CN109490530A - 一种抗精子抗体检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种抗精子抗体检测方法，包括：步骤一：血清提取及试剂准备；步骤二：准备包被孔与未包被孔，将步骤一准备的试剂中的稀释后的标准品、质控物及已稀释血清至包被孔与被包被孔中，水溶下进行第一次温育；步骤三：根据所述步骤二中温育后的溶液孵育后，清洗并干燥微孔条，在所述微孔条每孔中加入稀释后酶标记抗体100u1，水浴进行第二次温育；步骤四：清洗并干燥微孔条，每孔中加入底物液100u1，避光室温显色10－15分钟；步骤五：每孔中加入终止液50u1，在酶标仪波长450nm比色读消光系数；步骤六：结果读取为0‑75U/ml判读为正常；操作简单便利并且灵活、降低检测成本，减少步骤流程，提高劳动效率，流程科学，标准明确，实践操作效果好。

Description

一种抗精子抗体检测方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体是指一种抗精子抗体检测方法。
背景技术
抗精子抗体既可在女性也可在男性体内产生。男性产生AsAb的主要机制是血屏障因疾病或创伤受损，使隐藏的精子或其可溶性膜抗原逸出，刺激机体免疫系统产生抗精子自身免疫抗体，简称AsAb。AsAb可抑制精子活动或受精，引起男性不育。女性产生AsAb的主要机制是正常生殖道中能降解精子抗原的酶系统缺陷，致使进入的精子抗原得以保存完整，而作为同种异体抗原剩激女性免疫系统则产生AsAb，影响生育。
人类精子抗原十分复杂，包括附着于精子表面的“精子附着抗原”和精子核抗原、胞质抗原、膜固有抗原等，共100余种，其中有些是精子特有的，有些是非特异性的有些与生育有关，有些无关。这些抗原均能引发机体产生相关抗体，抗精子抗体按其对精子的作用分为凝集性、制动性和结合性3类。
通常不育症患者血清中AsAb检出率为20％－30％左右，而在梗阻性无精患者中，AsAb患者，AsAb阳性率可高达60％。不孕患者血清与精浆中AsAb的1g种类有所不同，血清中通常以IgM、IgG类为主；而精浆中则以1gG、IgA类出现较多。
AsAb阳性也可见于其它原因，如输精管阻塞以及睾丸和附睾的损伤和炎症。鉴于AsAb的异质性以及其中很多AsAb针对的靶抗原与生育并不相关，因此，AsAb的阳性结果必须结合临床综合考虑。
因此，如何研发一种抗精子抗体检测方法，能够解决上述问题，便成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本申请解决的主要问题是提供一种抗精子抗体检测方法，操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好，以解决一种抗精子抗体检测方法成本高、流程不科学，标准不明确，实践操作效果不佳、操作难度高、难以复制操作的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种抗精子抗体检测方法，其特征在于，包括：
步骤一：血清提取及试剂准备；
步骤二：准备包被孔与未包被孔，将步骤一准备的试剂中的稀释后的标准品、质控物及已稀释血清至包被孔与被包被孔中，水溶下进行第一次温育；
步骤三：根据所述步骤二中温育后的溶液孵育后，清洗并干燥微孔条，在所述微孔条每孔中加入稀释后酶标记抗体100u1，水浴进行第二次温育；
步骤四：清洗并干燥微孔条，每孔中加入底物液100u1，避光室温显色10－15分钟；
步骤五：每孔中加入终止液50u1，在酶标仪波长450nm比色读消光系数；
步骤六：结果读取为0-75U/ml判读为正常。
进一步的，所述步骤三和步骤四中的清洗并干燥微孔条包括：将微孔条在滤纸上轻轻拍打以除去微孔中的残液.采用挤压式清洗瓶，则让每个微孔充满清洗液，然后弃去清洗液.在清洗过程中应避免气泡的产生.重复清洗操作两次以上，最后在滤纸上拍干微孔条。
进一步的，还包括质控步骤：
每次实验均要进行高低浓度质控，并绘制质控图；
每块板均带阴阳性质控品，质控品位置可随机放置在ELISA板中，也可放置在板的前面、中间、后面，阴性质控品为之前检测结果小于75U/ml的病人样本，阳性质控品为试剂盒内自带的质控品。
每批次质控结果录入URT，阳性质控使用westgard多规则中的1－3S和2－2S规则，阴性质控只需为阴性即可，若在控，则当批次实验结果有效；若失控，则需分析失控原因并按失控类型对当批次实验结果进行复查，并填写室内质控失控报告。
进一步的，所述标准品稀释方式为倍比稀释。
进一步的，所述底物液为TMB底物液。
进一步的，所述酶标记抗体包括过氧化酶标记的抗人免疫球蛋白，抗人免疫球蛋白包括IgA、IgG和IgM。
本申请提供的抗精子抗体检测方法操作简单便利并且灵活、降低检测成本，减少步骤流程，提高劳动效率，流程科学，标准明确，实践操作效果好。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例一：
取患者坐位静脉血，血清或血浆1ml，标本应无溶血，无脂血，无微生物污染；对溶血++++，黄疸++++，脂血++++的标本拒收，标本的采集应使用清洁无菌的一次性干燥管，标本用量最少100ul，血清和血浆样本在2-8℃保存，保存10天，若室温保存，可存放1天，若长期保存，需置一20℃保存、同时避免反复冻融血清。
