CN102183666B - 高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，一次检测样本可同时检测十二种病原抗体，还可灵活组织检测项目，只检测所要求的病原抗体，并建立了以土拉抗体、登革热抗体为代表的定量检测微生物抗体液相芯片检测的开放性检测模式化平台。

Description

高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明涉及一种高通量检测血清样本中东方马脑炎病毒抗体、西尼罗病毒抗体、黄热病毒抗体、土拉菌抗体、登革病毒抗体、禽流感病毒抗体、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病原体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体共十二种病原抗体的液相芯片及其制备方法和使用方法。

背景技术

东方马脑炎病毒传染性强，对人群危害性大，其临床表现与乙型脑炎很相似，病死率约在35%以上。该病毒也是目前国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一，国内属一类管理的病毒种类，备受关注。

西尼罗热是由西尼罗病毒感染引起的急性传染病。人感染西尼罗病毒多数表现为隐性感染，约140～300个感染者中有1个临床病例。其症状为突然发热、头痛、背痛、肌肉痛等。发烧可表现为双波热，约半数病人可见皮疹。出疹时间在发热期或发热末期。皮疹可为玫瑰样疹或斑丘疹，部位主要在颈背和上肢，持续时间约为l周。

黄热病毒引起的急性传染病，病人常出现黄疸伴发热，故名。主要症状有发热、头痛、黄疸和出血等；黄热病的主要病变在肝、肾、心、胃、肠等内脏。轻型病例呈急性发病，有明显的发热、头痛、恶心、鼻衄、轻度黄疸和蛋白尿，几日后痊愈；重型病例常突然发病，表现寒战高热头痛、背痛、全身痛、恶心、呕吐、面红、眼结合膜充血、末梢血液中白细胞降低，持续数日后，症状减轻，然后再出现发热并开始有黄疸，伴出血倾向，表现为软腭出血点、鼻衄、牙龈出血、呕黑色血水，有时出现蛋白尿甚至无尿，50％病人出现相对缓脉，意识清醒，肝功能受损，血胆红质增高，凝血酶原时间延长，转氨酶升高，肝病重时可出现低血糖，10～60％病人在6～8日后出现休克、昏迷以致死亡。

土拉菌病是由土拉弗朗西斯菌引起的多种野生动物、家畜及人共患病，亦称野兔热。临床上以体温升高、淋巴结肿大、脾和其他内脏坏死为特征，土拉菌可以被用作生物战中的致病病菌，感染者会出现高烧、浑身疼痛、腺体肿大和咽食困难等症状。

登革热是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。临床特征为起病急骤，高热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。

禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，也能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为百分之33。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车辆往来是传播本病的重要途径。

感染委内瑞拉马脑炎病毒潜伏期2～5天，大多表现为流感样症状，发冷、发热、头痛、肌痛（以下背部及腿部明显）及恶心、呕吐等。可有心动过速、结膜炎和非渗出性咽峡炎等体征，约4～6天上述症状消失，仅有少数患者有嗜睡、昏迷、抽搐、痉挛性瘫痪及中枢性呼吸型衰竭等脑炎的典型表现，末梢血白细胞轻度增高，有脑炎表现者脑脊液呈病毒性脑炎特点。

免疫学方法酶联免疫实验（ELISA）中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记二抗与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记二抗-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。

液相芯片技术，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。

目前发展的液相芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低检测成本。但是液相芯片方法是否能够高通量检测人血清中的东方马脑炎病毒抗体、西尼罗病毒抗体、黄热病毒抗体、土拉菌抗体、登革病毒抗体、禽流感病毒抗体、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病原体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体共十二种抗体，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量检测血清样本中东方马脑炎病毒抗体、西尼罗病毒抗体、黄热病毒抗体、土拉菌抗体、登革病毒抗体、禽流感病毒抗体、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病原体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体，共十二种病原抗体的液相芯片。

