CN108872598A - 一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒 - Google Patents

一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108872598A
CN108872598A CN201810745182.3A CN201810745182A CN108872598A CN 108872598 A CN108872598 A CN 108872598A CN 201810745182 A CN201810745182 A CN 201810745182A CN 108872598 A CN108872598 A CN 108872598A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seb
detection
aureus
enterotoxin
forms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810745182.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108872598B (zh
Inventor
律清宇
江华
姜永强
刘鹏
郑玉玲
孔德聪
赵俊清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN201810745182.3A priority Critical patent/CN108872598B/zh
Publication of CN108872598A publication Critical patent/CN108872598A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108872598B publication Critical patent/CN108872598B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。本发明提供的AlphaLISA检测试剂盒包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。本发明还提供了一种B型金葡菌肠毒素的检测方法，本发明提供的B型金葡菌肠毒素的检测方法是采用AlphaLISA技术检测B型金葡菌肠毒素。通过实验证明：本发明的B型金葡菌肠毒素的检测方法可以大大降低蛋白A的影响，且本发明的检测方法快速、准确、可靠，具有良好的应用前景。

Description

一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。
背景技术
SEB(B型金葡菌肠毒素)是金葡菌分泌到上清中的重要毒素，它是重要的生物战剂，同时也是金葡菌污染导致食物中毒的重要因素。SEB本身没有细胞毒性，其毒性来源于其超抗原特性。所谓超抗原(Superantigen，SAg)是一类不需要抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)处理而能够直接与MHCⅡ类分子结合，导致带有特异Vβ节段T细胞大量增殖的抗原分子。其激活能力是普通抗原的2 000-50 000倍，因此只需极低浓度(1～10pg/mL)即可刺激T细胞活化增殖，释放大量细胞因子。
SEB对人中毒剂量低，在气溶胶吸入的情况下，ED50(50％effective dose，半数有效量)为1ng/kg，LD50(50％lethal dose，半数致死量)为0.02μg/kg。
对于SEB引起的中毒，需要直接对毒素进行鉴定；如为食品污染，则首先应对可疑食品进行细菌培养，如发现葡萄球菌生长，再进行产毒试验。如果能在可疑食品中既培养出细菌，又检测出毒素，即能明确诊断。
但是在对金葡菌培养上清中的毒素进行免疫学鉴定时，金葡菌的培养上清中同时存在蛋白A，该蛋白能够与多种哺乳动物IgG抗体的Fc段结合，导致免疫学结果出现假阳性。目前解决该问题的方法是对抗体进行改造，去除其Fc段，但是制备Fab段相对复杂；或者用羊抗体，但是制备羊抗体相对鼠单抗较为麻烦。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何降低蛋白A对B型金葡菌肠毒素检测的影响。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。
本发明提供的AlphaLISA检测试剂盒包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。
上述试剂盒中，所述SEB捕获抗体标记的受体微球为SEB捕获抗体标记的受体微球溶液。所述SEB捕获抗体标记的受体微球溶液的工作浓度为10-20μg/mL；优选为13.3μg/mL。
所述生物素标记的SEB检测抗体为生物素标记的SEB检测抗体溶液。所述生物素标记的SEB检测抗体溶液的工作浓度为0.2-0.8μg/mL；优选为0.4μg/mL。
