CN101477127A - 人脑钠素非竞争双抗体夹心法elisa检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其中：所述酶标板的各孔包被有捕获抗体即BNP－32肽单克隆抗体；所述试剂包括：辣根过氧化物酶标记的BNP特异的检测抗体，BNP－32肽系列标准液，阳性对照血清，样品稀释液，洗涤液，TMB显色液A和B，终止液。本发明的试剂盒具有廉价、高效、省时省力、特异性强、灵敏度高、易于推广等优点；可以满足不同级别临床检测的需要；为早期发现、早期诊断和早期治疗心血管疾病提供了一种高效而可靠的工具。

Description

人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测人脑钠素(BNP)的酶联免疫(ELISA)试剂盒，尤其涉及一种成本低廉的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒。

背景技术

人脑钠素(BNP)是一种具有排钠、利尿、舒张血管作用的神经肽类激素，与心房利钠肽同属循环利钠肽家族。BNP在心血管疾病中是一很有价值的标志物，临床研究亦证实BNP与急、慢性心衰、原发性高血压等多种心血管疾病的早期诊断、鉴别诊断、危险分层、预后评价及治疗关系密切。特别是对由充血性心力衰竭引起心源性呼吸困难与肺源性呼吸困难起到鉴别诊断意义。未来在分子水平及细胞水平上对BNP的产生机制、作用机制和代谢机制的深入研究，将为BNP用于心血管疾病的临床治疗提供更好的依据。

美国FDA、欧洲心脏学会相继把BNP作为临床心功能分级的重要指标，可见对脑钠素进行快捷、准确的检测对于指导临床科学用药、有效判断预后，提高患者生活质量具有重要意义。目前，临床上检测BNP通常运用抗BNP单克隆或多克隆抗体建立起来的免疫学测定方法，如放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)，微粒子酶免疫法(MEIA)，荧光免疫法(FIA)等。但一些方法存在放射性污染，一些方法所需试剂、仪器依靠进口，成本昂贵，另外，由于不同的方法学上的差异导致了各实验室检测结果的不一致，即便一些著名实验室测定结果的变异系数也很大(CV>10％)，这大大限制了其在临床上广泛应用。

目前，临床上检测BNP的方法及产品良莠不齐，不同实验室对同一份样品的测定值差别很大，对判断测定值的临床意义造成了困难。因此，首先应针对各种测定方法建立相应的正常人及各种病理状态下的测定参考值范围。而就现状而言，BNP检测方法的标准化已成为亟待解决的问题之一，开发一种廉价、高效、易于推广使用的BNP检测试剂盒，满足不同级别临床检测的需要，是现实亟待解决的课题。

ELISA酶免法作为临床检测常用的方法，已延伸到许多学科领域，与以往的单纯酶免技术相比，如今已发展衍生多种形式，使得检测方法更具有省时省力，特异性强、灵敏度高等优点。因此，研制和开发一种高效、可靠的人脑钠素酶免检测试剂盒是目前基础临床诊断所迫切需求的。

发明内容

针对现有临床上检测BNP的现状，本发明要解决的问题是提供一种廉价、高效、易于推广使用的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，以满足不同级别临床检测的需要，为早期发现、早期诊断和早期治疗心血管疾病提供一种方便、准确的临床检测方法以及检测试剂盒。

本发明的设计思路是：人类血浆标本中的BNP含量低(皮克级)，因此，本研究采用双单克隆抗体夹心ELISA法，来检测人类血浆标本中的BNP含量。

下面对本发明所述人脑钠素检测试剂盒进行详细的描述：

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其它物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应而结合在固相载体上。此时固相上酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA过程包括固相载体吸附抗体(抗原)，又称为包被，加待测抗原(抗体)，再与相应的酶标记抗体(抗原)进行抗体抗原的特异性反应，生成抗体(抗原)一待测抗原(抗体)—酶标记抗体(抗原)的复合物，最后再与该酶的底物反应生成有色产物。待测抗原(抗体)的定量与有色产物成正比。因此，可以借助于光吸收率来计算抗原(抗体)的量。