一种高通量检测十二种病原抗体的液相芯片包括：包被有捕获抗原的编码微球、生物素标记的二抗作为捕获抗体、链亲和素-藻红蛋白及相关缓冲溶液，其中，作为捕获抗原的有东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原、西尼罗E蛋白抗原、黄热E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革热E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次体120C蛋白抗原、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原、Q热立克次体coml蛋白抗原、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原、马秋波GP2蛋白抗原、西部马脑炎病毒E1C蛋白抗原。

进一步，所述编码微球优选011、025、027、028、031、032、033、034、043、044、061和071号编码微球，其中，

011编码微球用东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

025编码微球用西尼罗E蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

027号编码微球用黄热E蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

028号编码微球用土拉fopA蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

031号编码微球用登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

032号编码微球用禽流感H5蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

033号编码微球用普氏立克次体120C蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

034号编码微球用蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

043号编码微球用Q热立克次体coml蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

044号编码微球用委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

061号编码微球用马秋波GP2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

071号编码微球用西部马脑炎病毒 E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被。

一种检测上述十二种病原抗体的液相芯片的制备方法，具体为：在相关缓冲溶液中，挑选相应的编码微球，分别采用东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原、西尼罗E蛋白抗原、黄热E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革热E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次体120C蛋白抗原、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原、Q热立克次体coml蛋白抗原、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原、马秋波GP2蛋白抗原和西部马脑炎病毒E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被相应的编码微球，用生物素标记的二抗作为Biotin-SPA，用链亲和素-藻红蛋白作为信号检测物，来制备液相芯片。

一种利用上述液相芯片高通量检测血清样品中抗体的间接免疫学定量检测方法，具体为：

1）将东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被011编码微球、西尼罗E蛋白抗原作为捕获抗原来包被025编码微球、黄热E蛋白抗原作为捕获抗原来包被027号编码微球、用土拉fopA蛋白抗原作为捕获抗原来包被028号编码微球、用登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被031号编码微球、用禽流感H5蛋白抗原作为捕获抗原来包被032号编码微球、普氏立克次体120C蛋白抗原作为捕获抗原来包被033号编码微球、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原作为捕获抗原来包被034号编码微球、Q热立克次体coml蛋白抗原作为捕获抗原来包被043号编码微球、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被044号编码微球、马秋波GP2蛋白抗原作为捕获抗原来包被061号编码微球、西部马脑炎病毒E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被071号编码微球；

2）向检测载体内加入含十二种已包被捕获抗原编码微球的工作溶液、或单一包被捕获抗原编码微球的工作溶液、或几种已包被捕获抗原编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

3）加入待测血清样品，孵育后清洗；

4）加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；

5）加入链亲和素-藻红蛋白，孵育后清洗；

6）加入检测缓冲液后混合均匀；

7）用液相芯片系统读取平均荧光强度MFI数值，并分析数据判定检测结果，以完成血清样品中十二种抗体的同时检测、或单一抗体的检测、或同时完成几种抗体的检测。

进一步，所述检测过程中所有反应可在96孔滤板上或在微量离心管中进行。

进一步，本方法采用生物素标记的SPA作为捕获抗体，并且其与各包被捕获抗原的编码微球组合组成间接法检测体系。

进一步，包被各种所述编码微球的各捕获抗原用量为0.01～300μg /1.25×10⁶个编码微球。

进一步，标记检测抗体SPA的所述生物素为羧基活性的生物素，2mg/mL生物素化的检测二抗Bioin-SPA以1：2500稀释作为检测物进行检测。

一种采用上述液相芯片定量检测血清样品中土拉菌抗体、登革病毒热抗体的方法，具体为：

1）加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比系列稀释；

2）将系列稀释样品在液相芯片系统中检测读取对应荧光值MFI；

3）制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应标准曲线；

4）用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；

5）根据剂量-反应曲线可判定方法的动态检测范围，未知浓度样品可根据剂量-反应方程判断检测样品的浓度。

液相芯片的基本原理是利用聚苯乙烯（polystyrene）所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.6μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。液相芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

