CN101498733A - 一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片制备及其检测方法，所述的病原体包括鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)、蓖麻毒素(ricin)和重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS－CoV)。通过大量试验证明：蛋白质悬浮芯片制备方法简便、快捷；检测效果快速、准确、灵敏度高、检测范围宽、特异性强；对于实际环境样品适用性好。同时本发明为建立多功能、多指标、高通量、标准化的病原体复合检测要求奠定了基础。

Description

一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片及其制备方法和检测方法

技术领域

本发明涉及一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片制备及其检测方法，所述的病原体包括细菌、细菌芽孢、细菌毒素、植物毒素和病毒，分别选以鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxinB，SEB)、蓖麻毒素(ricin)和重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)为代表。

背景技术

进入20世纪以后，生物威胁有增无减。1996年日本EHEC 0157：H7疫情、2003年全球SARS疫情、2001年美国炭疽邮包事件、1995年美国明尼苏达州蓖麻毒素事件等，人类面临生物威胁的事例多不胜数。人为生物恐怖事件随时有发生的可能，更引起人们对生物威胁的恐惧。而新发传染病种类繁多，生物恐怖因子多种多样，包含细菌、病毒、毒素等，威胁人类健康的生物因子至少有30多种。由于针对不同病原体袭击的防护和处理各不相同，一线工作者既要保护自身安全，也要做到科学处置，因此病原体的快速鉴定识别是应对生物威胁的首要任务。

目前，基于微生物学、化学、分子生物学和免疫学理论发展起来的病原体快速检验方法可以分别对环境样本中的生物威胁因子进行定性和定量检测。定性检测技术有常规的分离培养、血清学方法等，鉴定结果虽然准确可靠，但耗时长，每次只能确定或排除一种病原微生物，往往延误紧急突发公共卫生事件的处置。快速检测技术主要是以病原体遗传物质核酸为基础的检测方法如核酸分子杂交、PCR、多重PCR等，和基于病原体核酸或抗原检测的生物传感器技术，如光纤传感器、电化学传感器、上转换磷光生物传感器、纳米传感器等。其中，利用多重PCR方法进行单一或多种致病菌的试验屡有报道。微生物定量检测方法包括常规的平板法、最大可能数(MPN)法、细胞计数法和阻抗计法等，也存在耗时长，每次只能对一种病原体进行定量检测的缺陷；微生物定量检测的新技术主要是实时定量PCR，近年来在多种病原微生物的定量检测中得到广泛应用，但缺陷是只能检测病原菌的核酸，不能检测毒素蛋白。

炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是引起人兽共患病-炭疽的病原菌，为革兰氏阳性可形成芽孢的需氧菌，芽孢可以通过呼吸道、消化道、皮肤接触感染人类，一般在接触后7天出现感染症状，以皮肤型炭疽最常见。吸入大量炭疽芽孢(大于8000个)可引起吸入型炭疽，也称肺炭疽。由于炭疽芽孢具有对外界环境极强的抵抗力，致污染可持续存在，在军事上一直被列为是头号生物战剂之一。在一些国家曾生产并作为武器储存，而今又成为恐怖袭击选用剂，对人类造成新的更大的威胁。炭疽芽孢杆菌的抗原包括菌体抗原和芽孢抗原。炭疽芽孢杆菌的生存、增殖不需特殊条件设备及环境，在土壤中就可增殖，人工大量培养及使之变为芽孢十分容易。由于芽孢独特的生物学性状和危害，对炭疽芽孢的快速定量检测意义重大。本发明选择炭疽芽孢作为产芽孢的细菌及其芽孢的代表建立悬浮芯片检测模型。

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)可引起动物疫源性烈性传染病-鼠疫，其天然宿主是啮齿类动物。鼠疫往往是由于接触带菌的啮齿类动物或被染菌的蚤类叮咬而发病。历史上记载过三次鼠疫的世界性大流行，造成人类生命和财产的巨大损失。在我国鼠疫被列为甲类传染病。作为一种烈性传染病，鼠疫具有传播快、病死率高等特点，是经典的生物战剂。目前，以生物武器形式出现的鼠疫最有可能发生的是肺鼠疫，该病人间传播更为迅速。鼠疫菌的快速检测对控制鼠疫的扩散蔓延至关重要。本发明选择鼠疫菌作为细菌的代表建立检测模型。