试剂应在2－8℃保存，未用的包被板应放置防潮剂密封保存。已开封的包被板可在2－8℃稳定6周。
已稀释的洗涤液在温室可保存1天，要求现配先用，2－8℃可保存4周。
浓缩酶可保存到试剂有效期，但稀释后酶仅能在常温中稳定20分钟。
复融后稀释液在2－8℃可保存2天，－20℃可保存2个月。
试剂盒包括：(1)反应板；(2)600倍稀释后使用的浓缩液1瓶；(3)标准品S53瓶；(4)质控K3瓶；(5)稀释液3瓶；(6)20倍稀释后使用的浓缩洗液(7)底物液1瓶；(8)终止液1瓶。
操作步骤包括：
将试剂从冰箱中取出并平衡至室温约30min.将浓缩洗涤液用蒸馏水按所需量以要求比例进行稀释待用。
所用试剂使用前应充分混匀：不同的试剂瓶盖、不同批号的试剂不能混用。
洗涤液：25m1浓缩洗涤液+去离子水475m1，2－8℃保存4周。
稀释液：每瓶冻干稀释液粉末+20m1释后洗涤液，2－8℃保存2天。
标准品：标准品稀释为一个倍比稀释过程。
质控物：1瓶质控物冻干粉末+1m1稀释后洗涤液溶解。
联物稀释：用溶解后样本稀释液将浓缩酶联物按1：601倍稀释，需加酶前20分钟以内配制。
样本稀释：待检血清5u1+稀释液500u1。
根据需要准备包被孔与未包被孔、各标准品、质控物、病人样本都应做包被与未包被孔，将未用的包被条立即密封放回2－8℃；
分别加100u1标准品、质控物及已稀释血清至包被孔与被包被孔中，37℃水溶下温育60分钟。
解育后，将微孔条在滤纸上轻轻拍打以除去微孔中的残液。采用挤压式清洗瓶，则让每个微孔充满清洗液，然后弃去清洗液.在清洗过程中应避免气泡的产生.重复清洗操作两次以上，最后在滤纸上拍干微孔条。
每孔中加入稀释后酶标记抗体100u1，37℃水浴温育60分钟；
洗板，将微孔条在滤纸上轻轻拍打以除去微孔中的残液。采用挤压式清洗瓶，则让每个微孔充满清洗液，然后弃去清洗液.在清洗过程中应避免气泡的产生.重复清洗操作两次以上，最后在滤纸上拍干微孔条。
每孔中加入底物液100u1，避光室温显色10－15分钟。
每孔中加入终止液50u，在酶标仪波长450nm，参考波长600nm－650n比色读消光系数。
还包括质控步骤：
每次实验均要进行高低浓度质控，并绘制质控图；
每块板均带阴阳性质控品，质控品位置可随机放置在ELISA板中，也可放置在板的前面、中间、后面，阴性质控品为之前检测结果小于75U/ml的病人样本，阳性质控品为试剂盒内自带的质控品。
每批次质控结果录入URT，阳性质控使用westgard多规则中的1－3S和2－2S规则，阴性质控只需为阴性即可，若在控，则当批次实验结果有效；若失控，则需分析失控原因并按失控类型对当批次实验结果进行复查，并填写室内质控失控报告。
所述标准品稀释方式为倍比稀释。
所述底物液为TMB底物液。
所述酶标记抗体包括过氧化酶标记的抗人免疫球蛋白，抗人免疫球蛋白包括IgA、IgG和IgM。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种抗精子抗体检测方法，其特征在于，包括：
步骤一：血清提取及试剂准备；
步骤二：准备包被孔与未包被孔，将步骤一准备的试剂中的稀释后的标准品、质控物及已稀释血清至包被孔与被包被孔中，水溶下进行第一次温育；
步骤三：根据所述步骤二中温育后的溶液孵育后，清洗并干燥微孔条，在所述微孔条每孔中加入稀释后酶标记抗体100u1，水浴进行第二次温育；
步骤四：清洗并干燥微孔条，每孔中加入底物液100u1，避光室温显色10－15分钟；
步骤五：每孔中加入终止液50u1，在酶标仪波长450nm比色读消光系数；
步骤六：结果读取为0-75U/ml判读为正常。
2.根据权利要求1所述的抗精子抗体检测方法，其特征在于，所述步骤三和步骤四中的清洗并干燥微孔条包括：将微孔条在滤纸上轻轻拍打以除去微孔中的残液.采用挤压式清洗瓶，则让每个微孔充满清洗液，然后弃去清洗液.在清洗过程中应避免气泡的产生.重复清洗操作两次以上，最后在滤纸上拍干微孔条。
3.根据权利要求2所述的抗精子抗体检测方法，其特征在于，还包括质控步骤：
每次实验均要进行高低浓度质控，并绘制质控图；
每块板均带阴阳性质控品，质控品位置可随机放置在ELISA板中，也可放置在板的前面、中间、后面，阴性质控品为之前检测结果小于75U/ml的病人样本，阳性质控品为试剂盒内自带的质控品。
每批次质控结果录入URT，阳性质控使用westgard多规则中的1－3S和2－2S规则，阴性质控只需为阴性即可，若在控，则当批次实验结果有效；若失控，则需分析失控原因并按失控类型对当批次实验结果进行复查，并填写室内质控失控报告。
4.根据权利要求3所述的抗精子抗体检测方法，其特征在于，所述标准品稀释方式为倍比稀释。
5.根据权利要求4所述的抗精子抗体检测方法，其特征在于，所述底物液为TMB底物液。
6.根据权利要求5所述的抗精子抗体检测方法，其特征在于，所述酶标记抗体包括过氧化酶标记的抗人免疫球蛋白，抗人免疫球蛋白包括IgA、IgG和IgM。
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