本发明的液相芯片及其检测方法，能够灵活的检测，其可以实现单一检测血清样品中的单一抗体，也可以同时完成血清样品中几种抗体的检测。本发明人经过大量试验和深入的研究，对高通量检测东方马脑炎病毒抗体、西尼罗病毒抗体、黄热病毒抗体、土拉菌抗体、登革病毒抗体、禽流感病毒抗体、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病原体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体的液相芯片制备及其检测条件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点：

1、抗原包被量的改进

抗原的包被量是成功检测的关键，本发明对包被微球的抗原包被量进行实质性优化使对血清样本的检测效果非常良好，并且包被液相芯片所需的抗原包被量很低，本发明的抗原包被量为0.01μg～300μg/1.25×10⁶个微球，即0.04 ng～1200ng/5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为1μg～10μg /测试。

2、生物素标记的改进

通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗体连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG（分子量150,000）1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μL。

3、检测的灵敏度及动态范围

本发明高通量检测十二种病原体抗体的液相芯片系统检测登革病毒2型抗体的检测灵敏度为6.3ng/mL，并且液相芯片系统的动态检测范围为11.96ng /mL~3062.5ng/ mL；对土拉fopA抗体的检测灵敏度为17.1ng/mL，并且液相芯片系统的动态检测范围为86.33ng/mL ~88400ng/mL。

4、方法的特异性

本发明通过选用东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原、西尼罗E蛋白抗原、黄热E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革热E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次体120C蛋白抗原、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原、Q热立克次体coml蛋白抗原、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原、马秋波GP2蛋白抗原、西部马脑炎病毒E1C蛋白抗原为包被抗原，分别以东方马脑炎病毒抗体、鼠抗西尼罗E蛋白血清、兔抗黄热E蛋白血清、兔抗土拉fopA蛋白抗体、登革2型抗体、禽流感病毒血清、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病原体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体、兔血清、大鼠血清、小鼠血清、BSA为待测样品，以生物素化的SPA为捕获抗体。

5、样品的检测能力

本发明评价了液相芯片方法对人血清的检测能力。通过对人血清的检测，初步证实了该方法在检测人血清中东方马脑炎病毒抗体、西尼罗病毒抗体、黄热病毒抗体、土拉菌抗体、登革病毒抗体、禽流感病毒抗体、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病毒体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体的实用性。

附图说明

图1为液相芯片方法检测十二种病原抗体示意图；

图2为液相芯片方法检测兔抗土拉抗体剂量-反应标准曲线图； 

图3为液相芯片检测土拉抗体柱形图；

图4为液相芯片方法检测兔抗登革病毒2型抗体剂量-反应标准曲线图；

图5为液相芯片检测登革病毒2型抗体柱形图。

具体实施方式

如图1至图5所示，本发明涉及一种高通量检测东方马脑炎病毒抗体、西尼罗病毒抗体、黄热病毒抗体、土拉菌抗体、登革病毒抗体、禽流感病毒抗体、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病原体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体共十二种病原抗体的液相芯片制备方法、检测及定量方法通过下面的具体实施方式作进一步说明，但本发明不以任何方式受该实施例的限定。  

一、材料

1. 液相芯片的相关缓冲液：

（1）PBS缓冲液（pH7.4）：NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na₂HPO₄ 10mmol/L；KH₂PO₄ 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在121℃高压灭菌20分钟，或过滤除菌，保存于室温。