蓖麻毒素(ricin toxin，以下简称ricin)是蓖麻籽中含有的一种高毒性的糖蛋白，蓖麻毒素经呼吸道吸入、消化道摄入和肌肉注射均可致人中毒。人经口致死量0.15-0.2g，静脉注射致死量20mg，小鼠腹腔LD50约为3.0μg/kg。ricin毒性大，性质稳定，来源较广，提取成本低廉。随着多个恐怖组织和极端分子研制和使用蓖麻毒素的消息接连进入媒体，这种致命的、毒性极强的生物毒素被美国等国列为最有可能被用做恐怖袭击的生物恐怖因子。在蓖麻毒素的快速侦检方面，美国、欧盟等国家一直十分重视，已建立了供实验室和现场使用的方法：如酶联免疫吸附试验(ELISA)、化学分析技术、生物传感器技术以及胶体金免疫层析方法等；我国台湾地区也建立了检测蓖麻毒素的ELISA和胶体金免疫层析方法及其配套诊断试剂。建立蓖麻毒素的快速定量试剂具有重要现实意义。同时，本发明选择ricin作为植物毒素的代表建立检测模型。

金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)是引起食物中毒的主要致病因素，也是重要的生物恐怖战剂。SEB的检测研究在平时和战时都有重要意义。本发明选择SEB作为细菌毒素的代表建立检测模型。

重症急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)引起本世纪第一种在全球暴发的烈性传染病，SARS引起的恐慌至今人们仍记忆犹新。SARS-CoV为单股正链RNA病毒，属巢状病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属。根据血清型，冠状病毒属主要分为3个型，包括多种哺乳动物冠状病毒和鸟感染性支气管炎病毒。虽然2002年爆发的SARS已被成功控制，但由于病毒的变异及其高度的传染性，SARS存在着再度复发的可能，因此对SARS的研究不容忽视。发明选择SARS-CoV作为病毒的代表建立检测模型。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquidchip)，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

目前发展的悬浮芯片技术应用于病原微生物和毒素的检测研究主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够同时检测多种类病原体，是否适合从粉末、液体等环境样品中快速直接检测，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。本发明选择鼠疫菌、炭疽芽胞杆菌、SEB、ricin、SARS-CoV为代表病原体和生物威胁因子，建立包括细菌、细菌芽胞、病毒、细菌毒素、植物毒素在内的几种重要生物恐怖因子的多病原体蛋白悬浮芯片的复合检测方法，评价其敏感性与特异性；并应用于人工污染的包括如奶粉、面粉、淀粉、果珍等粉末样品中的直接检测，评价其在实际检测中的适用性。

发明内容

本发明提供一种复合检测不同种类病原体的蛋白质悬浮芯片。

本发明还提供一种复合检测鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞杆菌芽孢、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、蓖麻毒素(ricin)、重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)中的一种或多种病原体或生物恐怖因子的蛋白悬浮芯片检测方法。

本发明提供一种制备上述复合检测鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞、SEB、ricin、SARS-CoV中的一种或多种病原体或生物恐怖因子的蛋白悬浮芯片的制备方法，包括：不同编号的编码微球、不同病原体的特异性捕获抗体、生物素标记的不同病原体的特异性检测抗体、荧光染料链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)及相关缓冲溶液。

本发明还提供一种复合检测不同种类病原体的蛋白质悬浮芯片检测方法，其特征在于，该方法采用双抗体夹心免疫学检测模式，检测过程中全部反应可在96孔滤板上进行也可在微量离心管中进行。包括下列步骤：(1)每孔加入含已包被目标病原体捕获抗体的编码微球工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入检测样品，孵育后清洗；(3)加入生物素化目标病原体检测抗体，孵育后清洗；(4)加入SA-PE，孵育后清洗，(5)加入检测缓冲液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取FMI数值(平均荧光强度)并分析数据判定检测结果。