上述试剂盒还包括AlphaLISA反应缓冲液。所述AlphaLISA反应缓冲液具体为10×AlphaLISA反应缓冲液，其配方如下：250mM HEPES(pH7.4)，1％Casein，10mg/mL Dextran-500，5％Triton X-100和0.5％Proclin-300。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述试剂盒的新用途。
本发明提供了上述试剂盒在检测B型金葡菌肠毒素中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在制备检测B型金葡菌肠毒素的产品中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在制备检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的产品中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法。
本发明提供的检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法包括采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的步骤。
上述方法中，采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法包括如下步骤：
(1)将SEB捕获抗体标记受体微球，得到SEB捕获抗体标记的受体微球；
(2)将生物素标记SEB检测抗体，得到生物素标记的SEB检测抗体；
(3)将所述SEB捕获抗体标记的受体微球和所述生物素标记的SEB检测抗体加入各检测孔中，然后向所述检测孔中加入待测样品，孵育；
(4)向(3)得到的检测孔中加入链霉亲和素标记的供体微球，孵育；
(5)读取所述检测孔的检测信号值，根据所述检测信号值判断待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素。
上述方法中，所述(1)还包括如下步骤：用AlphaLISA反应缓冲液将所述SEB捕获抗体标记的受体微球按照1:150的比例进行稀释，得到受体微球溶液；
所述(2)还包括如下步骤：用AlphaLISA反应缓冲液将所述生物素标记的SEB检测抗体按照1:1000的比例进行稀释，得到生物素化抗体溶液。
上述方法中，所述(3)还包括如下步骤：将所述受体微球溶液和所述生物素化抗体溶液混匀，得到混合液；将所述混合液加入所述检测孔中。
在本发明中，所述SEB捕获抗体标记的受体微球在混合液中的浓度为33.33μg/mL，所述生物素标记的SEB检测抗体在混合液中的浓度为1μg/mL。
上述方法中，所述(3)中，所述孵育的条件为37℃孵育15分钟；所述(4)中，所述孵育的条件为37℃孵育10分钟。
上述方法中，所述(5)中，采用Spectramax I3的AlphaLISA模块读取所述检测孔的检测信号值，若待测样品的检测信号值大于本底值+3SD，则所述待测样品含有或候选含有B型金葡菌肠毒素，否则待测样品中不含有或候选不含有B型金葡菌肠毒素。
上述方法中，所述本底值具体为本底平均值，所述本底平均值为步骤(3)中不加待测样品，且保持其余步骤不变得到的检测信号值的平均值。
上述试剂盒或方法中，所述SEB检测抗体和SEB捕获抗体均可按照现有技术中的常规方法制备得到，也可以购买获得。具体制备方法可参照文献“雷祚荣，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，中国科学技术出版社”中的“肠毒素单克隆抗体制备”记载的方法。
本发明提供了一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒。该试剂盒包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。本发明还提供了一种B型金葡菌肠毒素的检测方法，本发明提供的B型金葡菌肠毒素的检测方法是采用AlphaLISA技术检测B型金葡菌肠毒素。通过实验证明：本发明的B型金葡菌肠毒素的检测方法可以大大降低蛋白A的影响，且本发明的检测方法快速、准确、可靠，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为蛋白A对AlphaLISA和ELISA检测SEB的影响。A为AlphaLISA和ELISA检测梯度稀释的蛋白A。蛋白A从100μg/mL到0.01μg/mL进行10倍梯度稀释，X轴是蛋白A浓度的对数。Y轴是AlphaLISA和ELISA检测的信号值。B为蛋白A对AlphaLISA和ELISA检测SEB的影响。X轴是SEB的浓度，Y轴是信号比值，其具体计算公式为VSEB+PA/VSEB。VSEB+PA为SEB和蛋白A混合物的检测信号值，VSEB为SEB溶液的检测信号值。
图2为AlphaLISA和ELISA检测菌株上清中的SEB。A为R-BiopharmRIDASCREEN检测上清中的SEB。B为RT-qPCR检测seb基因的表达。1-10为9个分离株和1个阴性对照。9个分离株分别是1169、3-4、AT、SC2、2-1、3-3、SC1、A8和SC3。C为ELISA和AlphaLISA检测金葡菌上清中的SEB。结果以Vtest/Vcutoff表示。Vtest为上清的检测值，Vcutoff为cutoff值，cutoff值为本底平均值+3SD。
