CN1380550A - 用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒及其测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒及其测定方法,试剂盒装有下列各种试剂:抗鸟氨酸脱羧酶抗体包被的预包被板;生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体;辣根过氧化物酶标记的亲和素;鸟氨酸脱羧酶标准品;样品稀释液;洗涤液;显色剂A、B;终止液。它利用标记免疫测定技术通过对鸟氨酸脱羧酶抗原含量的测定来间接反映鸟氨酸脱羧酶的活性,它解决了现有技术通过检测14CO2或腐胺的量来反映鸟氨酸脱羧酶的活性而存在的操作复杂、费时费力、有放射性污染、灵敏度较低的缺点。
Description
技术领域
本发明涉及测定鸟氨酸脱羧酶技术领域。
背景技术
鸟氨酸脱羧酶广泛存在于动物体内，是细胞增殖的标志酶，实验证明，在许多肿瘤组织中，该酶的活性明显升高。据有关医学界统计：食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌组织中鸟氨酸脱羧酶活性明显升高。目前，医学界已把鸟氨酸脱羧酶看作一种肿瘤标志物，因此对其活性测定尤为重要。传统对鸟氨酸脱羧酶的测定方法是：一、标本采集后立即置于PH7.2的含同位素标记的DL-1-[14C]左旋鸟氨酸的缓冲液中，然后储存于低温环境下，使鸟氨酸脱羧酶与同位素充分混合吸收，鸟氨酸脱羧酶将与标记的L-鸟氨酸结合，释放出14CO2，最终通过检测14C1O2的量来反映鸟氨酸脱羧酶的活性。该方法存在操作复杂、费时费力的缺点，并且存在放射性污染因素，临床上应用难度很大。二、分光光度法是将标本与含鸟氨酸的缓冲液在37℃条件下，作用30分钟，使鸟氨酸脱羧生成腐胺，最终通过检测腐胺的含量来反映鸟氨酸脱羧酶的活性。该方法存在操作复杂、灵敏度较低的缺点。
发明内容
本发明提供了一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒及其测定方法，它利用标记免疫测定技术通过对鸟氨酸脱羧酶抗原含量的测定来间接反映鸟氨酸脱羧酶的活性，它解决了现有技术通过检测14CO2或腐胺的量来反映鸟氨酸脱羧酶的活性而存在的操作复杂、费时费力、有放射性污染、灵敏度较低的缺点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
A.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体包被的预包被板；
(2)生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(3)辣根过氧化物酶标记的亲和素；
(4)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(5)样品稀释液；
(6)洗涤液；
(7)显色剂A、B；
(8)终止液。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，对于组织提取液、血浆、血清中鸟氨酸脱羧酶的测定，取抗鸟氨酸脱羧酶抗体，用PH9.6碳酸盐缓冲液配制10-100ug/ml于微孔板微孔内，每孔加100ul，37℃1-2小时或2-8℃过夜，洗板5次后，常规封闭，干燥；取组织提取液或血清或血浆50ul加入各孔中，每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体50ul，同时做5个浓度的标准孔和阴性对照孔；置37℃1小时，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得。
B.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的亲和素；
(3)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(4)洗涤液；
(5)显色剂A、B；
(6)终止液。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，对于细胞中鸟氨酸脱羧酶的测定，先将细胞计数并调至一定数量后，分配于微孔培养板中，然后置5％CO2培养箱中培养18-24小时，待细胞贴壁(不贴壁生长的细胞需离心)后，洗涤3次，常规固定，封闭，然后每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体100ul，37℃1-3小时后，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得。
C.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的亲和素；
(3)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(4)洗涤液；
(5)显色剂A、B；
(6)终止液。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，其特征在于：对于细胞中鸟氨酸脱羧酶的测定，先将细胞计数并调至一定数量后，分配于微孔培养板中，加入不同浓度的药物，然后置5％CO2培养箱中培养18-24小时，待细胞贴壁(不贴壁生长的细胞需离心)后，洗涤3次，常规固定，封闭，然后每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体100ul，37℃1-3小时后，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得；或根据各孔OD值，直接判定试验细胞的药敏结果。
D.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)荧光标记的二抗；
