CN103323588A - 一种犬狂犬病毒抗体的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明旨在提供一种检测犬狂犬病毒抗体（IgG）的方法及检测试剂盒。该试剂盒由包被板和试剂反应体系两部分组成，包括狂犬病毒抗原包被反应板、标准品、阳性对照血清、阴性对照血清、洗液（20×）、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。其特征是采用酶联免疫法技术通过测定试剂盒的标准品，以此确定犬狂犬病毒抗体（IgG）含量达到保护水平所对应的吸光度，通过对待检样品吸光度与标准品吸光度进行比较，从而判读出待检样品中所含的狂犬病毒抗体(IgG)量是否达到免疫保护水平。本发明能同时对大量样品进行检测且检测结果与中和法实验的结果高度一致，具有很高的准确度，适用于免疫接种效果的监控、个体免疫状态的确定，可用于动物疫病的调查。
Description
技术领域
本发明涉及一种犬狂犬病毒抗体（IgG）的检测方法，尤其是提供了一种犬狂犬病毒抗体（IgG）检测试剂盒，可用于免疫接种效果的监控、个体免疫状态的确定，属于动物疫病检测领域。
背景技术
狂犬病( rab ies) 又称恐水症( hydrophobia )，为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病，该病常见于狗、狼、猫等食肉动物，而人类多因被病兽咬伤而感染，一旦发病，死亡率几乎100%。卫生部最新公布的全国法定报告传染病疫情，狂犬病仍居传染病报告死亡数首位。而近年因养狗逐渐增多，发病率有上升的趋势，因此对狗进行狂犬病毒抗体（IgG）的检测对于动物疫病的调查以及免疫接种效果的监控、个体免疫状态的确定都具有非常重大的意义。目前市场有类似相关的犬狂犬病毒抗体的检测试剂盒，但是多为只能判断阴阳性，对于阳性样品是否具备个体免疫保护水平没有进行相关判读。
申请号为201010257527的中国专利的犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒只有阴性对照血清和阳性对照血清，缺乏对于是否具有保护水平的标准品。申请号为201010257264的中国专利用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒是对人体血清或血浆中是否具有抗体的一种检测，不能用于犬血清或血浆。申请号为201010197930的中国专利公开一种用于检测犬、猫的狂犬病毒抗体的胶体金试纸卡及其制备方法和应用，该方法是采用胶体金法进行检测的，灵敏度和准确度不及酶联免疫法。
本试剂盒通过中和法试验，并且用世卫标准品进行标定，确定了具有免疫保护水平的标准点，能够对阳性样品是否需要进行进一步的免疫提供依据。
发明内容
本发明旨在提供一种快速、大批量检测犬狂犬病毒抗体（IgG）的试剂盒。犬狂犬病毒抗体（IgG）检测试剂盒的检测方法是采用酶联免疫法技术通过测定试剂盒的标准品，以此确定犬狂犬病毒抗体（IgG）含量达到保护水平所对应的吸光度，通过对待检样品吸光度与标准品吸光度进行比较，从而判读出待检样品中所含的狂犬病毒抗体(IgG)量是否达到免疫保护水平。
试剂盒检测犬狂犬病毒抗体（IgG）的具体操作步骤如下：
（1）编号：每次试验应在包被板上设空白对照孔1孔，标准孔3孔，阴性对照孔1孔，阳性对照孔1孔，其余为待检样品孔。
（2）加样品稀释液：用加样器在包被板的标准孔与待检样品孔加入样品稀释液，每孔100ul；空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔不加样品稀释液。
（3）加样：分别于标准孔加入标准品10ul，各待检样品孔加入待检样品10ul，阴性对照孔加入阴性对照血清100ul，阳性对照孔加入阳性对照血清100ul；空白对照孔不加样。
