发光微孔板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的三聚氰胺等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的化学发光免疫微孔板中。同时用PBS取代三聚氰胺作对照，其余步骤同上。若经三聚氰胺阻断后的OD₄₅₀nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

④将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×10⁶/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

三、三聚氰胺抗体效价的测定

三聚氰胺标准品购自Sigma公司。

用方阵滴定法确定三聚氰胺包被抗原和制备的三聚氰胺特异性抗体的工作浓度，三聚氰胺包被抗原的工作浓度为2μg/L，多克隆抗体的工作浓度为1:5000，单克隆抗体的工作浓度为1:65000。

实施例4、检测三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒的组装

化学发光免疫检测试剂盒包括如下组件：

一、包被了包被原的化学发光微孔板

取实施例2制备的包被原溶液，用包被缓冲液稀释（包被缓冲液即pH9.6、0.03M的碳酸盐缓冲液），得到蛋白浓度为2ng/mL的包被原稀释液。将10g牛血清白蛋白、0.1mLproclin300和1000mLpH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液。

（1）将包被原稀释液加入微孔板（100μL/孔），37℃孵育16小时。

（2）完成步骤（1）后，倾去孔内的液体，洗涤，拍干。

（3）完成步骤（2）后，每孔加入200μL封闭液，37℃温育2h。

（4）完成步骤（3）后，倾去孔内的液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

二、抗体工作液

将实施例3制备的多克隆抗体用抗体稀释液稀释5000倍或将实施例3制备的单克隆抗体用抗体稀释液稀释65000倍，得到三聚氰胺抗体工作液。

抗体稀释液：取BSA10mg，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液溶解并定容至1000mL，得到抗体稀释液。

三、二抗工作液

辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.产品目录号为115-035-003。

将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗用步骤2中的抗体稀释液稀释至1000倍体积，得到二抗工作液。

四、标准品溶液

三聚氰胺标准溶液：将三聚氰胺溶于pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液，分别得到浓度为0.02μg/L、0.06μg/L、0.18μg/L、0.54μg/L和1.62μg/L的标准溶液。将pH7.4、0.05M的磷酸盐缓冲液作为标准溶液的阴性对照溶液，称为0溶液。

五、浓缩洗涤液

将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01MpH值为7.4；

六、发光底物液

发光液由A液和B液组成，A液和B液各一瓶，4mL/瓶。

A液的制备方法：取0.2g鲁米诺单钠盐、0.1g对碘苯酚、0.16g氯化钠和0.18gEDTA-Na₂，用pH8.4、0.1M的Tris-HCl缓冲液溶解并定容至1000mL。

B液：含0.3mMH₂O₂、5mMEDTA-Na₂的pH8.4、0.1M的Tris-HCl缓冲液。

实施例5、检测三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒使用方法

一、样品提取

量取10ml牛奶，加入20ml50%乙腈水溶液，超声波振荡萃取10min。加入1ml1M盐酸，振荡1min，4000g离心10min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，取50μl用于检测。

二、应用化学发光免疫试剂盒检测

向包被了包被原的微孔板中加入标准品溶液或待测样本溶液50μL，一抗工作液50μL和二抗工作液50μL，室温反应20min，弃上清，洗涤3次（每次洗涤过程均如下：每孔中加入250μL洗涤液，30秒后弃上清；将20×浓缩洗涤液用水稀释至20倍体积，即为洗涤液），用吸水纸拍干，每孔加入100μL新鲜配制发光底物液（A液和B液等体积混合），用化学发光仪（深圳天众达）检测每孔的光子数。设置五个复孔。每个浓度的标准品溶液的发光强度的平均值（B）除以0溶液的发光强度值（B₀），再乘以100%，即结合率。计算公式：结合率（%）=B/B₀×100%。以标准品溶液中的三聚氰胺浓度（ng/mL）的半对数值为X轴，B/B₀为Y轴，绘制标准曲线图（见图3）。根据标准曲线的回归方程可以求出待测样本溶液中三聚氰胺的浓度。本发明中检测结果的分析可以利用专业软件，可以实现大量样本的快速分析，整个检测过程只需30分钟就可以完成。结合率（B/B₀）为50%时对应的标准品溶液中的三聚氰胺浓度即为IC₅₀值。根据标准曲线图，IC50=0.060ng/mL。

试剂盒的检测原理：当在化学发光微孔板上预包被半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入待测样本溶液，随后加入一抗和酶标二抗，待测样本溶液中残留的三聚氰胺与化学发光板上包被的包被原竞争一抗，然后与酶标二抗的进一步结合，加入化学发光底物液，发光强度与待测样本溶液中三聚氰胺的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出待测样本溶液中三聚氰胺的残留量。