(3)洗涤液。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，对于组织切片或细胞涂片中鸟氨酸脱羧酶的测定，将组织切片或细胞涂片常规固定后，用5％脱脂奶粉封闭，然后加抗鸟氨酸脱羧酶抗体，37℃1-2小时或2-8℃过夜，洗板后，加荧光标记的二抗，37℃1小时，洗板后，于荧光显微镜下检测结果。
E.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体包被的预包被板；
(2)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(3)辣根过氧化物酶标记的二抗；
(4)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(5)样品稀释液；
(6)洗涤液；
(7)显色剂A、B；
(8)终止液。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，对于组织提取液、血浆、血清中鸟氨酸脱羧酶的测定，取抗鸟氨酸脱羧酶抗体，用PH9.6碳酸盐缓冲液配制10-100ug/ml于微孔板微孔内，每孔加100ul，37℃1-2小时或2-8℃过夜，洗板5次后，常规封闭，干燥；取组织提取液或血清或血浆50ul加入各孔中，每孔加抗鸟氨酸脱羧酶抗体50ul，同时做5个浓度的标准孔和阴性对照孔；置37℃1小时，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的二抗100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得。
F.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的二抗；
(3)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(4)洗涤液；
(5)显色剂A、B；
(6)终止液。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，对于细胞中鸟氨酸脱羧酶的测定，先将细胞计数并调至一定数量后，分配于微孔培养板中，然后置5％CO2培养箱中培养18-24小时，待细胞贴壁(不贴壁生长的细胞需离心)后，洗涤3次，常规固定，封闭，然后每孔加抗鸟氨酸脱羧酶抗体100ul，37℃1-3小时后，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的二抗100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得。
G.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的二抗；
(3)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(4)洗涤液；
(5)显色剂A、B；
(6)终止液。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，对于细胞中鸟氨酸脱羧酶的测定，先将细胞计数并调至一定数量后，分配于微孔培养板中，加入不同浓度的药物，然后置5％CO2培养箱中培养18-24小时，待细胞贴壁(不贴壁生长的细胞需离心)后，洗涤3次，常规固定，封闭，然后每孔加抗鸟氨酸脱羧酶抗体100ul，37℃1-3小时后，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的二抗100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得；或根据各孔OD值，直接判定试验细胞的药敏结果。
H.一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的二抗；
(3)洗涤液；
(4)显色剂。
一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，对于组织切片或细胞涂片中鸟氨酸脱羧酶的测定，将组织切片或细胞涂片常规固定后，用5％脱脂奶粉封闭，然后加抗鸟氨酸脱羧酶抗体，37℃1-2小时或2-8℃过夜，洗板后，加辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃1小时，洗板后，加显色剂显色，于显微镜下检测结果。
本发明能够产生的有益效果：因本发明一改传统的通过检测14CO2或腐胺的量来反映鸟氨酸脱羧酶的活性而存在的操作复杂、费时费力、有放射性污染、灵敏度较低的缺点，它运用了标记免疫技术，并提供了相应的试剂盒，使用该试剂盒测定标本中鸟氨酸脱羧酶的量，它操作简便、省时省力，无任何污染、灵敏度较高。
具体实施方式
实施例1
检测组织提取液、血浆、血清中或其他组织液中的鸟氨酸脱羧酶。取需要用量已包被有抗鸟氨酸脱羧酶抗体的微孔板条，加组织提取液50ul，同时做标准品0，10，20，40，100ng/ml及阴性对照品，每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体50ul，置37℃温育1小时，洗涤5遍，每孔加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素100ul，37℃温育40分钟，洗涤，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10-15分钟后，每孔加终止液50ul，于酶标仪450nm处进行检测。以各标准孔的OD值与对应浓度绘制标准曲线，根据样品孔的OD值从标准曲线中查其相应浓度。
实施例2
细胞中的鸟氨酸脱羧酶测定(药敏试验)。取病人静脉血4ml，肝素防凝，用淋巴细胞分离液，常规分离淋巴细胞，然后计数并调节细胞数至107/ml，每孔100ul，同时含有2ug/mlPHA及不同浓度的抗癌药物如：环磷酰胺0，10-3，10-7，10-9，长春新碱0，10-5，10-7，10-9，同时做对照孔，置5％CO2培养箱中37℃培养18-24小时，离心，洗涤3次，然后常规固定、封闭后，每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体100ul，37℃1-3小时，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul，37℃30-60分钟，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃10-15分钟，酶标仪450nm测OD值，根据OD值的大小即可判断被测病人对何种药物、何浓度敏感。