（2）微球清洗液：PBS（pH7.4），0.05% Tween-20。

（3）微球活化缓冲液100 mM NaH₂PO₄：3g NaH₂PO₄, 5M NaOH 1.5 mL，定容于250mL，pH 6.2。

（4）微球包被缓冲液0.05 M MES, pH 5.0：2.44 g MES，5M NaOH 0.15 mL，定容于250mL。 

（5）微球保存液PBS-TBN：PBS，0.1%BSA，0.02% Tween-20，0.05%叠氮化物，pH 7.4。

（6）微球封闭液PBS-BN：PBS，1%BSA，0.05%叠氮化物，pH7.4。

（7）检测缓冲液：PBS，1%BSA，pH7.4。

（8）抗体稀释液PBS，pH7.4。。

（9）微球稀释液：PBS，1%BSA，pH7.4。

（10）样品稀释液PVX：PBS，0.5% PVA，0.8% PVP；

（11）SA-PE稀释液：PBS（pH7.4），1%BSA。

2. 抗原与抗体

本发明所使用的抗原为东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原、西尼罗E蛋白抗原、黄热E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革热E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次体120C蛋白抗原、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原、Q热立克次体coml蛋白抗原、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原、马秋波GP2蛋白抗原、西部马脑炎病毒 E1C蛋白抗原，其中禽流感H5蛋白可购自中国农科院哈尔滨兽医研究所，其余可购自中国检验检疫科学研究院。

本发明所使用检测抗体为兔抗土拉IgG，可购自中国检验检疫科学研究院，兔抗登革病毒2型抗体可购自军事医学科学研究院微生物研究所，检测二抗为生物素化SPA，所述的SPA可购自Sigma公司。

二、待测样品的制备

1、目标分析物样品的制备

目标分析物为兔抗土拉IgG、兔抗登革病毒2型抗体。兔抗土拉IgG的储备液浓度为44.2μg/mL，兔抗登革病毒2型抗体的储备液浓度为1.06mg/mL。

将待分析的兔抗土拉IgG、、兔抗登革病毒2型抗体用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。 

2、人血清样本的处理

将人血清样本用样品稀释1：10稀释，例如人血清样本5μL加样品稀释液50μL混匀后，作为待检样品进行液相芯片方法的检测。

（一）检测十二种病原抗体的液相芯片的制备

1、捕获抗原包被编码微球

本发明采用的011号、025号、027号、028号、031号、032号、033号、034号、043号、044号、061号、071号编码微球购自美国Bio-Rad公司，011号编码微球用于标记可以捕获东部马脑炎病毒抗体的东部马脑炎抗体病毒E1C蛋白抗原、025编码微球用于标记可以捕获黄热病毒抗体的黄热E蛋白抗原，027号编码微球用于标记可以捕获西尼罗病毒抗体的西尼罗E蛋白抗原，028号编码微球用于标记可以捕获土拉菌抗体的土拉fopA蛋白抗原，即利用土拉fopA蛋白包被微球；031号编码微球用于标记可以捕获登革病毒抗体的登革E2蛋白抗原，即利用登革E2蛋白包被微球；032号编码微球用于标记可以捕获禽流感病毒抗体的禽流感H5蛋白抗原，即利用禽流感H5蛋白包被微球；033号编码微球用于标记可以捕获普氏立克次体抗体的普氏立克次体120C蛋白抗原，即利用普氏立克次体120C蛋白包被微球；034号编码微球用于标记可以捕获蜱传脑炎病毒抗体的蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原，即利用蜱传脑炎病毒E-D3包被微球；043号编码微球用于标记可以捕获Q热立克次体抗体的Q热立克次体coml蛋白抗原，即利用Q热立克次体coml包被微球；044号编码微球用于标记可以捕获委内瑞拉马脑炎病毒抗体的委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原，即利用委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白包被微球；061号编码微球用于标记可以捕获马秋波抗体的马秋波GP2蛋白抗原，即利用马秋波GP2蛋白包被微球；071号编码微球用于标记可以捕获西部马脑炎病毒抗体的西部马脑炎病毒E1C蛋白抗原，即利用西部马脑炎病毒 E1C蛋白包被微球。

A、编码微球的活化  

分别取100μL（含1.25×10⁶个）各个编号的编码微球到1.5mL离心管中，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球活化缓冲液，接着先加入10μL新鲜配置的EDC（50mg/mL），再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20分钟。加入150μL的PBS（pH7.4），震荡后，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的PBS（pH7.4）悬浮编码微球。

B、用抗原包被编码微球

取各捕获抗原1～200μg分别加入到活化后的各对应编码微球中，用PBS缓冲液定容至500μL，室温震摇2小时。14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000×g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的微球保存液洗涤编码微球，16000×g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，于4℃避光保存备用。

