CN101692085A - 定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法及其应用。其特征在于用重组人促甲状激素受体(hTSHR)膜外区氨基端蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体依次加入抗hTSHR第一抗体或标准品、酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光发光分析仪上测定荧光强度。临床检测患者血清中以TSAb为主的TRAb对GD甲亢的病因诊断、疗效观察和确定停药时机均有重要意义。本发明以多孔位塑料板为固相载体的荧光酶免疫分析，板材来源容易、成本低、易推广；方法特异、灵敏、准确、稳定，适合临床需要和推广。

Description

定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法及其应用

【技术领域】

本发明属于医学超微量检测技术领域，是以多孔板做载体制备固相抗原酶标板，用于定量检测人血清TRAb(以TSAb为主)的板式荧光酶免方法(FEIA)及其应用。

【背景技术】

Graves’病(GD)是一种多发的自身免疫性甲状腺病(AITD)，促甲状腺素受体(TSHR)是GD发病中最主要的自身抗原。TSHR是存在甲状腺滤泡上皮细胞(TEC)膜上的一种糖蛋白，它与促甲状腺素(TSH)结合后，调节TEC的生长、分化及其合成和释放甲状腺激素的功能。在环境和遗传因素基础上，机体免疫功能异常变化导致AITD，TSHR是AITD的主要自身抗原之一，刺激机体产生促甲状腺素受体抗体(TRAb)，该自身抗体属于异质性抗体，包括甲状腺刺激性抗体(TSAb)和甲状腺阻断性抗体(TSBAb)，前者模拟TSH功能，长期持续地刺激甲状腺激素合成释放而导致GD，表现功能亢进；后者与TSHR特异位点结合而阻止TSH与TSHR的结合及其生理作用的发挥，表现为甲状腺功能低下。目前，TSAb对GD的致病作用已基本肯定，大量研究表明，TSAb的抗原表位主要分布于TSHR膜外区氨基端。TRAb是GD的主要病因，在GD的发病、发展和转归中起重要作用。检测人血清中以TSAb为主的TRAb是GD病因诊断、疗效观察和确定停药时机的重要指标。

目前，没有比较满意的国产TRAb检测技术。国外引进的相关技术有2种，(1)放射受体法(2)酶免法，其阳性检出率均不够理想，不能区分TSAb和TSBAb，而价格十分昂贵，且至今在国内未能推广。国外还有一种生物学分析法能区分TSAb与TSBAb，但方法烦琐，流程长且价格昂贵，只能用于科研，不宜常规使用。近年又有关于发光生物学分析法的报道，可用于检测TSAb和TSBAb。其特点是利用分子生物学技术建立TSHR基因与荧光素酶报告基因共转染且能稳定表达的CHO细胞系，借光产量的测定检测TSAb活性。该方法可以区分TSAb和TSBAb，但目前也是初步研究，技术尚未成熟，还不能用于临床常规检测。

现有技术CN2006100153835中公开了人促甲状腺素受体胞外区氨基端基因表达产物及制备方法和该产物在酶免技术中的应用。这种表达蛋白富含人TSAb的抗原决定簇，具有与人TSAb结合的免疫活性。所以本发明以重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原，以多孔位塑料板为固相载体的定量检测人TRAb(以TSAb为主)的荧光酶免疫技术，创建我国自己的检测TRAb且对TSAb和TSBAb能有所区分的检测技术十分必要，是广大临床医师的迫切要求。

【发明内容】

本发明的目的在于用重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被于酶标板上制备固相酶标板，以此建立板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA技术。

本发明为实现上述目的所采用的方案是设计一种定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于用重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体加入抗hTSHR第一抗体或标准品、再依次酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光发光分析仪上测定荧光强度。

本发明定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法的用途，用于检测以TSAb为主的TRAb荧光酶免法FEIA。定量检测人TRAb(以TSAb为主)的荧光酶免疫法，可做为临床GD甲亢的病因诊断、疗效观察和确定停药时机的重要指标。

本发明的积极效果：

1、以重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被在固相载体多孔板上，进而用此成功地建立了定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA。