基于上述基础，本发明试剂盒的检测原理采用BNP—32肽单克隆抗体包被于酶标板，若待测标本中含有proBNP和(或)BNP-32抗原，该抗原则与其相应的包被单抗相结合，再加入与之配对的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，用TMB作底物显色，用硫酸中止反应后，于450nm处测各孔A值，根据A值大小进行BNP定性定量检测。

本发明所述人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于：所述酶标板的各孔包被有捕获抗体即BNP—32肽单克隆抗体；所述试剂包括：辣根过氧化物酶标记的BNP特异的检测抗体，BNP-32肽系列标准液，阳性对照血清，阳性对照血清，样品稀释液，洗涤液，TMB显色液A和B，终止液。

上述人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒中：所述的包被的捕获抗体优选是：Mab clone ab20984，抗体类型为IgG1，浓度为50ng/ml；对应于proBNP的77-108氨基酸片段。所述的检测抗体优选是辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体BNP-MCAb-HRP，抗体类型为IgG2a，其稀释度为100ng/ml。

上述人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒中：所述BNP-32肽系列标准液分别为1.28ng/mL、0.64ng/mL、0.32ng/mL、0.16ng/mL、0.08ng/mL、0.04ng/mL、0.02ng/mL七个梯度浓度。其中BNP-32肽抗原采用基因工程技术合成，纯度为97％。

上述人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒中：所述样品稀释液是生理盐水或洗涤液；所述洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液；所述终止液为2Mol/L硫酸。

本发明所述人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒在临床心血管病诊断及预后判断中的应用。进一步的，本发明所述人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒在测定人血proBNP和/或BNP-32抗原中的应用。

上述应用中：所述试剂盒进行检测的主要步骤是：将包被捕获抗体的浓度稀释为50ng/mL，包被条件为4℃湿盒内过夜，37℃反应1h；将包被的酶标板以3％BSA(用洗涤液配制)，37℃封闭1.5h；待测样本按1：10常规稀释，与封闭后的酶标板37℃反应45min；然后与浓度为100ng/ml酶标BNP特异的检测抗体37℃反应1h；采用常规的TMB底物液，100μL/孔，37℃避光反应20min，加入常规终止液50μL/孔，终止反应，静置5min，置酶标仪上450nm处测各孔OD值，然后依据BNP-32肽标准品绘制标准曲线，求得待测样本的OD值所对应的浓度含量。

本发明的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒具有廉价、高效、省时省力、特异性强、灵敏度高、易于推广等优点；可以满足不同级别临床检测的需要；为早期发现、早期诊断和早期治疗心血管疾病提供了一种高效而可靠的工具。

附图说明

图1正交优化A₄₅₀均值曲线变化趋势图。

图2时间一定时，A₄₅₀值随反应温度变化曲线。

图3温度一定时，A₄₅₀值随反应时间变化曲线。

图4夹心ELISA检测BNP的标准曲线。

具体实施方式

实施例1BNP双抗体夹心法ELISA检测的制备方法的优化

实验方法：

1.酶标板均一性的检测

取丹麦产Nunc酶标板4块(12孔/条*8条)，从每板中随机取一条编四组，用10μg/ml人IgG包被各孔，每孔100μl，4℃过夜，次日洗板，每孔加1：1000稀释的酶标羊抗人IgG抗体结合物，37℃温育1小时，洗板，每孔加TMB显色剂100μl，室温10分钟显色，每孔加2M硫酸50μl，于Alise酶标仪上，450nm处，测各孔A₄₅₀值，根据实验结果计算板内和板间变异系数，以此评价所用酶标板是否达到实验要求。

2.包被抗体的浓度、抗原浓度和酶标抗体浓度及血清反应时间的优化

制备一合格优良的酶标检测试剂盒时，酶标板的包被至关重要，而包被抗体的浓度往往是决定一个酶标板检测能力的关键因素，因此，本研究选择包被抗体的浓度、抗原浓度和酶标抗体浓度及血清反应时间作基础优化，对上述4因素分别选取了4个和2个位级(见表1)，引用了正交法，设计出16个不同试验条件，制备出16种不同的预包被板，经直观分析从中选出最佳工作浓度和工作条件。

表1 因素位级表

3.包被时间和温度的选择

按上述步骤进行实验。取8条酶标板，分为四组进行实验，每组两条(阳性孔和阴性孔各一条)。第一组：37℃包被1h；第二组：37℃包被2h；第三组：4℃包被过夜；第四组：4℃包被过夜、37℃包被1h。加入已优化确定的最佳浓度的BNP抗原，作为阳性孔；同时以抗原稀释液作阴性对照。反应后比较各组的阴阳对照孔A₄₅₀值，计算P/N(阳性孔与阴性孔A₄₅₀比值)，以确定最佳的包被时间和温度。

4.封闭时间的选择

取8条酶标板，分为四组进行实验，每组两条(阳性孔和阴性孔各一条)。第一组：37℃封闭30min；第二组：37℃封闭1h；第三组：37℃封闭1.5h；第四组：37℃封闭2h。加入已优化确定的最佳浓度的BNP抗原，作为阳性孔；同时以抗原稀释液作阴性对照。反应后比较各组的阴阳对照孔A₄₅₀值，计算P/N(阳性孔与阴性孔A₄₅₀比值)，以确定最佳封闭时间。

5.血清反应温度及反应时间的确定

以已确定的包被条件和封闭条件制备预包被板。取9条酶标板，分为九组进行实验。第1-3组：分别37℃反应45min、60min、1.5h；第4-6组：分别39℃反应45min、60min、1.5h；第7-9组：分别41℃反应45min、60min、1.5h。加入已优化确定的最佳浓度的BNP抗原，作为阳性样本来检测，从而确定最佳反应温度及反应时间。

6.酶标抗体反应时间的选择

取6条已制备好的预包被板，分为三组进行实验，每组两条。第一组：37℃反应45min；第二组：37℃反应60min；第三组：37℃反应90min。加入已优化确定的最佳浓度的BNP抗原，作为阳性孔，同时以抗原稀释液作阴性对照。反应后比较各组的阴阳对照孔A₄₅₀值，计算P/N(阳性孔与阴性孔A₄₅₀比值)，以确定最佳酶标抗体反应时间。

实验结果：

1.酶标板均一性的检测

对所用Nunc酶标板均一性进行检测，结果见表2。

板孔间变异系数为(CV)＝5.7％；板间变异系数(CV)＝5.6％，符合卫生部有关酶联免疫试剂盒制备用酶标板的要求(要求孔间变异系数CV≤10％)，表明酶标板均一性良好，能满足实验要求。

表2 微孔酶标板均一性的检测分析

2.包被抗体的稀释度、抗原浓度和酶标抗体稀释度及血清反应时间的优化

我们通过正交试验对包被抗体的稀释度、抗原浓度、酶标抗体的稀释度及血清反应时间进行了优化，结果见表3和图1，由表及图可看出，通过极差的计算可看出，确定本试验中包被抗体浓度是主要因素，而酶标抗体浓度、检测抗原浓度及血清反应时间为次要因素。图2所示，实验9、10两组A₄₅₀值明显高于其它实验组，处于曲线变化的峰位，而其它实验工作条件下，则水平波动不明显。鉴于10组实验工作条件，更符合实际样本中的含量，因此选择包被抗体浓度0.05μg/ml、抗原浓度0.0001μg/ml、酶标抗体浓度0.1μg/ml及血清反应时间1小时为最佳优化条件。

表3 正交试验方案及结果

3 包被时间和温度的确定

由表4的结果可见，选择不同的包被时间和温度，所得出的P/N值的变化较大，包被时间过短时，P/N值明显减小，说明包被不完全，其中，4℃过夜，37℃1h的P/N值明显大于其他包被条件下的P/N值，所以最佳的包被时间和温度选择4℃过夜，37℃1h。

表4 包被时间和温度的确定

4.封闭时间的确定

由表5的结果可见，不同封闭时间的P/N的比值变化不明显，这可能与本实验所采用的双抗体夹心法有关，但为了减少因封闭时间太短而导致封闭不完全，非特异性增加的现象，以及节省时间的原则上考虑，采用P/N值最大的37℃，1.5h作为最佳封闭时间。

表5 封闭时间的确定

5.血清反应温度及反应时间的确定

通过不同反应温度、不同反应时间条件下测定结果比较发现(见图2、图3)，当在反应时间一定时，所测A₄₅₀值结果随反应温度的增高而呈下降趋势，当反应温度37℃时，测得A₄₅₀值均处于三条曲线变化的最高点，而在39℃和41℃时，所测A₄₅₀值变化不明显，曲线趋于平缓。当在反应温度一定时，所测A₄₅₀值结果则随反应时间的延长而呈下降趋势，在反应时间为45min时，A₄₅₀值随温度的升高而下降最明显，在反应时间为60min和90min时，A₄₅₀值随温度的变化不明显，因此选择的血清反应温度和时间分别37℃，45min。

6.酶标抗体反应时间的确定

表6显示，所测得P/N的比值随着酶标抗体反应时间的延长而增加，当反应时间90min时，所测得P/N的比值最大，但通比较阴性对照A₄₅₀值发现，随着反应时间延长，非特异性反应也相应增加，综合上述因素，选择酶标抗体反应时间60min为最佳反应时间。

表6 酶标抗体反应时间的确定

实施例2 BNP双抗体夹心法检测质量体系的确定

实验方法

1.夹心ELISA法检测BNP标准曲线的制备

按优化后的实验条件进行，取4条已制备好的预包被板，将基因工程合成的BNP抗原分别稀释至1.28ng/mL、0.64ng/mL、0.32ng/mL、0.16ng/mL、0.08ng/mL、0.04ng/mL、0.02ng/mL七个梯度浓度，并以样品稀释液作为0.0ng/ml，每份不同浓度的标准品都设四个平行孔。以标准抗原(ng/ml)为横坐标，相应A₄₅₀值为纵坐标制作标准曲线，求得线性检测范围，并根据标准曲线计算样本血浆BNP水平。

2.检出限的测定

以样品稀释液作为0.0ng/ml，重复测定15次，计算平均吸光度A值(X)及标准差(s)。以X±3s^-计算所对应的BNP浓度，即为检测下限。

3.重复性实验

按优化后的实验条件进行，将基因工程合成的BNP抗原分别稀释至0.08ng/mL、0.16ng/mL、0.32ng/mL、0.64ng/mL和1.28ng/mL五个梯度浓度。批内重复性实验：取24条已制备好的预包被板，分8组，每组3条，每份不同浓度的标准品都设三个平行孔，同批进行测试；批间重复性实验：取18条已制备好的预包被板，分6组，每组3条，每份不同浓度的标准品都设三个平行孔，分六批进行测试，然后，分别计算批内与批间变异系数。

4.准确度实验

按优化后的实验条件进行，取4条已制备好的预包被板，选择空白样品，即选择ELIsA未检测出的样品(小牛血清)，进行加标回收实验。分别准确加入BNP标准品，使样品中BNP浓度分别为0.8ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL，每个浓度做四个平行，计算加标回收率和变异系数。

5.样品稀释实验

按优化后的实验条件进行，取4条已制备好的预包被板，将高浓度BNP标准品(1ng/ml)分别作1：1、1：10、1：20、1:50四个倍数稀释后，每个稀释倍数作八个平行，同批检测A₄₅₀值，计算每个稀释倍数的变异系数。

实验结果

1夹心ELISA法检测BNP标准曲线的建立

(1)以确定的最佳浓度50ng/mL的BNP单抗包被酶标板，4℃过夜，37℃保温1h，封闭1.5h。

(2)将BNP抗原分别稀释至1.28ng/mL、0.64ng/mL、0.32ng/mL、0.16ng/mL、0.08ng/mL、0.04ng/mL、0.02ng/mL七个梯度浓度，并以样品稀释液作为0.0ng/ml，各100μl/孔，每份不同浓度的标准品都设四个平行孔，37℃，45min。