C、包被微球的计数

吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm；1/400mm²)在普通显微镜下计数。根据公式（4个大格数平均数×10⁴×稀释倍数×体积（mL））计算微球数量。

2、检测物标记生物素

A、生物素的标记

分别配制好浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加入到待标记物溶液中，在室温震摇30分钟（或冰上2小时），过柱脱盐后分装，-20℃冻存备用。

B、抗体的用量

以标记2 mg/mL的IgG（分子量150,000）1 mL溶液为例，需加入10 mM生物素溶液约27 μl。  

（二）液相芯片制备方法条件的优化

1、微球包被抗原包被量的选择

分别以1μg、2.5μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg、15μg、20μg、25μg、30μg、40μg、50μg的量包被100μL编码微球。经检测效果比较，以1～50μg /1.25×10⁶个微球，即0.4～200ng/5000个微球/测试，包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。如图1所示，东部马脑炎病毒E1C蛋白包被011编码微球、西尼罗E蛋白包被025编码微球、黄热E蛋白包被027号编码微球、土拉fopA蛋白包被028号编码微球、登革病毒E2蛋白包被031号编码微球、禽流感H5蛋白包被032号编码微球、普氏立克次体120C蛋白包被033号编码微球、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白包被034号编码微球、Q热立克次体coml蛋白包被043号编码微球、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白包被044号编码微球、马秋波GP2蛋白包被061号编码微球、西部马脑炎病毒 E1C蛋白包被071号编码微球均落在其正确检测区域内，并且获得高信噪比结果（MFI值远大于2000），说明优化的液相芯片检测系统可成功用于东方马脑炎病毒抗体、西尼罗病毒抗体、黄热病毒抗体、土拉菌抗体、登革病毒抗体、禽流感病毒抗体、普氏立克次体病原体抗体、蜱传脑炎病毒抗体、Q热立克次体病原体抗体、委内瑞拉马脑炎病毒体抗体、马秋波病毒抗体、西方马脑炎病毒抗体的检测。

2、生物素化检测物的优化

本发明分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼（hydrazide）-生物素和羧基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体，经质控过程检测效果比较，本实验中Sulfo-NHS-生物素标记检测物检测效果较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或按照制造商的产品说明书所述的方法。

本发明人经过试验验证，2mg/mL生物素化的检测物Biotin-SPA以1：2500稀释作为检测人血清中抗体的检测物，检测结果显示生物素化检测物Biotin-SPA可获得高检测值和低背景值的检测效果。

（三）液相芯片样品制备、检测及结果判定

1、待测样品制备

用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行液相芯片检测。

2、样品的检测及结果判定

检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下：

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化检测物，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL的检测缓冲液，经涡旋振荡使微球重悬；

6)用液相芯片系统读取MFI数值并分析数据。

3、检测结果判定

根据试验研究结果与相关研究报道，本发明定义液相芯片方法检测抗体的最低检出限（LOD值）为检测荧光强度临界值（Cutoff）对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品（Blank）荧光检测信号MFI均值加3倍标准差（SD），即Cutoff值为＝MFI（空白对照）+3倍标准差。若检测结果高于LOD对应荧光强度值则判定为待测抗体检测结果阳性；若检测结果低于LOD对应荧光强度值则判定为待测抗体检测结果阴性。

（四）液相芯片定量检测兔抗土拉IgG模型的建立

1 、兔抗土拉IgG标准曲线样品制备

用样品稀释液将兔抗土拉IgG标准品由浓度为353.6μg /mL以4倍倍比梯度稀释至浓度为21.58ng/mL成系列浓度样品。

2 、剂量-反应标准曲线的绘制

按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据液相芯片系统检测结果绘制剂量-反应标准曲线（如图2所示）。其中，X轴代表样品浓度，Y轴代表液相芯片仪检测的荧光值（MFI）。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定，图2中兔抗土拉抗体的浓度分别为： S7：88400ng/mL，S6：22100ng/mL，S5：5525ng/mL，S4：1381.25ng/mL，S3：345.3ng/mL，S2：86.33ng/mL，S1：21.58ng/mL