2、建立的板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA是把酶联免疫分析ELISA与荧光检测技术结合起来，具有高度的敏感性和特异性，操作方便、准确、稳定，可以同时进行大量标本的检测，并可在荧光分析仪上迅速读出结果。而且多孔位塑料板来源方便，价格低廉，易于临床推广应用。

3、建立的板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA已用于临床检测自身免疫性甲状腺病，特别对GD甲亢的病因诊断、疗效观察和确定停药时机有重要价值，对鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病也有重要的临床意义。

【附图说明】

图1为TRAb标准曲线；

图2为hTSHR膜外区氨基端蛋白抗原与人TRAb和hTPOAb结合反应曲线；

图3为平行实验曲线图；

图4为相关性检测曲线图；

图5为各种甲状腺病患者血清TRAb(以TSAb为主)阳性率曲线图。

以下结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。

【具体实施方式】

本发明板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA用重组hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体依次加入抗hTSHR第一抗体、酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光发光分析仪上测定荧光强度。

所述抗原重组人促甲状激素受体hTSHR膜外区氨基端蛋白的氨基酸序列为：

Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe   16AA

1                       7                       13

Arg Val Thr Cys lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser   32AA

         19                     25                       31

Thr Gln Thr Leu lys Leu Ile Glu Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser   48AA

                37                       43

His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile   64AA

49                       55                     61

Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser   80AA

        67                              73               79

lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile   96AA

                 85                      91

Asp Pro Asp Ala Leu lys Glu Leu Pro His Leu lys Phe Leu Gly Ile  112AA

97                      103                     109

Phe Asn Thr Gly Leu lys Met Phe Pro Asp Leu Thr lys Val Tyr Ser  128AA

        115                     121                     127

Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr  144AA

                133                     139

Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu                          154AA

145                     151

所述多孔板抗原包被是：在多孔板上每孔加16ng-200ng/100μl hTSHR，4℃过夜，然后用PBST漂洗，再用含1-5％BSA的PBST封闭液封闭，每孔加100μl，25-37℃温育1小时，再用PBST漂洗。

所述多孔板是各种不同数量孔位的多孔塑料板。

所述加入抗hTSHR第一抗体是：用稀释液1∶50-1∶200稀释的人血清标本或已知量标准物在多孔板上每孔加100μl，25-37℃温育1小时后用PBST漂洗。

所述加入酶标第二抗体是：在多孔板上每孔加1∶5000-1∶25000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG100μl，25-37℃温育1小时后用PBST漂洗，再用PBS漂洗。

所述加入荧光底物是：用0.01-0.05M Tris-HCL(pH7.8-10.0)缓冲液稀释的四甲基磷酸伞形酮(4-MUP)(稀释倍数为1∶2-1∶15)100μl，25-37℃温育1小时；最后，在多孔板上每孔加0.05-0.15M EDTA终止液50-100μl，25-37℃温育1-20分钟。

所述漂洗是用PBST 200-300μl漂洗1-3次。

本发明在具体实施中还可以有以下方式。

一、固相抗原酶标板的制备

将hTSHR膜外区氨基端蛋白用包被缓冲液(0.015M Na₂CO₃，0.035M NaHCO₃，pH9.6，0.02％NaN₃)稀释至16ng/100μl-200ng/100μl，每孔加100μl，空白孔加包被缓冲液100μl，4℃过夜后用PBST漂洗，再用含1-5％BSA的PBST封闭液封闭，每孔加100μl，25-37℃温育1小时，再用PBST漂洗。

二、板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA的建立

(一)板式固相FEIA原理

该技术是将抗原包被在96孔聚苯乙烯板上，通过固相化的抗原吸附待测样品中的第一抗体，洗去未反应的物质后，加入碱性磷酸酶标记的第二抗体与第一抗体进行结合反应，漂洗后，加入荧光底物4-甲基磷酸伞形酮(4-MUP)，4-MUP被碱性磷酸酶分解产生4-甲基伞形酮(4-MU)和磷酸，4-MU经过355nm激发光的激发后产生460nm的荧光，此荧光强度与标本中抗体的量呈正比，用Fluoroskan Ascent FL仪器测量得到相对荧光单位，根据标准曲线即可以计算出样品中待测抗体的浓度。