（4）温育（一）：充分混匀，贴上封板膜，37±2℃温育60分钟
（5）洗板（一）：洗板机洗或手洗5次。
（6）加酶标结合物：除空白对照孔以外，各孔中加入酶标结合物100ul。
（7）温育（二）：贴上封板膜，37±2℃温育30分钟。
（8）洗板（二）：方法同洗板（一）。
（9）加显色剂：每孔加入显色剂A 50ul，全部加完后再在每孔中加入显色剂B 50ul，混匀。
（10）温育（三）：37±2℃显色10分钟。(显色10分钟指从开始加显色剂B 到开始加终止液的间隔时间。)
（11）终止：显色完毕后立即于每孔加50ul终止液， 混匀。
（12） 测定： 终止后应在10分钟内完成判读。对空白对照调零，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值。或使用双波长测定吸光值，测定波长为450nm，参考波长可选630nm或655nm。
（13）结果判定：若待测样品的OD值≥标准品OD值，结果判阳性且具备免疫保护水平；若待测样品的OD值＜标准品OD值，结果为样品不具备免疫保护水平，个体需进行进一步的免疫。
犬狂犬病毒抗体（IgG）检测试剂盒由包被板和试剂反应体系两部分组成，包括狂犬病毒抗原包被反应板、标准品、阳性对照血清、阴性对照血清、洗液（20×）、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。
（1）狂犬病毒抗原包被反应板：包被量为狂犬病毒抗原100ul/孔，抗原浓度为1mg/mL，规格96孔/块；
（2）标准品：狂犬抗体标准品，效价为0.5IU/mL，规格0.5mL/瓶；
（3）阳性对照血清：犬阳性血清1mL，0.01mol/L PBS（pH7.2）100mL，规格1mL/瓶；
（4）阴性对照血清：犬阴性血清1mL，0.01mol/L PBS（pH7.2）100mL，规格1mL/瓶；
（5）洗液（20×）：每1000ml含磷酸二氢钾4g，十二水磷酸氢二钠58g，氯化钠160g，吐温-20 10mL，Proclin 300 0.5Ml，规格50mL/瓶；
（6）样品稀释液：每1000mL含磷酸二氢钠1.28g，磷酸氢二钠0.41g，氯化钠20.09g，吐温-20 1mL，新生牛血清50mL，指示剂0.2g，曲拉通X-100 1mL，Proclin 300 0.5mL，规格10mL/瓶；
（7）酶标结合物：每1000mL含Tris2.42g，酶稳定剂0.8g，新生牛血清100mL，曲拉通X-100 1.5mL，氯化钠8.5g，Proclin 300 0.5mL，红染料2g，盐酸1.65mL， HRP-抗狗IgG抗体0.1mL，规格10mL/瓶；
（8）显色剂A：每1000mL含柠檬酸2.10g，结晶乙酸钠12.25g，过氧化脲0.6g，规格5mL/瓶；
（9）显色剂B：每1000mL含柠檬酸2.10g，EDTA0.3g，TMB-HCl0.6g，规格5mL/瓶；
（10）终止液：浓硫酸108.5mL溶于纯化水中，定容至1000ml，规格5mL/瓶。
本发明采用酶联免疫法技术通过测定试剂盒的标准品，以此确定犬狂犬病毒抗体（IgG）含量达到保护水平所对应的吸光度，通过对待检样品吸光度与标准品吸光度进行比较，从而判读出待检样品中所含的狂犬病毒抗体(IgG)量是否达到免疫保护水平。
本发明能同时对大量样品进行检测且检测结果与中和法实验的结果高度一致，具有很高的准确度，适用于免疫接种效果的监控、个体免疫状态的确定，可用于动物疫病的调查。
具体实施方式
实施例1
犬狂犬病毒抗体（IgG）检测试剂盒由包被板和试剂反应体系两部分组成，包括狂犬病毒抗原包被反应板、标准品、阳性对照血清、阴性对照血清、洗液（20×）、样品稀释液、酶标结合物、显色剂A、显色剂B和终止液。
（1）狂犬病毒抗原包被反应板：包被量为狂犬病毒抗原100ul/孔，抗原浓度为1mg/mL，规格96孔/块；