Claims (10)
1、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，其特征在于：试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体包被的预包被板；
(2)生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(3)辣根过氧化物酶标记的亲和素；
(4)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(5)样品稀释液；
(6)洗涤液；
(7)显色剂A、B；
(8)终止液。
2、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，其特征在于：试剂盒装有下列各种试剂：
(1)生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的亲和素；
(3)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(4)洗涤液；
(5)显色剂A、B；
(6)终止液。
3、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，其特征在于：试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)荧光标记的二抗；
(3)洗涤液。
4、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，其特征在于：对于组织提取液、血浆、血清中鸟氨酸脱羧酶的测定，取抗鸟氨酸脱羧酶抗体，用PH9.6碳酸盐缓冲液配制10-100ug/ml于微孔板微孔内，每孔加100ul，37℃1-2小时或2-8℃过夜，洗板5次后，常规封闭，干燥；取组织提取液或血清或血浆50ul加入各孔中，每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体50ul，同时做5个浓度的标准孔和阴性对照孔；置37℃1小时，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得。
5、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，其特征在于：对于细胞中鸟氨酸脱羧酶的测定，先将细胞计数并调至一定数量后，分配于微孔培养板中，然后置5％CO2培养箱中培养18-24小时，待细胞贴壁(不贴壁生长的细胞需离心)后，洗涤3次，常规固定，封闭，然后每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体100ul，37℃1-3小时后，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得。
6、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，其特征在于：对于组织切片或细胞涂片中鸟氨酸脱羧酶的测定，将组织切片或细胞涂片常规固定后，用5％脱脂奶粉封闭，然后加抗鸟氨酸脱羧酶抗体，37℃1-2小时或2-8℃过夜，洗板后，加荧光标记的二抗，37℃1小时，洗板后，于荧光显微镜下检测结果。
7、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的方法，其特征在于：对于细胞中鸟氨酸脱羧酶的测定，先将细胞计数并调至一定数量后，分配于微孔培养板中，加入不同浓度的药物，然后置5％CO2培养箱中培养18-24小时，待细胞贴壁(不贴壁生长的细胞需离心)后，洗涤3次，常规固定，封闭，然后每孔加生物素标记的抗鸟氨酸脱羧酶抗体100ul，37℃1-3小时后，洗涤5次，每孔加辣根过氧化物酶标记的亲和素100ul，37℃1小时，洗涤5次，每孔加显色剂A、B各50ul，37℃避光10分钟，于酶标仪450nm处测各孔OD值；同时作标准品，以各标准孔浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线，待测样品的鸟氨酸脱羧酶含量即可根据其OD值从标准曲线上查得；或根据各孔OD值，直接判定试验细胞的药敏结果。
8、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，其特征在于：试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体包被的预包被板；
(2)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(3)辣根过氧化物酶标记的二抗；
(4)鸟氨酸脱羧酶标准品；
(5)样品稀释液；
(6)洗涤液；
(7)显色剂A、B；
(8)终止液。
9、一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，其特征在于：试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的二抗；
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(4)洗涤液；
(5)显色剂A、B；
(6)终止液。
10一种运用标记免疫技术测定鸟氨酸脱羧酶的试剂盒，它有试剂盒，其特征在于：试剂盒装有下列各种试剂：
(1)抗鸟氨酸脱羧酶抗体；
(2)辣根过氧化物酶标记的二抗；
(3)洗涤液；
(4)显色剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |