CN102662068A - 甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种免疫分析医学中的检测试剂盒,具体设计一种甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,包括甲状腺素系列标准品,T4-IgG包被的磁微粒,碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体,荧光发光底物,样本稀释液,浓缩洗涤液,还包括一个反应测试杯。本发明同现有技术相比,使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。对样本的前处理要求低,样品前处理过程简单快捷,可高速、大通量的检测大批样本,便于操作和生产。
Description
[技术领域]
本发明涉及一种免疫分析医学中的检测试剂盒,具体设计一种甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒及其制备方法。该试剂盒结合了免疫磁微粒分离技术和荧光免疫分析技术,检测范围宽,灵敏度高,抗干扰强。
[背景技术]
甲状腺疾病是常见的内分泌疾病,全球患病人数已超3亿,中国患者超过6.7千万,且呈逐年增加。最新的《中国十城市甲状腺病流行病学调查》统计结果显示,我国十城市的甲亢患病率为3.7%、甲减患病率为6.5%、甲状腺结节患病率为18.6%。因甲状腺疾病具有多发性,临床症状多样性及复杂性的特点,血清甲状腺激素测定在临床中应用十分广泛。本试剂盒用于定量检测人血清中的总甲状腺素(TT4)的含量。
T4是甲状腺分泌的主要产物,也是构成下丘脑-垂体前叶-甲状腺调节系统完整性不可缺少的成份。对合成代谢有影响作用。T4由二分子的二碘酪氨酸(DIT)在甲状腺内偶联生成。T4与甲状腺球蛋白结合贮存在甲状腺滤泡的残腔中,在TSH的调节下分泌释放。T4及其相关的甲状腺激素T3负责对人体中各种生化过程进行调节,这些过程是正常新陈代谢和神经活动的基础。尽管T3具有很强的生物能量,但T4通常以约50倍于循环T3的形式存在于人血清中。血清中99%以上的T4以与其它蛋白质结合的形式存在,不具生物学活性。由于血清中运输蛋白质的浓度易受外源性和内源性作用的影响,因此,在检测血清T4浓度的过程中需考虑到结合蛋白质的状况。如果忽略这一点,会导致反映甲状腺代谢状况检测的错误结果。
血清总T4检测是最早应用于临床检测甲状腺功能的甲状腺激素,对于评价甲状腺功能可以说功不可没。正常成人血清TT4水平为64-154nmol/L(5-12ug/dl)。T4水平升高见于甲亢,高TBG血症(妊娠,口服雌激素及口服避孕药,家族性),急性甲状腺炎,亚急性甲状腺炎,急性肝炎,肥胖症,应用甲状腺激素时,进食富含甲状腺激素的甲状腺组织等。水平降低可见于甲减,低TBG血症(肾病综合征,慢性肝病,蛋白丢失性肠病,遗传性低TBG血症等),全垂体功能减退症,下丘脑病变,剧烈活动等。T4测定可用于甲亢、原发性和继发性甲减的诊断以及TSH抑制治疗的监测等,具有较高的临床诊断价值。
免疫学测定是以抗体-抗原的特异性识别、抗体标记技术和示踪技术为基础的定量技术。在肿瘤标志物的体液检测中具有广泛应用。现有的甲状腺激素的测定方法有平衡透析法、放射免疫法、酶联免疫吸附分析法、时间分辨荧光免疫分析法、电化学发光检测及微孔板酶促化学发光免疫分析法等。但这些方法都具有一定局限性,,如平衡透析法操作步骤繁琐,操作时间长;放射免疫分析方法的试剂具有放射性,会对操作人员的身体健康产生影响,操作不能实现自动化;酶联免疫分析方法灵敏度低,步骤繁琐;时间分辨荧光免疫分析法与电化学发光检测法都需要较为昂贵的稀土元素作为试剂,不利于大范围的推广使用;微孔板酶促化学发光免疫分析法则受到固相载体表面积的限制,无法实现较宽范围的检测。
在实际的免疫检测中,由于待测样品中所含的杂质成分较多,一定程度上影响了检测灵敏度和准确性,所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测无,是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体,以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体),使其致敏为免疫磁微粒,具有分离速度快、效率高、可重复性好;操作简单;不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点,在外加磁场作用下定向运动,使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
免疫磁微粒分析技术与荧光发光免疫分析技术结合检测待测物,可大大提高检测的灵敏度和准确性,它以毫米级磁微粒为载体,利用表面有机物提供的羧基活性集团与蛋白质氨基共价结合,采用抗体进行“搭桥”成免疫磁微粒,可进行抗原、抗体反应。该技术的新颖之处有:(1)采用微小的磁微粒作为固相可增加包被表面积,从而增加了抗原抗体的有效包被量,不仅节省了原料,而且有助于建立宽分为的免疫检测方法,尤其适合于高浓度临床样本的测定,避免HOOK效应的发生;(2)利用顺磁铁微粒为固相载体,外包抗原或抗体,增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积,提高反应的灵敏度,并采用旋转磁场使磁微粒起搅拌作用及分离结合抗原-抗体与游离抗体的作用。
鉴于国内化学发光和电化学发光分析仪器几乎全为国外厂商生产,而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式,并在仪器中人为设置排它性检测程序,从而抬高了配套试剂盒价格,增加了检测成本。而时间分辨荧光免疫分析法在我国的起步较晚,很多测量仪器及试剂还要依靠进口;很多国产分析软件的编制还存在操作繁琐,功能不全,界面不简洁等缺点。
[发明内容]
本发明为了克服现有技术的不足,提供了一种甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒及其制备方法。
为了实现上述目的,本发明设计了一种甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,包括甲状腺素系列标准品,T4-IgG包被的磁微粒,碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体,荧光发光底物,样本稀释液,浓缩洗涤液,还包括一个反应测试杯。
所述反应测试杯为不透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯中的一种材料制成。
所述甲状腺素系列标准品为多克隆抗体或单克隆抗体。
所述的荧光发光底物,包括冻干粉和底物溶解液;其中,底物冻干粉为磷酸-4-甲基伞形酮;底物溶解液为2-氨基-2甲基-1丙酮。
所述浓缩洗涤液为,浓度0.01-0.05M、pH值为7.0-7.6的磷酸盐缓冲液,且缓冲液中含有0.01-0.05%的吐温20和终浓度为8-14g/L的氯化钠。
所述样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
一种甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒的制备方法,采用如下工艺步骤:
A)甲状腺素系列标准品的制备:用去激素人血清甲状腺素纯品稀释成标准品,其浓度为0-360ng/ml;
B)T4-IgG包被磁微粒的制备:将粒径为0.5-1mm的磁微粒静置于含1-1.5ug/ml T4-IgG,浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中,室温混匀10-30min后37℃过夜,取出,用稀释好的浓缩洗涤液清洗1-3次,4℃封闭液过夜,洗1-3次并抽真空干燥,平均分配到反应测试杯中;
C)碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体标记物的制备:T4单克隆抗体采用过碘酸钠法与碱性磷酸酶交联,用酶标记物稀释液进行稀释,稀释比例为1∶3000,制成酶标工作液;
D)荧光发光底物的制备:去离子水中含0.01-0.05mM磷酸-4-甲基伞形酮,制成冻干粉;底物溶解液为,浓度0.1-0.5M、pH值9.0-11.0的2-氨基-2-甲基-1丙酮;
E)样本稀释液的制备:浓度为0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液,pH值为7.0-7.6。
F)浓缩洗涤液的制备:向步骤E中的磷酸盐缓冲液中加入体积百分比为0.01-0.05%吐温20和终浓度为8-14g/L的氯化钠;
G)分装步骤:取步骤C中制得的酶标工作液100ul-200ul平均分配到步骤B中含有磁微粒的反应杯中,并冻干封口;
H)将上述试剂组装成试剂盒。
所述步骤B中,磁微粒为直径0.05-1mm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有氨基活性基团的聚合物。
所述步骤B中,封闭液是含有质量百分比浓度为0.05%-0.5%明胶和0.05%-0.2%叠氮钠的pH为7.4的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。
所述步骤C中,酶标记物稀释液为,含有0.4mg/ml ANS和0.05%BSA的Tris-CL缓冲液,缓冲液的pH值为8.0。
本发明同现有技术相比,使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。对样本的前处理要求低,样品前处理过程简单快捷,可高速、大通量的检测大批样本,便于操作和生产。
[具体实施方式]
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明不用于限制本发明的范围。
实施例,一、甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒的制备:
A)甲状腺素系列标准品的制备:
(1)将60ml的正常人血清等份装入四个容量瓶中,然后分别加入8.0g活性炭,倒置用漩涡振荡器混合均匀,振荡8h后,以6000rpm,离心20min,将上清过滤,向滤液中加入体积百分比浓度为0.05%Proclin-300,冷冻保存。
(2)向上述步骤中得到的去激素人血清中加入不同量的T4纯品稀释成标准品,经电化学发光测定浓度后,分装成浓度为:0ng/ml,15ng/ml,45ng/ml,90ng/ml,180ng/ml和360ng/ml的6瓶T4校准品。
B)T4-IgG包被磁微粒的制备:
将粒径为0.5-1mm的磁微粒静置于含1.5ug/ml T4-IgG,浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中,室温混匀30min后37℃过夜,取出,用稀释好的浓缩洗涤液清洗1次,4℃封闭液过夜,洗3次并抽真空干燥,每反应测试杯中放置10粒。
C)碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体标记物的制备:
用含有0.4mg/ml ANS和0.05%BSA的Tris-CL,pH8.0缓冲液配制成酶标稀释液。
T4单克隆抗体用过碘酸钠法与碱性磷酸酶交联。并加入如上述稀释液,以1∶3000稀释成酶标工作液。
D)荧光发光底物的制备:
在去离子水中加入浓度为0.01mM磷酸-4-甲基伞形酮,冷冻干燥,制成底物冻干粉。
在去离子水中加入浓度为0.1M 2-氨基-2-甲基-1丙酮,pH10.0,制成底物溶解液。
E)样本稀释液的制备:浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液,pH值为7.2。
F)浓缩洗涤液的制备:向步骤E中的磷酸盐缓冲液中加入体积百分比为0.05%吐温20和终浓度为14g/L的氯化钠。
G)分装步骤:取步骤C中制得的酶标工作液150ul平均分配到步骤B中含有磁微粒的反应杯中,并冻干封口。
H)将用上述方法制备的各组分分装并装入试剂盒中。以检测100个样本的试剂盒为例,包括:
(1)T4系列标准品共6瓶,1ml/瓶。
(2)内含有反应体系的密闭反应杯100个。
(3)样本稀释液1瓶,100ml/瓶。
(4)荧光发光底物冻干粉1瓶,净重20g;底物溶解液1瓶100ml;在使用前将底物溶解液倒入荧光发光底物冻干粉瓶中,混合均匀。
(5)浓缩洗涤液一瓶100ml,使用时用去离子水稀释20倍。
二、本发明试剂盒的使用方法如下:
1)试剂的准备:
A.将试剂盒置室温(18-26℃)平衡20分钟。
B.从试剂盒中取出浓缩洗涤液,用去离子水以1∶20配制成工作液。
C.发光底物冻干粉充分溶解于底物溶解液中。
2)样本准备:
取人空腹晨血清样本,3000rpm离心10min,去上层血清进行分析。
3)操作步骤:
A.取出所需数量的反应杯置于板架上。
B.加入标准品1-6和待测样本,每反应杯20ul。
C.加入样本稀释液每反应杯150ul。
D.置于磁力混合分离器上37℃孵育10min。
E.弃去液体,每反应杯加入稀释后的浓缩洗涤液500ul,反复洗涤五次,去洗液。
F.每反应杯加入200ul荧光发光底物。
G.于荧光分光光度计中检测FU值。
4)实验结果的计算:
以T4系列标准品浓度对数值为横坐标,FU值Logit转换为纵坐标,进行直线回归,绘制出标准曲线,将待测样本的FU值代入方程即可求出对应浓度值。
实验结果如下:
按照本领域中常规的制造及检定规程对本实施例中制备的试剂盒进行检定,结果如下:
1、试剂盒灵敏度测定:
平均测定10个S0标准点,计算其FU的平均值和标准偏差,带入线性方程,计算出对应的浓度值,并重复该操作5次,得到该试剂盒的最低检出限,本试剂盒的最低检测限为3ng/ml。
2、试剂盒精密度实验:
将实施例1制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验,分别测定低、中、高三种不同浓度的血清,平行测定10次,得出每次分析的批内和多次分析的批间变异。其批内和批间变异系数均小于15%。
3、试剂盒特异性实验:
交叉反应性物质 | 交叉率(%) |
L-T4 | 100 |
T4 | 28.7 |
L-T3 | 0..92 |
D-T3 | 0.5 |
3,3,5-三碘甲状腺丙氨酸 | 1.4 |
3,5-二碘甲状腺丙氨酸 | 0.13 |
3,5-二碘-L-酪氨酸 | <0.1 |
4、干扰物质实验:
在检测样本中如血红蛋白、游离胆红素、饱和胆红素、脂质、抗坏血酸以及肝素的浓度分别低于390mg/dl、17mg/dl、18mg/dl、1660mg/dl、20mg/dl、100U/ml时上述物质几乎不会影响检测结果。
5、相关性对比:
本发明试剂盒方法(y)与Roche公司ECLIA(x)的相关性如下所示:
Y=0.996x+0.235
R2=0.986
N=90
6、试剂盒稳定性实验:
对本实施例的试剂盒分别进行4℃、37℃的3天、7天和14天稳定性实验,结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、待测物的加标回收率、批内批间变异系数等指标均在正常范围之内。对本实施例的试剂盒主要组分进行2-8℃8个月跟踪实验,结果表明各项指标完全符合要求。从以上结果可以看出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存1年以上。