本发明人通过大量和深入的研究，开创性开发出本发明的一种复合检测不同种类病原体的蛋白质悬浮芯片及其检测方法，具有以下优点：

(1)高通量、多种类病原体检测；

(2)蛋白质悬浮芯片制备方法简单、快速；

(3)具有高敏感度和宽动态范围；

(4)对粉末状环境样品中目标病原体的检测具有很好的适用性；

(5)具有高特异性；

(6)为进一步将所述蛋白悬浮芯片应用于其他细菌、细菌芽孢、细菌毒素、植物毒素、病毒等建立技术模型。

附图说明

图1：复合检测方法的特异性测试结果1；X轴表示样品编号，Y轴表示检测项目，Z轴表示检测荧光信号MFI。白色代表鼠疫菌检测，斜纹代表炭疽芽孢检测，横纹代表蓖麻毒素检测，灰色代表SEB检测，网点代表SARS-CoV检测。X1：空白(PB)，X2：10⁵cfu/mL鼠疫菌，X3：10⁵cfu/mL炭疽芽孢，X4：50ng/mL SEB，X5：蓖麻毒素100ng/mL，X6：200ng/mLSARS-CoV。为了图示的视觉平衡，SARS-CoV的表示信号为实测MFI的1/5。

图2：复合检测方法的特异性测试结果2示意图；X轴表示样品编号，Y轴表示检测项目，Z轴表示检测荧光信号MFI。系列图案代表项目见图注。X1：空白(PB)，X2：10⁵cfu/mL炭疽芽孢+50ng/mL SEB+100ng/mL蓖麻毒素+200ng/mL SARS-CoV，X3：10⁵cfu/mL鼠疫菌+10⁵cfu/mL炭疽芽孢50ng/mL SEB+100ng/mL蓖麻毒素，X4：10⁵cfu/mL鼠疫菌+10⁵cfu/mL炭疽芽孢+50ng/mL SEB+200ng/mL SARS-CoV，X5：10⁵cfu/mL鼠疫菌+50ng/mL SEB+100ng/mL蓖麻毒素+200ng/mLSARS-CoV，X6：10⁵cfu/mL鼠疫菌+10⁵cfu/mL炭疽芽孢+100ng/mL蓖麻毒素+200ng/mL SARS-CoV。为了图示的视觉平衡，SARS-CoV的表示信号为实测MFI的1/3。

具体实施方式

本发明对涉及的复合检测鼠疫耶尔森菌、炭疽芽胞、SEB、ricin、SARS-CoV的蛋白质悬浮芯片、其制备方法、检测方法通过下面的具体实施方式并模拟环境样品检测作进一步说明，但本发明不以任何方式受这些具体实施方式的限定。

一、材料

1.抗原抗体

表1 蛋白质悬浮芯片多元复合检测体系中目标分析物所涉及抗原抗体

 

目标分析物	捕获抗体	检测抗体
			鼠疫菌	兔抗鼠疫F1抗原的抗体	兔抗鼠疫F1抗原单抗
炭疽芽孢	羊抗炭疽芽孢	兔抗炭疽芽孢
			SEB	鼠抗SEB	兔抗SEB
蓖麻毒素	兔抗蓖麻毒素A	鼠抗蓖麻毒素
			SARS-CoV	兔抗SARS-CoV N32	兔抗SARS-CoV N13

2.相关缓冲液

(1)0.03M PB缓冲液(pH7.2)：2.83g Na₂HPO₄，1.36g KH₂PO₄定容至1L。

(2)0.01M PB缓冲液(pH7.2)：由0.03M PB缓冲液稀释而成。

(3)PBS缓冲液(pH7.4)：NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na₂HPO₄10mmol/L；KH₂PO₄ 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi(1.05kg/cm²)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。

(4)微球清洗液：PBS(pH7.4)，0.05％ TWEEN-20。

(5)微球活化缓冲液100mM NaH₂PO₄：3g NaH₂PO₄，5N NaOH 1.5mL，定容于250mL，pH 6.2。

(6)微球包被缓冲液0.05M MES，pH 5.0：2.44g MES，5N NaOH 0.15mL，定容于250mL。

(7)微球保存液PBS-TBN：PBS，0.1％BSA，0.02％ TWEEN，0.05％叠氮化物，pH7.4。

(8)微球封闭液PBS-BN：PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4。

(9)检测缓冲液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(10)抗体稀释液：0.01mmol/L PB(pH7.2)。

(11)微球稀释液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(12)样品稀释液：0.01M PB，pH7.2。