液相芯片系统根据检测结果拟合兔抗土拉IgG剂量-反应标准曲线方程：FI = -7.90067 + (13503.2 + 7.90067) / [1 + (Conc / 2990.24)^-1.45764]^0.835078

3、液相芯片检测兔抗土拉IgG的灵敏度和动态范围

根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即液相芯片方法检测兔抗土拉IgG的灵敏度为：17.1ng/mL（Cutoff = 16，MFI(空白对照)=13, 标准差=1）。 

本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着兔抗土拉IgG浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当兔抗土拉IgG浓度超过88400ng/mL时，抗原抗体的免疫反应达到饱和状态，MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再检测。

因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即液相芯片定量检测兔抗土拉IgG的动态范围为86.33 ng/mL ~88400ng/mL。

4、液相芯片检测兔抗土拉IgG各编码微球的荧光值

以兔抗土拉抗体浓度为横坐标，各编码微球检测所得的荧光值为纵坐标，不同编码微球为Z轴，绘制液相芯片检测兔抗土拉抗体柱形图，见图3。从图中可以看出在兔抗土拉抗体浓度为88.4μg/ml和353.6μg/ml时与044号微球包被的委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白和034号微球包被蜱传脑炎病毒E-D3蛋白的有轻微交叉反应，其他均无交叉，其特异性较好。

（五）液相芯片定量检测兔抗登革病毒2型抗体模型的建立

1、兔抗登革病毒2型抗体标准曲线样品制备

用样品稀释液将兔抗登革病毒2型抗体标准品由浓度为0.053mg /mL以4倍倍比梯度稀释至浓度为2.99ng/mL成系列浓度样品。

2、剂量-反应标准曲线的绘制

按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据液相芯片系统检测结果绘制剂量-反应标准曲线（如图4所示）。其中，X轴代表样品浓度，Y轴代表液相芯片仪检测的荧光值（MFI）。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定，图4中兔抗登革病毒2型抗体的浓度分别为：S8：53000ng/mL，S7：12250ng/mL，S6：3062.5ng/mL，S5：765，625ng/mL，S4：191.4ng/mL，S3：47.85ng/mL，S2：11.96ng/mL，S1：2.99ng/mL。

液相芯片系统根据检测结果拟合兔抗登革病毒2型抗体剂量-反应标准曲线方程：

FI = -1.11965 + (7271.51 + 1.11965) / [1 + (Conc / 64.8821)^-1.28737]^1.99744

3、液相芯片检测兔抗登革病毒2型抗体的灵敏度和动态范围

根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即液相芯片方法检测兔抗登革病毒2型抗体的灵敏度为：6.3ng/mL（Cutoff = 18，MFI(空白对照)=15, 标准差=1）。 

本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着兔抗登革病毒2型抗体浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当兔抗登革病毒2型抗体浓度超过3062.5ng/mL时，抗原抗体的免疫反应达到饱和状态，MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再检测。

因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即液相芯片定量检测兔抗登革病毒2型抗体的动态范围为11.96ng/mL/mL~3062.5ng/mL。

4、液相芯片检测兔抗登革病毒2型抗体各编码微球的荧光值

以兔抗登革病毒2型抗体浓度为横坐标，各编码微球检测所得的荧光值为纵坐标，不同编码微球为Z轴，绘制液相芯片检测兔抗登革病毒2型抗体柱形图，见图5。

（六）人血清样品的检测

1、人血清样品的准备

将人血清用样品稀释液1：10稀释（人血清样本5μL加样品稀释液50μL混匀）后用于液相芯片检测。

2、人血清样品的检测

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50 μL待检测人血清样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50 μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化SPA，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL 的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL 的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用液相芯片系统读取MFI数值。

经过多次重复试验，生物素化SPA 稀释比例选用1：2500稀释，SA-PE稀释比例选用1：300稀释，经过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值与其标准差的3倍之和为作为判断阴阳性的界值，即Cutoff值，待检测血清中各编码微球检测对应抗体的MFI值如果大于其Cutoff值，即血清中的对应抗体浓度过高，可视为对应抗体阳性可能被相应病原微生物感染，如果MFI值小于对应Cutoff值，即血清中的相应抗体浓度低于正常值可判断为相应抗体阴性，未感染相应病原微生物或是隐性携带者。