（2）标准品：狂犬抗体标准品，效价为0.5IU/mL，规格0.5mL/瓶；
（3）阳性对照血清：犬阳性血清1mL，0.01mol/L PBS（pH7.2）100mL，规格1mL/瓶；
（4）阴性对照血清：犬阴性血清1mL，0.01mol/L PBS（pH7.2）100mL，规格1mL/瓶；
（5）洗液（20×）：每1000ml含磷酸二氢钾4g，十二水磷酸氢二钠58g，氯化钠160g，吐温-20 10mL，Proclin 300 0.5Ml，规格50mL/瓶；
（6）样品稀释液：每1000mL含磷酸二氢钠1.28g，磷酸氢二钠0.41g，氯化钠20.09g，吐温-20 1mL，新生牛血清50mL，指示剂0.2g，曲拉通X-100 1mL，Proclin 300 0.5mL，规格10mL/瓶；
（7）酶标结合物：每1000mL含Tris2.42g，酶稳定剂0.8g，新生牛血清100mL，曲拉通X-100 1.5mL，氯化钠8.5g，Proclin 300 0.5mL，红染料2g，盐酸1.65mL， HRP-抗狗IgG抗体0.1mL，规格10mL/瓶；
（8）显色剂A：每1000mL含柠檬酸2.10g，结晶乙酸钠12.25g，过氧化脲0.6g，规格5mL/瓶；
（9）显色剂B：每1000mL含柠檬酸2.10g，EDTA0.3g，TMB-HCl0.6g，规格5mL/瓶；
（10）终止液：浓硫酸108.5mL溶于纯化水中，定容至1000ml，规格5mL/瓶。
实施例2
犬狂犬病毒抗体（IgG）检测试剂盒对218份狗血清进行检测，同时采用中和法进行对比实验。
1.检测方法
（1）编号：在包被板上设空白对照孔1孔；标准孔3孔；阴性对照孔1孔；阳性对照孔1孔；其余为待检样品孔，编号1-218。
（2）加样品稀释液：用加样器在包被板的标准孔与待检样品孔加入样品稀释液，每孔100ul；空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔不加样品稀释液。
（3）加样：分别于标准孔加入标准品10ul，各待检样品孔加入待检样品10ul，阴性对照孔加入阴性对照血清100ul，阳性对照孔加入阳性对照血清100ul；空白对照孔不加样。
（4）温育（一）：充分混匀，贴上封板膜，37±2℃温育60分钟
（5）洗板（一）：洗板机洗或手洗5次。
（6）加酶标结合物：除空白对照孔以外，各孔中加入酶标结合物100ul。
（7）温育（二）：贴上封板膜，37±2℃温育30分钟。
（8）洗板（二）：方法同洗板（一）。
（9）加显色剂：每孔加入显色剂A 50ul，全部加完后再在每孔中加入显色剂B 50ul，混匀。
（10）温育（三）：37±2℃显色10分钟。(显色10分钟指从开始加显色剂B 到开始加终止液的间隔时间。)
（11）终止：显色完毕后立即于每孔加50ul终止液， 混匀。
（12） 测定： 终止后应在10分钟内完成判读。对空白对照调零，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值。或使用双波长测定吸光值，测定波长为450nm，参考波长可选630nm或655nm。
（13）结果判定：若待测样品的OD值≥标准品OD值，结果判阳性且具备免疫保护水平；若待测样品的OD值＜标准品OD值，结果为样品不具备免疫保护水平，个体需进行进一步的免疫。
2.犬狂犬病毒抗体（IgG）检测试剂盒检测结果与中和法实验检测结果的对比
表1 与中和法实验检测结果的对比
阳性符合率：[A/(A+C)]*100%=(160/162)*100%=98.77%
阴性符合率：[D/(B+D)]*100%=(55/56)*100%=98.21%
总符合率：[(A+D)/(A+B+C+D)]*100%=[(160+55)/218]*100%=98.62%
结果显示，本方法检测结果与中和法实验检测结果的总符合率达98.62%，检验结果高度一致。