(3)加入稀释的酶标抗体100μl/孔，37℃1h，洗4次；加TMB底物溶液100μl/孔。37℃避光反应20min，2mol/L H₂SO₄终止反应，酶标仪450nm处读取A值。

(4)以标准抗原(pg/ml)为横坐标，相应A值为纵坐标，以不同稀释度标准抗原A值绘制标准曲线，根据标准曲线计算样本血浆BNP含量(见图4)。分析BNP标准曲线发现，当浓度在20pg/ml-1280pg/mL时有较好的线性关系(如图4)，得到的标准线性方程为：y＝0.0006x+0.132，其中：R²＝0.9757SD＝0.0335。说明在此直线范围内，测定的结果比较接近。

2.检出限的确定

按空白对照的X+3s计算，理论上本试剂盒的检测下限为11pg/ml。线性测定范围在11pg/ml～1280pg/mL。

3.重复性实验

通过计算比较在同一批次内检测结果进行分析，批内变异系数为6.32％；通过比较在不同批次间的检测结果进行分析，批间变异系数为6.12％。批内批间变异系数均小于10％，表明该实验重复性较好，实验结果见表7。

表7 不同浓度下的批内和批间重复性实验

4.准确度实验

用已建立的ELISA方法测得的加标回收率分别为93.1％、97.4％和92.2％，平均为94.2％，表明该实验的准确度较好，结果见表8。

表8 加标回收实验结果

5.样品稀释实验

将高浓度BNP标准品(1ng/ml)分别作1：1、1：10、1：20、1:50四个倍数稀释后，进行批内重复性实验，检得A₄₅₀值及变异系数显示，当样本稀释倍数为1：10时，变异系数最小(4.1％)，显著低于其它三个稀释倍数。表明在1：10稀释倍数下，重复性好，测得实验结果稳定。因此，选择1：10作为样本稀释倍数(见表9)。

表9 不同稀释倍数批内重复性实验

用本研究制备的BNP检测试剂与上海罗氏诊断产品有限公司生产的BNP诊断试剂盒分别对150例临床标本进行对比检测。结果判断标准以上海罗氏诊断试剂盒为标准，计算本发明研制的检测体系的灵敏度及特异度。结果见表10。

表10 不同试剂盒对150份标本对比检测结果

经X²检验，X²＝1.77，P>0.10。提示两种试剂盒的检测结果统计学上无差别。本试剂盒的灵敏度(真阳性/真阳性+假阳性)＝96/96+7＝93.2％，特异度(真阴性/真阴性+假阴性)＝45/45+2＝95.7％，符合率＝96+45/150＝94％。

一般认为灵敏度或特异性>90％为良好，从检测结果可以看出，本发明制备的试剂盒与上海罗氏诊断产品有限公司生产的BNP诊断试剂盒检测结果基本一致。

实施例4 人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒

本发明所述试剂盒采用BNP—32肽单克隆抗体包被于酶标板，若待测标本中含有proBNP和(或)BNP-32抗原，该抗原则与其相应的包被单抗相结合，再加入与之配对的酶标记的BNP特异的单克隆抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，用TMB作底物显色，用硫酸中止反应后，于450nm处测各孔OD值，根据OD值大小判定结果。