Claims (10)

1.    一种高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片，其特征在于，该液相芯片包括：包被有捕获抗原的十二种编码微球、生物素标记的二抗作为捕获抗体、链亲和素-藻红蛋白及相关缓冲溶液，其中，作为捕获抗原的有东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原、西尼罗E蛋白抗原、黄热E蛋白抗原、土拉fopA蛋白抗原、登革热E2蛋白抗原、禽流感H5蛋白抗原、普氏立克次体120C蛋白抗原、蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原、Q热立克次体coml蛋白抗原、委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原、马秋波GP2蛋白抗原、西部马脑炎病毒E1C蛋白抗原。

2.如权利要求1所述的高通量检测血清样本中十二种病原抗体的液相芯片，其特征在于，所述编码微球优选011、025、027、028、031、032、033、034、043、044、061和071号编码微球，其中，

011编码微球用东部马脑炎病毒E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

025编码微球用西尼罗E蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

027号编码微球用黄热E蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

028号编码微球用土拉fopA蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

031号编码微球用登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

032号编码微球用禽流感H5蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

033号编码微球用普氏立克次体120C蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

034号编码微球用蜱传脑炎病毒E-D3蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

043号编码微球用Q热立克次体coml蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

044号编码微球用委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

061号编码微球用马秋波GP2蛋白抗原作为捕获抗原来包被、

071号编码微球用西部马脑炎病毒 E1C蛋白抗原作为捕获抗原来包被。

3.一种如权利要求1所述液相芯片的制备方法，其特征在于，该方法具体为：在相关缓冲溶液中，用不同的十二种抗原分别包被十二种编码微球，用生物素标记的二抗为羊抗人IgG或/和Biotin-SPA，用链亲和素-藻红蛋白SA-PE作为信号检测物。

4.              一种利用如权利要求1所述液相芯片高通量检测血清样品中抗体的间接免疫学定量非诊断性检测方法，其特征在于，该方法具体为：

1）在相关缓冲溶液中，将十二种蛋白抗原作为捕获抗原来包被编码微球；

2）向检测载体内加入含十二种已包被捕获抗原编码微球的工作溶液、或单一包被捕获抗原编码微球的工作溶液、或几种已包被捕获抗原编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

3）加入待测血清样品，孵育后清洗；

4）加入用生物素化的二抗，孵育后清洗；

5）加入链亲和素-藻红蛋白，孵育后清洗；

6）加入检测缓冲液后混合均匀；

7）用液相芯片系统读取平均荧光强度MFI数值，并分析数据判定检测结果，以完成血清样品中十二种抗体的同时检测、或单一抗体的检测、或同时完成几种抗体的检测。

5.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测过程中所有反应可在96孔滤板上或在微量离心管中进行。

6.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述步骤1）中采用生物素标记的SPA作为捕获抗体，并且其与各包被编码微球的捕获抗原组合组成间接法检测体系。

7.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。

8.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述生物素标记的二抗优选为Biotin-羊抗人和/或Biotin-SPA。

9.如权利要求4所述的非诊断性检测方法，其特征在于，包被各种所述编码微球的各捕获抗原用量为0.01～300μg /1.25×10⁶个编码微球，标记检测抗体SPA的所述生物素为羧基活性的生物素，2mg/mL生物素化的检测二抗Bioin-SPA以1：2500稀释作为检测物进行检测。

10.一种采用如权利要求1所述液相芯片定量检测血清样品中土拉抗体、登革热抗体的非诊断性方法，其特征在于，该方法具体为：

1）加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比系列稀释；

2）将系列稀释样品在液相芯片系统中检测读取对应荧光值MFI；

3）制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应标准曲线；

4）用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；

5）根据剂量-反应曲线可判定方法的动态检测范围，未知浓度样品可根据剂量-反应方程判断检测样品的浓度。

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