图3为AlphaLISA检测SEB的灵敏度。A为4参数标准曲线。B为标准曲线的线性范围。
图4为AlphaLISA检测SEB的特异性。SEA、SEB、SEC、SED和SEE分别为A-E型金葡菌肠毒素；Ricin、Abrin和BTX分别为蓖麻毒素、相思子毒素和肉毒毒素。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的SEB检测抗体和SEB捕获抗体均为迈迪安生命科学公司的产品，SEB捕获抗体的产品目录号为C86220M(克隆号为S222)，SEB检测抗体的产品目录号为C86400M(克隆号为S643)。
下述实施例中的SEB是按照文献“雷祚荣，葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，中国科学技术出版社”中“肠毒素的提纯和鉴定”记载的方法制备得到的，公众可从中国人民解放军军事医学研究院微生物流行病研究所获得。
下述实施例中的10×AlphaLISA反应缓冲液配方：250mM HEPES(pH7.4)，1％Casein，10mg/mL Dextran-500，5％Triton X-100和0.5％Proclin-300。
下述实施例中的PBS溶液：浓度0.01mol/L，pH值7.2。
实施例1、蛋白A对ELISA和AlphaLISA检测SEB的影响
一、以蛋白A作为待测样品
1、ELISA检测
(1)将100μL浓度为1μg/mL的SEB捕获抗体加入96孔板，4℃包被过夜。
(2)弃包被液，用200μL含10％FBS的PBST(PBS+10％Tween)进行封闭。
(3)弃封闭液，分别加入浓度为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的蛋白A溶液(蛋白A购自Sigma公司，货号为P6031；蛋白A溶液的溶剂为PBST)100μL，37℃孵育30分钟，弃上清液，用PBST洗3遍。
(4)加入1:2000生物素标记的SEB检测抗体，37℃孵育30分钟，弃上清液，用PBST洗3遍。
(5)加入1：8000稀释的HRP标记的链霉亲和素(购自Pierce公司，货号为21126)，37℃孵育30分钟。加入底物(TMB)显色，显色后加入终止液(2M H2SO4)终止反应。用SpectramaxI3分别读取各孔的OD450值，以大于本底平均值+3SD判定为阳性。本底平均值为步骤(3)中加入不含蛋白A的PBST溶液100μL，且保持其余步骤不变得到的检测信号值的平均值。
2、AlphaLISA检测
(1)按照抗体标记受体微球的标准流程，将SEB捕获抗体标记于AlphaLISA受体微球(购自PerkinElmer公司，货号为6772001)上，得到SEB捕获抗体标记的受体微球。然后将SEB捕获抗体标记的受体微球与含有0.05％Proclin-300的PBS溶液混匀，得到受体微球溶液，并使其浓度为5mg/mL。
采用Thermo生物素标记试剂盒(购自Thermo公司，货号为21435)将生物素标记于SEB检测抗体，得到生物素标记的SEB检测抗体。然后将生物素标记的SEB检测抗体与PBS溶液混匀，得到生物素化抗体溶液，并使其浓度为1mg/mL。
(2)用AlphaLISA反应缓冲液分别对受体微球溶液和生物素化抗体溶液进行稀释(用AlphaLISA反应缓冲液按照1:150的比例稀释受体微球溶液；用AlphaLISA反应缓冲液按照1:1000的比例稀释生物素化抗体溶液)，并将稀释后的溶液混匀，配制受体微球和生物素化抗体混合溶液20μL，其中，受体微球在混合溶液中的浓度为33.33μg/mL，生物素化抗体在混合溶液中的浓度为1μg/mL。
(3)将20μL的受体微球和生物素化抗体混合溶液加入1/2AreaPlateTM-96(PE)孔中，然后每孔分别加入浓度为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的蛋白A溶液5μL，37℃孵育15分钟，再加入25μL链霉亲和素标记的供体微球(PE)(购自PerkinElmer公司，货号为6760002)，浓度为80μg/mL，37℃孵育10分钟，用Spectramax I3(MolecularDevice，城市)的AlphaLISA模块分别读取各孔的检测信号值。以大于本底平均值+3SD判定为阳性。本底平均值为步骤(3)中加入不含蛋白A的溶液，且保持其余步骤不变得到的检测信号值的平均值。
以蛋白A浓度的对数为X轴，分别以ELISA检测的OD450值和AlphaLISA检测信号值为Y轴绘制曲线。结果如图1A所示。结果显示，用相同的抗体进行检测，随着蛋白A浓度的增加，ELISA检测信号值显著升高，ELISA的cutoff值为0.26+0.06；而AlphaLISA的检测信号值没有增高，与本底值接近。可见蛋白A对ELISA的结果影响较大，对AlphaLISA没有显著影响。
二、以蛋白A和SEB的混合物作为待测样品
1、待测样品的制备