(二)最佳条件的探索

1.抗原包被量、一抗稀释度及荧光底物稀释度的选择

在酶标板上按交叉连续稀释法排列组合，抗原包被量为16ng/孔-200ng/孔不等分组包被；一抗稀释度为1-200倍稀释不等分组；荧光底物稀释度为1-15倍稀释不等分组。在不同条件下测定同一TRAb(以TSAb为主)阳性血清和阴性血清的相对荧光单位(RFU)及其比值。结果多种配比均能使RFU阳性质控血清/RFU阴性质控血清比值大于2.1倍以上。我们首选了抗原包被量为每孔100ng/100μl，一抗稀释度为1∶100，荧光底物稀释度为1∶10。

2.荧光底物、终止液反应时间的选择

将反应体系在37℃温箱中温育30min-120min不等分组，观察不同时间荧光发光强度的变化，分别测定其RFU值。与此同时，加入终止液0.05M EDTA后5min-60min不等，观察荧光强度的变化。我们首选加入荧光底物后37℃温育60min，再加终止液5min后在荧光发光分析仪上测定结果。

(三)标准品的制备及标准曲线的建立

1.TRAb标准品的制备

选取TRAb阳性血清，分装、冷干，-30℃避光保存，做为本室制备的标准品备用。

2.标准曲线的建立

标准曲线是用本室研制的TRAb标准物参照WHO NIBSC 90/672参考制剂进行6次校准标定并结合临床确定的。本室自制的标准品浓度分别为0.07mIU/L，0.22mIU/L，0.72mIU/L，4.26mIU/L，9.68mIU/L。以TRAb标准品浓度为横坐标，以其对应的RFU值为纵坐标，在半对数坐标纸上做图建立标准曲线。结果见图1所示。

(四)板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA操作步骤

1.包被抗原：将hTSHR膜外区氨基端蛋白用包被缓冲液(0.015M Na₂CO₃，0.035M NaHCO₃，pH9.6，0.02％NaN₃)稀释至100ng/100ul，每孔加100μl，空白孔加包被缓冲液100μl，4℃过夜。

2.漂洗：每孔用300μl PBST漂洗3次。

3.封闭：每孔加100μl封闭液(含3％BSA的PBST)，37℃温育1小时。

4.漂洗：方法同2。

5.结合一抗：每孔加1∶100稀释(稀释液为PBS)的待测血清100μl；标准曲线各孔分别加已知不同浓度的标准品100μl，37℃温育1小时。

6.漂洗：方法同2。

7.结合二抗：每孔加1∶20000稀释(用含1％BSA的PBST稀释)的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG 100μl，37℃温育1小时。

8.漂洗：方法同2再用PBS漂洗3次。

9.加入荧光底物：每孔加1∶10稀释(用0.1MTris-HCl缓冲液pH10.0稀释)的4-MUP 100μl，37℃温育1小时。

10.终止反应：每孔加0.05M EDTA终止液50μl，37℃温育5min后在荧光发光分析仪上测定RFU值。

(五)方法学鉴定

1.特异性

包被hTSHR膜外区氨基端蛋白抗原，分别将含高浓度hTPOAb和人TRAb的血清稀释20倍、50倍、200倍、500倍后作为一抗进行测定，观察其与抗原的交叉结合反应情况。

结果显示hTSHR膜外区氨基端蛋白与人TRAb特异性结合，而与hTPOAb无交叉结合反应，结果见图2所示。

2.精密度

(1)批内变异：一次实验中分别测定同一阳性质控血清和阴性质控血清各6样，计算批内变异(CV％)分别为4.47％和11.06％。

(2)批间变异：同一阳性质控血清和阴性质控血清，两个月内连续测定6次，计算批间CV％值分别为7.29％和17.83％。

3.灵敏度：本法TRAb(以TSAb为主)最小可测值为0.07mIU/L

4.准确度

加入已知浓度的TRAb，浓度分别为8.00mIU/L，0.40mIU/L和0.10mIU/L，用本法检测，分别计算高、中、低浓度样品的回收率，平均回收率为97.46％。结果见表1。