Claims (3)
1.一种犬狂犬病毒抗体的检测方法，其特征在于包括下述步骤：
（1）确定标准点：通过中和实验用标准品进行标定本方法的标准点，其抗体效价为0.5IU/mL；
（2）编号：每次试验应在包被板上设空白对照孔1孔，标准孔3孔，阴性对照孔1孔，阳性对照孔1孔，其余为待检样品孔；
（3）加样品稀释液：用加样器在包被板的标准空与待检样品孔加入样品稀释液，每孔100ul；空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔不加样品稀释液；
（4）加样：分别于标准孔加入标准品10ul，各待检样品孔加入待检样品10ul，阴性对照孔加入阴性对照血清100ul，阳性对照孔加入阳性对照血清100ul；空白对照孔不加样；
（5）温育（一）：充分混匀，贴上封板膜，37±2℃温育60分钟；
（6）洗板（一）：洗板机洗或手洗5次；
（7）加酶标结合物：除空白对照孔以外，各孔中加入酶标结合物100ul；
（8）温育（二）：贴上封板膜，37±2℃温育30分钟；
（9）洗板（二）：方法同洗板（一）；
（10）加显色剂：每孔加入显色剂A 50ul，全部加完后再在每孔中加入显色剂B 50ul，混匀；
（11）温育（三）：37±2℃显色10分钟，显色10分钟指从开始加显色剂B 到开始加终止液的间隔时间；
（12）终止：显色完毕后立即于每孔加50ul终止液， 混匀；
（13） 测定： 终止后应在10分钟内完成判读，对空白对照调零，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值，或使用双波长测定吸光值，测定波长为450nm，参考波长可选630nm或655nm；
（14）结果判定：若待测样品的OD值≥标准品OD值，结果判阳性且具备免疫保护水平；若待测样品的OD值＜标准品OD值，结果为样品不具备免疫保护水平，个体需进行进一步的免疫。
2.一种用于检测犬狂犬病毒抗体的试剂盒，其特征在于包含包被板和试剂反应体系，所述的包被板是包被了浓度为1mg/mL的狂犬病毒抗原的微孔反应板，包被量为100ul/孔，其规格为96孔/块。
3.根据权利要求1所述的用于检测犬狂犬病毒抗体的试剂盒，其特征在于所述的试剂反应体系包括：
（1）标准品：狂犬抗体标准品，效价为0.5IU/mL，规格0.5mL/瓶；
（2）阳性对照血清：犬阳性血清1mL，0.01mol/L PBS（pH7.2）100mL，规格1mL/瓶；
（3）阴性对照血清：犬阴性血清1mL，0.01mol/L PBS（pH7.2）100mL，规格1mL/瓶；
（4）洗液（20×）：每1000ml含磷酸二氢钾4g，十二水磷酸氢二钠58g，氯化钠160g，吐温-20 10mL，Proclin 300 0.5Ml，规格50mL/瓶；
（5）样品稀释液：每1000mL含磷酸二氢钠1.28g，磷酸氢二钠0.41g，氯化钠20.09g，吐温-20 1mL，新生牛血清50mL，指示剂0.2g，曲拉通X-100 1mL，Proclin 300 0.5mL，规格10mL/瓶；
（6）酶标结合物：每1000mL含Tris2.42g，酶稳定剂0.8g，新生牛血清100mL，曲拉通X-100 1.5mL，氯化钠8.5g，Proclin 300 0.5mL，红染料2g，盐酸1.65mL， HRP-抗狗IgG抗体0.1mL，规格10mL/瓶；
（7）显色剂A：每1000mL含柠檬酸2.10g，结晶乙酸钠12.25g，过氧化脲0.6g，规格5mL/瓶；
（8）显色剂B：每1000mL含柠檬酸2.10g，EDTA0.3g，TMB-HCl0.6g，规格5mL/瓶；
（9）终止液：浓硫酸108.5mL溶于纯化水中，定容至1000ml，规格5mL/瓶。
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