经过大量的实验证明,本发明的试剂盒方法学指标如下:
检测范围:0-360ng/ml;
灵敏度:最小检出限为3ng/ml;
精密度:批内变异小于9.6%(要求小于15%);批间变异小于12.3%(要求小于20%)。(n=10)
特异性:L-T3、D-T3、3,3,5-三碘甲状腺丙氨酸、3,5-二碘甲状腺丙氨酸、3,5-二碘-L-酪氨酸的交叉反应率小于1%
稳定性:各试剂组分置37℃,考察14天后,各组分仍稳定。
Claims (10)
1.一种甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,包括甲状腺素系列标准品,T4-IgG包被的磁微粒,碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体,荧光发光底物,样本稀释液,浓缩洗涤液,还包括一个反应测试杯。
2.根据权利要求1所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述反应测试杯为不透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯中的一种材料制成。
3.根据权利要求1所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述甲状腺素抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述的荧光发光底物,包括冻干粉和底物溶解液;其中,底物冻干粉为磷酸-4-甲基伞形酮;底物溶解液为2-氨基-2甲基-1丙酮。
5.根据权利要求1所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述浓缩洗涤液为,浓度0.01-0.05M、pH值为7.0-7.6的磷酸盐缓冲液,且缓冲液中含有0.01-0.05%的吐温20和终浓度为8-14g/L的氯化钠。
6.根据权利要求1所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
7.一种甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒的制备方法,采用如下工艺步骤:
A)甲状腺素系列标准品的制备:用去激素人血清稀释甲状腺素纯品,其浓度为0-360ng/ml;
B)T4-IgG包被磁微粒的制备:将粒径为0.5-1mm的磁微粒静置于含1-1.5ug/ml T4-IgG,浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液中,室温混匀10-30min后37℃过夜,取出,用稀释好的浓缩洗涤液清洗1-3次,4℃封闭液过夜,洗1-3次并抽真空干燥,平均分配到反应测试杯中;
C)碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体标记物的制备:T4单克隆抗体采用过碘酸钠法与碱性磷酸酶交联,用酶标记物稀释液进行稀释,稀释比例为1∶3000,制成酶标工作液;
D)荧光发光底物的制备:去离子水中含0.01-0.05mM磷酸-4-甲基伞形酮,制成冻干粉;底物溶解液为,浓度0.1-0.5M、pH值9.0-11.0的2-氨基-2-甲基-1丙酮;
E)样本稀释液的制备:浓度为0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液,pH值为7.0-7.6。
F)浓缩洗涤液的制备:向步骤E中的磷酸盐缓冲液中加入体积百分比为0.01-0.05%吐温20和终浓度为8-14g/L的氯化钠;
G)分装步骤:取步骤C中制得的酶标工作液100ul-200ul平均分配到步骤B中含有磁微粒的反应杯中,并冻干封口;
H)将上述试剂组装成试剂盒。
8.根据权利要求7所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤B中,磁微粒为直径0.05-1mm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有氨基活性基团的聚合物。
9.根据权利要求7所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤B中,封闭液是含有质量百分比浓度为0.05%-0.5%明胶和0.05%-0.2%叠氮钠的pH为7.4的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求7所述的甲状腺素磁微粒荧光发光免疫分析试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤C中,酶标记物稀释液为,含有0.4mg/ml ANS和0.05%BSA的Tris-CL缓冲液,缓冲液的pH值为8.0。
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