表1人血清TRAb回收率测定结果

5.健全性

将GD甲亢患者血清进行两次对倍稀释做平行试验，稀释曲线与标准曲线呈平行关系。如图3所示。

6.相关性

本法与进口放射受体法TRAb检测试剂盒两法共检一批不同疗程GD患者血清样品51例，两法检测结果显著相关(r＝0.767，p＜0.05)。如图4所示(横坐标为本法检测TRAb(以TSAb为主)浓度，纵坐标为商品TRAb试剂盒检测TRAb的浓度)。

三、板式固相定量检测人TRAb(以TSAb为主)FEIA的初步临床应用(临床检测896例血样分析)

(一)人血清TRAb(以TSAb为主)阳性切限值的确定

检测337例健康人(年龄20-30岁，男167例，女170例)血清TRAb，结果以x±s表示，正常人群血清TRAb(以TSAb为主)浓度为0.24±0.11mIU/L，以x+2s浓度即0.46mIU/L为阳性切限值。

(二)各种甲状腺病患者血清TRAb(以TSAb为主)的测定

1.病例来源

病例均来自天津医科大学总医院门诊患者，全部根据患者临床症状、体征和实验室检查等资料确诊。各种甲状腺疾病患者559例，其中Graves’病(GD)甲亢初诊患者183例(男81例，女102例，年龄18～70岁，平均年龄40.6±11.2岁，均有高代谢临床表现，甲状腺弥漫性肿大，血清甲状腺激素显示高功能状态，TRAb多呈阳性)，GD治疗中的120例(经过治疗，绝大多数血清FT3、FT4已降至正常)。桥本甲状腺炎(HT)伴甲低初发112例(男39例，女73例，年龄24～79岁，平均年龄44.5±13.1岁，患者有甲减临床表现，甲状腺肿大质韧，血清甲状腺激素显示低功能状态，TMAb和TGAb强阳性)。单纯性甲状腺肿22例(男8例，女14例，年龄19～67岁，平均年龄42.0±13.1岁)，结节性甲状腺肿49例(男28例，女21例，年龄22～60岁，平均年龄31.0±12.5岁)，甲状腺腺瘤21例(男10例，女11例，年龄17～68岁，平均年龄38.7±12.4岁)，亚急性甲状腺炎52例(男24例，女28例，年龄21～66岁，平均年龄45.0±9.0岁)。

2.检测结果

人血清TRAb(以TSAb为主)的测定浓度以x±s表示，阳性率的比较用χ2检验。见表2、图5。

GD甲亢初发患者TRAb(以TSAb为主)1.42±0.23mIU/L，显著高于正常人(p＜0.01)，阳性率87.61％。GD治疗中TRAb(以TSAb为主)0.62±0.35IU/ml，显著高于正常人(p＜0.05)，阳性率55.07％。

HT伴甲低初发患者TRAb 0.71±0.14mIU/L，显著高于正常人(p＜0.01)，阳性率61.88％。

单纯性甲状腺肿0.25±0.12mIU/L，阳性率为0。结节性甲状腺肿0.38±0.13mIU/L，阳性率3.71％。甲状腺腺瘤0.41±0.08mIU/L，阳性率5.01％。亚急性甲状腺炎0.40±0.10mIU/L，阳性率为11.69％。

GD甲亢初发组血清TRAb(以TSAb为主)阳性率高于HT伴甲低初发组和其它各组(p均＜0.01)。单纯甲肿、甲状腺腺瘤、结甲肿、亚甲炎组与正常人血清TRAb无统计学差异(p＞0.05)。

应用板式固相定量检测血清TRAb(以TSAb为主)FEIA检测GD甲亢初发、GD治疗中、HT伴甲低初发、单纯性甲状腺肿、结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和亚急性甲状腺炎患者血清，阳性检出率分别为87.61％、55.07％、61.88％、0、3.71％、5.01％和11.69％，其中GD甲亢初发患者阳性检出率最高，与其他各组之间有显著性差异，P均＜0.01。