(13)生物素化抗体稀释液：PBS-TBN(PBS，0.1％BSA，0.02％ TWEEN-20，0.05％NaN₃，pH7.4)。

(14)SA-PE稀释液：PBS(pH7.4)，1％BSA。

二、待测样品的制备

1.单组分分析样品的制备

鼠疫菌储备液浓度为10⁸cfu/mL，炭疽芽孢储备液浓度为10⁷cfu/mL，蓖麻毒素、SEB、SARS-CoV N蛋白的储备液浓度均为1mg/mL。毒素和蛋白质样品在临用前稀释。菌悬液的浓度范围为10¹-10⁸cfu/mL，芽孢的浓度范围为10²-10⁷cfu/mL，毒素和蛋白质的浓度范围为10pg/mL-5μg/mL。待分析的细菌用PB稀释成10倍不同梯度，毒素及蛋白质用PB稀释成4倍不同梯度，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。

2.混合样品的制备

混合样品包含炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoV N蛋白、蓖麻毒素和SEB其中的两种到五种，分别自相应的储备液用样品稀释液稀释、混合配制。混合样品包括病原体多重测试的样品，各种组分含量不同、比例不同，随机组合。

3、模拟污染样品的制备

分别将0.5g奶粉、玉米淀粉、小麦面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL样品稀释液(PB缓冲液)中，将不同浓度的炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB的其中一种或几种，掺入到粉末样品中，经充分振摇混匀，静置2h以上，使目标分析物与模拟白色粉末充分吸附。再用脱脂棉、薄滤纸、厚滤纸、0.45μm滤膜滤纸过滤或低速离心(1000rpm，1min)后，上清液作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。

4、盲样的制备

抽取制备的单分析物样品、混合样品和不同介质中模拟污染样品共46份，打乱顺序和编号，作为盲样进行检测。盲样包括空白或其它干扰样品8份，含测试物的样品38份，其中样品处理液中单因子分析物11份，混合样品13份；模拟污染样品14份(含5份混合样品)。

实施例1、蛋白质悬浮芯片的制备

A、编码微球的活化

选取5种微球分别标记鼠疫菌抗体(028号)、炭疽芽孢抗体(025号)、SEB抗体(043)、蓖麻毒素抗体(027)、SARS-CoV N蛋白抗体(044号)，取100μL(1.25×10⁶个)编码微球到1.5mL离心管中，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球活化缓冲液，接着先加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)，在室温震摇20分钟。加入150μL的PBS(pH7.4)，震荡后，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球。

B、抗体包被编码微球

分别取各目标检测物捕获抗体(如表1所示)各10μg加入到活化后的编码微球中，用PBS缓冲液定容至500μL，室温震摇2小时。14000g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的微球保存液洗涤编码微球，16000g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，于4℃避光保存备用。

C、包被微球的计数

分别取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm；1/400mm²)在普通显微镜下计数。根据公式(每个大格数×10⁴×稀释倍数×体积(mL))计算微球数量。

D.检测抗体的生物素化

配制浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记各目标检测物检测抗体溶液(如表1所示)，将计算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分装，-20℃冻存备用。

抗体用量计算过程如下：

以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μ1。

$1\mathrm{ml\; lgG}\×\frac{2\mathrm{mg\; lgG}}{1\mathrm{ml\; lgG}}\×\frac{1\mathrm{m\; mol\; lgG}}{\mathrm{150,000}\mathrm{mg\; lgG}}\×\frac{20\mathrm{mmol\; Biotin}}{1\mathrm{m\; mol\; lgG}}=0.000266\mathrm{m\; mol\; Biotin}$

$0.000266\mathrm{mmol\; Biotin}\×\frac{\mathrm{1,000,000}\mathrm{\μl}}{L}\×\frac{L}{10\mathrm{mmol}}=26.6\mathrm{\μlBiotin\; Reagent}$