试剂盒组成：

1.BNP-McAb(Mab clone ab20984)预包被酶标板(96孔)  1块

2.阳性对照血清                                   1瓶

3.阳性对照血清                             1瓶

4.样品稀释液                               1瓶

5.酶结合物(BNP-MCAb-HRP)                   1瓶

6.洗涤液                                   1瓶

7.显色剂A                                  1瓶

8.显色剂B                                  1瓶

9.终止液(2Mol/L硫酸)                       1瓶

本发明所述试剂盒的操作步骤：

1.取所需用量预包被板条，按顺序编号，设阴性、阳性对照及空白对照各3孔；

2.每孔加样本稀释液100μl，待检血清5μl；阴、阳性对照孔分别加阴、阳性对照血清100μl；空白对照孔加样品稀释液100μl；

3.置37℃温育45分钟；

4.扣去孔内液体；每孔加满洗涤液(300μl)，静置3分钟后弃去，重复洗涤3次；

5.每孔加酶结合物100μl；

6.置37℃温育60分钟；

7.扣去孔内液体；每孔加满洗涤液(300μl)，静置3分钟后弃去，重复洗涤4次；

8.每孔分别加显色剂A、B各50μl，混匀，37℃遮光15分钟；

9.每孔加终止液50μl，轻轻混匀后，置酶标仪上450nm处测各孔OD值。

结果判定：

1、定性检测

临界值＝阴性对照平均值×2.1

检测样本的OD值≥临界值判为本试验阳性，<临界值者判为阴性。

所有阴性、阳性对照和待测样本的OD值须减去空白平均值后作为计算值。阴性对照小于0.05对，按0.05计算。

2、定量检测

用BNP标准品绘制标准曲线，依据标准曲线，求得待测样本的OD值所对应的浓度含量。

注意事项：

1.严格按说明书操作，反应温度和时间应符合要求。

2.刚从冰箱取出的试剂盒，应放室温平衡后使用。

3.不同批号试剂不能混用。

4.洗涤要充分，洗涤时各孔均应加满洗涤液，并每次扣干。

5.所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按传染物处理。

贮存条件及有效期：

2-8℃贮存。

自生产之日起，有效期六个月。

实施例5：BNP试剂盒的临床应用

随机抽取某日健康查体样本40例，其中女性14人，男性26人，年龄范围18～40岁(28±11.6岁)，使用新研制的定量检测BNP试剂盒对样本进行盲检，测得血浆中BNP含量为125±108.8pg/ml，这与其他一些研究资料所报道的正常人群中BNP含量范围基本符合。表明本研制的定量检测BNP试剂盒有较好的线性检测范围，可以应用于临床样本BNP的检测。

Claims (8)

1.一种人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于：所述酶标板的各孔包被有捕获抗体即BNP—32肽单克隆抗体；所述试剂包括：辣根过氧化物酶标记的BNP特异的检测抗体，BNP-32肽系列标准液，阳性对照血清，阳性对照血清，样品稀释液，洗涤液，TMB显色液A和B，终止液。

2.如权利要求1所述的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的包被的捕获抗体是：Mab clone ab20984，抗体类型为IgG1，浓度为50ng/ml；对应于proBNP的77-108氨基酸片段。

3.如权利要求1所述的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的检测抗体是辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体BNP-MCAb-HRP，抗体类型为IgG2a，其稀释度为100ng/ml。

4.如权利要求1所述的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述BNP-32肽系列标准液分别为1.28ng/mL、0.64ng/mL、0.32ng/mL、0.16ng/mL、0.08ng/mL、0.04ng/mL、0.02ng/mL七个梯度浓度。

5.如权利要求1所述的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为含有体积分数0.05％吐温-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

6.权利要求1所述的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒在临床心血管病诊断及预后判断中的应用。

7.权利要求1所述的人脑钠素非竞争双抗体夹心法ELISA检测试剂盒在测定人血proBNP和/或BNP-32抗原中的应用。

8.如权利要求6或7所述试剂盒的应用，其特征在于：应用试剂盒进行检测的步骤是：将包被捕获抗体的浓度稀释为50ng/mL，包被条件为4℃湿盒内过夜，37℃反应1h；将包被的酶标板以3％BSA，37℃封闭1.5h；待测样本按1∶10常规稀释，与封闭后的酶标板37℃反应45min；然后与浓度为100ng/ml酶标BNP特异的检测抗体37℃反应1h；采用常规的TMB底物液，100μL/孔，37℃避光反应20min，加入常规终止液50μL/孔，终止反应，静置5min，置酶标仪上450nm处测各孔OD值，然后依据BNP-32肽标准品绘制标准曲线，求得待测样本的OD值所对应的浓度含量。

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