实施例6、三聚氰胺化学发光免疫试剂盒检测效果评价

一、试剂盒灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白样品进行检测，计算空白样品光子数的平均值，并将此平均值带入标准曲线得到对应的样品浓度，计算各对应浓度值的标准差（SD），由平均值加三倍标准差即为该样品的最低检测限（LOD），结果见表1。

表1试剂盒在牛奶中的最低检测限

样品	样品平均值（μg/L, n=20）	SD（n=20）	LOD（μg/L）
				牛奶	0.004	0.003	0.013

二、准确度和精密度试验

向不含三聚氰胺的牛奶样品中添加三聚氰胺标准品，使三聚氰胺标准品在样品中的终浓度分别为0.015、0.03、0.06μg/L；将添加后的样品分别按照所述方法进行前处理，得到检测样品溶液。

从3个不同批次的试剂盒中各抽取5个试剂盒进行检测，每个浓度设置5个平行，重复5次，计算批内批间变异系数。结果见表2。结果表明：牛奶样品的平均添加回收率在76.7~100.0%，说明试剂盒的准确度良好；批内变异系数在4.4~10.0%，批间变异系数在6.4~8.0%。批内批间变异系数均＜10%，说明试剂盒的精密性良好。

表2牛奶中三聚氰胺检测准确度和精密度试验结果

三、试剂盒保存期

试剂盒保存条件为2-8℃，保存6个月后，测定三聚氰胺的IC₅₀值。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行热加速实验。结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。

表3低温保存实验结果

时间（d）	0	10	20	30	60	90	120	150	180
										IC50(ng/mL)	0.052	0.066	0.055	0.057	0.073	0.060	0.077	0.063	0.057

表4热加速实验

时间（d）	1	2	3	4	5	6
							IC50(ng/mL)	0.060	0.058	0.073	0.067	0.080	0.075

四、交叉反应率试验

选择与三聚氰胺结构或功能相似的其他药物按照所述方法配制标准溶液，并绘制标准曲线，通过各种药物的标准曲线分别计算其50%抑制浓度。用下列公式计算试剂盒对其它类似物的交叉反应率。与其他药物的交叉反应率越小，说明三聚氰胺化学发光免疫检测试剂盒对三聚氰胺的检测特异性越好。结果见表5。

交叉反应率（%）=（三聚氰胺的IC₅₀值/待测药物的IC₅₀值）×100%

试验结果表明，本发明试剂盒对三聚氰酸的交叉反应率小于10%，对4,6-二氨基-2-羟基-1,3,5-三嗪、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、四环素、庆大霉素和氨苄青霉毒的交叉反应率均小于1%，所以该试剂盒对三聚氰胺的特异性好，即本发明试剂盒可以检测三聚氰胺。

表5三聚氰胺化学发光试剂盒交叉反应率

药物名称	交叉反应率（%）
		三聚氰胺	100.0
三聚氰酸	<10.0
		4,6-二氨基-2-羟基-1,3,5-三嗪	<0.5
三聚氰酸一酰胺	<0.01
		三聚氰酸二酰胺	<0.01
四环素	<0.01
		庆大霉素	<0.01
氨苄青霉素	<0.01

Claims (10)

1.一种三聚氰胺半抗原，为式Ⅰ所示化合物：

式Ⅰ。

2.式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

2-氯-4,6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；

130mg4-氨基苯甲酸钠溶于10ml0.1mol/L碳酸氢钠溶液后，缓慢加入上述溶液，混匀，70℃搅拌反应24h；0.1mol/L盐酸调pH为6，过滤，固体少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。

3.一种三聚氰胺抗原，是将式Ⅰ所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

4.根据权利要求3所述三聚氰胺抗原，其特征在于，所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白。

5.权利要求3或4所述的三聚氰胺抗原的制备方法，包括如下步骤：

40mg三聚氰胺半抗原溶于5mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴中加入三正丁胺38μl，搅拌反应10min，加入氯甲酸异丁酯22μl，室温反应1h；

BSA100mg溶于10ml0.1mol/L碳酸钠溶液，将活化三聚氰胺半抗原溶液逐滴加入，室温搅拌过夜，PBS（pH7.4）4℃透析72h，期间换透析液6次；

将透析产物在无菌条件下通过0.2μm的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。

6.权利要求3或4所述三聚氰胺抗原在制备三聚氰胺特异性抗体中的应用。

7.应用权利要求3或4所述三聚氰胺抗原制备得到的量子点标记的特异性抗体。

8.权利要求3或4所述三聚氰胺抗原、权利要求7所述特异性抗体在检测三聚氰胺中的应用。

9.应用权利要求3或4所述三聚氰胺抗原、权利要求7所述特异性抗体制备得到的化学发光酶联免疫检测试剂盒。

10.权利要求9所述化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，它包括：包被有三聚氰胺抗原的化学发光微孔板、酶标抗体工作液、三聚氰胺标准溶液、发光底物液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。