将不同浓度的蛋白A溶液(溶剂为PBST)分别与不同浓度的SEB溶液(溶剂为PBS溶液)混匀，分别得到如下含有SEB和蛋白A的混合样品溶液：混合样品溶液1(SEB的终浓度为0.05ng/mL，蛋白A的终浓度为1μg/mL)、混合样品溶液2(SEB的终浓度为0.1ng/mL，蛋白A的终浓度为1μg/mL)、混合样品溶液3(SEB的终浓度为1ng/mL，蛋白A的终浓度为1μg/mL)、混合样品溶液4(SEB的终浓度为10ng/mL，蛋白A的终浓度为1μg/mL)、混合样品溶液5(SEB的终浓度为100ng/mL，蛋白A的终浓度为1μg/mL)、混合样品溶液6(SEB的终浓度为0.05ng/mL，蛋白A的终浓度为100μg/mL)、混合样品溶液7(SEB的终浓度为0.1ng/mL，蛋白A的终浓度为100μg/mL)、混合样品溶液8(SEB的终浓度为1ng/mL，蛋白A的终浓度为100μg/mL)、混合样品溶液9(SEB的终浓度为10ng/mL，蛋白A的终浓度为100μg/mL)、混合样品溶液10(SEB的终浓度为100ng/mL，蛋白A的终浓度为100μg/mL)。
2、AlphaLISA和ELISA检测SEB
分别采用AlphaLISA和ELISA检测步骤1中制备的混合样品溶液1-10及不含蛋白A的浓度分别为0.05ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL的SEB溶液。检测方法同步骤一中的AlphaLISA和ELISA方法。
以SEB浓度为X轴，信号比值为Y轴绘制曲线。信号比值的计算公式如下：VSEB+PA/VSEB。其中，VSEB+PA为含有蛋白A和SEB的混合样品溶液检测的信号值；VSEB为不含有蛋白A的SEB溶液检测的信号值。
结果如图1B所示。结果显示，对于AlphaLISA，1μg/mL和100μg/mL的蛋白A都不会提高信号值，而对于ELISA，在SEB浓度低于10ng/mL时，1μg/mL的蛋白A将信号提高了1.31到3.02倍，100μg/mL的蛋白A将信号提高了2.39到5.95倍。可见蛋白A明显的影响了ELISA检测的信号值。
实施例2、ELISA和AlphaLISA对金葡菌培养上清中SEB的检测
一、qPCR和R-Biopharm RIDASCREEN检测产SEB菌株
选取10株金黄色葡萄球菌(S-6、1169、3-4、AT、SC2、2-1、3-3、SC1、A8和SC3)，分别采用RT-qPCR和R-Biopharm RIDASCREEN检测10株金黄色葡萄球菌中的产SEB菌株和不产SEB菌株。
1、R-Biopharm RIDASCREEN检测产SEB菌株
肉汤培养基分别培养10株金黄色葡萄球菌至24小时，12000rpm离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，SEB酶联法检测上清液中的SEB。SEB酶联法按照R-BiopharmRIDASCREEN(R-Biopharm AG，Darmstadt，Germany)说明书进行操作。
R-Biopharm RIDASCREEN检测结果如图2A所示。结果表明：10株金黄色葡萄球菌中，S-6为产SEB菌株，而其它菌株均为不产SEB菌株。
2、RT-qPCR检测
采用RT-qPCR对金黄色葡萄球菌菌株的SEB表达进行转录水平鉴定。具体步骤如下：
(1)cDNA的获得
肉汤培养基分别培养10株金黄色葡萄球菌至12小时，取500μL菌液采用RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit(QIAGEN，Valencia，CA)提取总RNA，然后采用反转录试剂盒SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR进行反转录，得到cDNA，以上提取和反转录操作均按照试剂盒说明操作。
(2)RT-qPCR
以步骤(1)获得的cDNA为模板，采用qPCR试剂盒(PowerUp SYBR GreenMasterMix)进行qPCR，检测seb基因的表达情况。seb基因表达的检测引物序列如下：
entB-F：5’-AGAAAAAGGTGACTGCTCAAGAAT-3’；
entB-R：5’-CGTTTCATAAGGCGAGTTGTT-3’。
qPCR仪器为ViiA TM 7real-time PCR system(Invitrogen Life Technologies，Thermo Scientific，Rockford，USA)；qPCR条件为50℃2min，95℃2min；95℃5sec，60℃30sec，40个循环。
qPCR检测结果如图2B所示。结果表明：10株金黄色葡萄球菌中，S-6为产SEB菌株，而其它菌株均为不产SEB菌株。
二、ELISA和AlphaLISA检测金葡菌培养上清中的SEB
1、ELISA检测金葡菌培养上清中的SEB
肉汤培养基分别培养10株金黄色葡萄球菌至24小时，12000rpm离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，取过滤后的100μL产SEB的上清液和不产SEB的上清液作为待测样品，按照实施例1步骤一的1中的方法检测SEB。
2、AlphaLISA检测金葡菌培养上清中的SEB