表2人TRAb(以TSAb为主)FEIA临床检测结果

注：^*表示与正常人比较P＜0.01；

^■表示与正常人比较P＜0.05；

^▲表示与其它各组比较P＜0.01

板式固相定量检测血清TRAb(以TSAb为主)FEIA应用于临床甲状腺病患者检查，方法特异、灵敏、稳定可靠，GD阳性检出率较高。用于检测患者血清中以TSAb为主的TRAb对GD甲亢的病因诊断、疗效观察和确定停药时机均有重要价值。对鉴别自身免疫性和非自身免疫性甲状腺病也有重要临床意义。

Claims (8)

1.一种定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于用重组人促甲状激素受体hTSHR膜外区氨基端蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封闭；然后再以多孔板做载体加入抗hTSHR第一抗体或标准品、再依次酶标第二抗体、荧光底物和终止液，最后在荧光发光分析仪上测定荧光强度。

2.根据权利要求1所述的定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于所述抗原重组人促甲状激素受体hTSHR膜外区氨基端蛋白的氨基酸序列为：

Met Gly Cys Ser Ser Pro Pro Cys Glu Cys His Gln Glu Glu Asp Phe  16AA

1                        7                       13

Arg Val Thr Cys lys Asp Ile Gln Arg Ile Pro Ser Leu Pro Pro Ser  32AA

         19                      25                      31

Thr Gln Thr Leu lys Leu Ile Glu Thr His Leu Arg Thr Ile Pro Ser  48AA

                 37                      43

His Ala Phe Ser Asn Leu Pro Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Val Ser Ile  64AA

49                       55                      61

Asp Val Thr Leu Gln Gln Leu Glu Ser His Ser Phe Tyr Asn Leu Ser  80AA

         67                      73                      79

lys Val Thr His Ile Glu Ile Arg Asn Thr Arg Asn Leu Thr Tyr Ile  96AA

                 85                      91

Asp Pro Asp Ala Leu lys Glu Leu Pro His Leu lys Phe Leu Gly Ile 112AA

97                      103                     109

Phe Asn Thr Gly Leu lys Met Phe Pro Asp Leu Thr lys Val Tyr Ser 128AA

        115                     121                     127

Thr Asp Ile Phe Phe Ile Leu Glu Ile Thr Asp Asn Pro Tyr Met Thr 144AA

                133                     139

Ser Ile Pro Val Asn Ala Phe Gln Gly Leu                         154AA

145                     151

3.根据权利要求1所述的定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于所述多孔板抗原包被是：在多孔板上每孔加16ng-200ng/100μl hTSHR，4℃过夜，然后漂洗，再用含1-5％BSA的PBST封闭液封闭，每孔加100μl，25-37℃温育1小时，再用PBST漂洗。

4.根据权利要求1所述的定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于所述加入抗hTSHR第一抗体是：用稀释液1∶50-1∶200稀释的人血清标本或已知量标准物在多孔板上每孔加100μl，25-37℃温育1小时后用PBST漂洗。

5.根据权利要求1所述的定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于所述加入酶标第二抗体是：在多孔板上每孔加1∶5000-1∶25000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG 100μl，25-37℃温育1小时后用PBST漂洗，再用PBS漂洗。

6.根据权利要求1所述的定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于所述加入荧光底物是：用0.01-0.05M pH7.8-10.0的Tris-HCL缓冲液按1∶2-1∶15比例稀释的四甲基磷酸伞形酮4-MUP100μl，25-37℃温育1小时。

7.根据权利要求1所述的定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法，其特征在于所述加入终止液是：在多孔板上每孔加0.05-0.15M EDTA终止液50-100μl，25-37℃温育1-20分钟。

8.权利要求1所述的定量检测人血清TRAb板式荧光酶免方法的用途，用于检测以TSAb为主的TRAb荧光酶免法FEIA。

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