其中，biotin为生物素。

实施例2、目标病原体的灵敏度与动态检测范围的改进

A.待测样本制备

分别将鼠疫菌储备液(10⁸cfu/mL)和炭疽芽孢储备液(10⁷cfu/mL)用PB10倍倍比稀释为系列浓度梯度样品，蓖麻毒素、SEB、SARS-CoVN蛋白(储备液1mg/mL)用PB4倍倍比稀释为系列浓度梯度样品。使鼠疫菌悬液的浓度范围为10¹～10⁸cfu/mL，炭疽芽孢的浓度范围为10²～10⁷cfu/mL，蓖麻毒素、SEB、和SARS-CoV N蛋白质的浓度范围为10pg/mL～5μg/mL。

B.样品的检测

检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下：

(1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

(2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

(3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

(4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

(5)加入125μL的检测缓冲液，经振摇重悬混匀；

(6)用悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。

3、目标病原体检测灵敏度与检测范围的确定

蛋白质悬浮芯片检测方法的最低检出限(LOD值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即Cutoff值为＝MFI_Blank+3×SD。若检测结果高于LOD对应荧光强度值则判定为目标检测物检测结果阳性；若检测结果低于LOD对应荧光强度值则判定为目标检测物检测结果阴性。最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度，即随样品浓度增加检测所得MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再检测。因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定蛋白质悬浮芯片检测目标病原体的灵敏度与动态检测范围，检测结果如表3所示。

表3 蛋白质悬浮芯片方法检测五种病原体的灵敏度

结论，本发明所述的蛋白质悬浮芯片对上述五种病原体的检测灵敏度和检测范围相对于ELISA方法有显著改进。

实施例3、复合检测目标病原体的特异性测试

在悬浮芯片多重检测方法特异性实验中，选用与目标待测菌近缘的或环境常见的假结核菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌等菌株，以及BONT、HIV P24蛋白、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等毒素、病毒和蛋白质，考核所述的蛋白质悬浮芯片方法对样品检测的特异性。

捕获抗体工作液为五种编码微球按工作浓度混合均匀的混合物；阳性检测样品分别为鼠疫菌1.6×10⁴cfu/mL、炭疽芽孢1.36×10⁴cfu/mL、SEB75ng/mL、蓖麻毒素75ng/mL、SARS-CoV N蛋白256ng/mL。

生物素化检测抗体分别为：①生物素化抗体稀释液(blank)，②Biotin-兔抗FlAg 2F6/1:1000稀释，③Biotin-羊抗BA+170044/1:200稀释，④Biotin-RCA₂/1:200稀释，⑤Biotin-SEBpAb/1:200稀释，⑥Biotin-兔抗SARS-COV N蛋白/1:200稀释。

表4 蛋白质悬浮芯片方法对不同菌和蛋白质的测试结果

通过特异性测试(检测方法同实施例2)，结果显示(如表4所示)，在检测鼠疫菌、炭疽芽孢、SEB、蓖麻毒素、SARS-CoV的系统中，假结核耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌及其芽孢、覃状芽孢杆菌及其芽孢、枯草芽孢杆菌及其芽孢、巨大芽孢杆菌及其芽孢、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、禽流感病毒HA、禽流感病毒NH、AIDS病毒、酪蛋白、BSA、BONT、胰蛋白胨等MFI值与空白对照的MFI值均低于最低检出限对应MFI值，说明以上细菌、病毒、毒素及其它蛋白质均不与目标检测物发生交叉反应或非特异性反应。实验仅发现检测SEB时，与高浓度的金黄色葡萄球菌中毒性休克毒素(SEF或TSST-1)略有交叉反应，但与其他病原体没有交叉反应和非特异性反应。

图1实验结果显示，在多重检测体系中，加入目标分析物所对应的微球检测信号明显增高，其它微球荧光检测信号没有显著增强，或者相对于自身的本底荧光信号而言没有明显增高。图2实验结果显示，在多重检测体系中，加入多种目标分析物所对应的相应微球检测信号均明显增高，未加入目标分析物对应微球荧光检测信号没有显著增强，或者相对于自身的本底荧光信号而言没有明显增高，说明捕获抗体、检测抗体与目标检测物特异性结合，捕获抗体、检测抗体与非目标检测物之间不存在非特异性结合、无交叉反应。

综上特异性测试，证明各捕获抗体与其它检测抗体、各捕获抗体与其它检测物、各检测抗体与其它检测物之间均不存在交叉反应，检测具有很好的特异性。

实施例4、“白色粉末”盲样的检测

A.模拟污染“白色粉末”样品的制备

分别将0.5g奶粉、玉米淀粉、小麦面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL样品稀释液(PB缓冲液)中，将不同浓度的炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoVN蛋白、蓖麻毒素和SEB的其中一种或几种及空白样品(样品稀释液)，掺入到粉末样品中，经充分振摇混匀，静置2h以上，使目标分析物与模拟白色粉末充分吸附。

B.盲样的制备：

抽取制备的单分析物样品、混合样品和不同介质中模拟污染样品共46份，打乱顺序和编号，作为盲样进行检测。盲样包括空白或其它干扰样品8份，含测试物的样品38份，其中样品处理液中单因子分析物11份，混合样品13份；模拟污染样品14份(含5份混合样品)。

C.盲样的处理与检测

将待测样品按0.1g/mL溶解粉末样品，再用脱脂棉、薄滤纸、厚滤纸、0.45μm滤膜滤纸过滤或低速离心(1000rpm，1min)后，上清液作为待检样品按照实施例2中方法进行悬浮芯片方法的检测。

表5 蛋白质悬浮芯片盲样检测结果

检测结果如表5所示，46个盲样中的结果全部正确，充分证明了本发明所提供的蛋白质悬浮芯片多元目标检测物的复合检测方法可以快速、准确、高效检测出吸附于白色粉末样品中的目标检测物，本方法对于炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoV N蛋白、蓖麻毒素和SEB等病原体污染的“白色粉末”样品的实际检测工作具有很好的适用性。

Claims (9)

1、一种利用微球悬浮芯片复合检测炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoV N蛋白、蓖麻毒素和SEB多种类病原体中的一种或多种的检测方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤：

(1)向孔加入含已包被捕获抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

(2)加入待测样品，孵育后清洗；

(3)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；

(4)加入SA-PE，孵育后清洗；

(5)加入检测缓冲液后混匀；

(6)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(FMI)数值并分析数据判定检测结果。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：用于包被微球的捕获抗体分别为：鼠疫菌的捕获抗体为抗鼠疫菌抗体；炭疽芽孢的捕获抗体—抗炭疽芽孢抗体；SEB的捕获抗体为抗SEB抗体抗；蓖麻毒素的捕获抗体为抗蓖麻毒素A抗体；SARS-CoV N蛋白的捕获抗体为抗SARS-CoV N32抗体。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用生物素标记的检测抗体分别为：鼠疫菌的检测抗体为抗鼠疫菌抗体；炭疽芽孢的检测抗体为兔抗炭疽芽孢抗体；SEB的检测抗体为抗SEB抗体；蓖麻毒素的检测抗体为抗蓖麻毒素抗体；SARS-CoV的检测抗体为抗SARS-CoV N13抗体。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：捕获抗体与生物素标记的检测抗体组成双抗夹心检测体系进行病原体检测。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕获抗体用量为10μg/1.25×106个编码微球或20-40ng/2500-5000个微球/测试。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体的生物素为羧基活性的生物素。

7、如权利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗体工作液稀释倍数为1:50-1:5000稀释。

8、一种复合检测炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoV N蛋白、蓖麻毒素和SEB多种类病原体中的一种或多种的蛋白质微球悬浮芯片，其特征在于包括：编码微球、包被的捕获抗体、生物素标记的编码微球、链亲和素-藻红蛋白；用于包被微球的捕获抗体分别为：鼠疫菌的捕获抗体为兔抗鼠疫F1抗原抗体；炭疽芽孢的捕获抗体—羊抗炭疽芽孢抗体；SEB的捕获抗体为兔抗SEB单抗；蓖麻毒素的捕获抗体为兔抗蓖麻毒素A抗体；SARS-CoV N蛋白的捕获抗体为兔抗SARS-CoV N32抗体。

9、权利要求8的蛋白质微球悬浮芯片，其特征在于用生物素标记的检测抗体分别为：鼠疫菌的检测抗体为兔抗鼠疫F1抗原单抗2F6；炭疽芽孢的检测抗体为兔抗炭疽芽孢抗体；SEB的检测抗体为兔抗SEB多抗；蓖麻毒素的检测抗体为蓖麻毒素单抗RCA；SARS-CoV的检测抗体为SARS-CoV N13抗体。

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