肉汤分别培养10株金黄色葡萄球菌至24小时，12000rpm离心10min，取5μL上清液作为待测样品，按照实施例1步骤一的2中的方法检测SEB。
结果如图2C所示。结果显示，AlphaLISA能够明确的鉴定出10株金黄色葡萄球菌中S-6为SEB阳性菌株，明确区分出SEB阳性菌株和SEB阴性菌株；但ELISA则将10株金黄色葡萄球菌均鉴定为SEB阳性菌株，即ELISA产生假阳性。说明本发明基于AlphaLISA建立的SEB检测方法结果更加准确、可靠。
实施例3、B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒的灵敏度和特异性检测
一、灵敏度检测
以不同浓度的SEB溶液为待测样品，按照实施例1步骤一的2中的AlphaLISA检测方法检测SEB。4参数曲线的SEB溶液浓度分别为0.03ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.19ng/mL、0.39ng/mL、0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.13ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和300ng/mL；线性曲线SEB溶液浓度为0.03ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.19ng/mL、0.39ng/mL、0.78ng/mL、1.56ng/mL、3.13ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL和25ng/mL。
结果如图3所示。结果表明：所建AlphaLISA检测体系对SEB的检测灵敏度高，检测限可以达到25pg/mL，线性范围为25pg/mL到25ng/mL。
二、特异性检测
分别以浓度为50ng/mL和100ng/mL的A型金葡菌肠毒素(SEA)、B型金葡菌肠毒素(SEB)、C型金葡菌肠毒素(SEC)、D型金葡菌肠毒素(SED)、E型金葡菌肠毒素(SEE)及浓度为100ng/mL的蓖麻毒素(Ricin)、相思子毒素(Abrin)和肉毒毒素(BTX)作为待测样品，按照实施例1步骤一的2中的AlphaLISA检测方法检测SEB。
结果如图4所示。结果表明：所建AlphaLISA检测体系对SEB的检测特异性好，不仅与蓖麻毒素、相思子毒素和肉毒毒素不交叉，与其它4种典型肠毒素也不交叉。

Claims (10)

1.一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒，其包括SEB捕获抗体标记的受体微球、生物素标记的SEB检测抗体和链霉亲和素标记的供体微球。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述SEB捕获抗体标记的受体微球为SEB捕获抗体标记的受体微球溶液，所述SEB捕获抗体标记的受体微球溶液的工作浓度为10-20μg/mL；
或，所述生物素标记的SEB检测抗体为生物素标记的SEB检测抗体溶液，所述生物素标记的SEB检测抗体溶液的工作浓度为0.2-0.8μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述SEB捕获抗体标记的受体微球溶液的工作浓度为13.3μg/mL；
或，所述生物素标记的SEB检测抗体溶液的工作浓度为0.4μg/mL；
或，所述试剂盒还包括AlphaLISA反应缓冲液。
4.权利要求1-3任一所述的试剂盒在检测B型金葡菌肠毒素中的应用；
或，权利要求1-3任一所述的试剂盒在制备检测B型金葡菌肠毒素的产品中的应用；
或，权利要求1-3任一所述的试剂盒在检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素中的应用；
或，权利要求1-3任一所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的产品中的应用。
5.一种检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法，包括采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述采用AlphaLISA技术检测待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素的方法包括如下步骤：
(1)将SEB捕获抗体标记受体微球，得到SEB捕获抗体标记的受体微球；
(2)将生物素标记SEB检测抗体，得到生物素标记的SEB检测抗体；
(3)将所述SEB捕获抗体标记的受体微球和所述生物素标记的SEB检测抗体加入各检测孔中，然后向所述检测孔中加入待测样品，孵育；
(4)向(3)得到的检测孔中加入链霉亲和素标记的供体微球，孵育；
(5)读取所述检测孔的检测信号值，根据所述检测信号值判断待测样品中是否含有B型金葡菌肠毒素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述(1)还包括如下步骤：用AlphaLISA反应缓冲液将所述SEB捕获抗体标记的受体微球按照1:150的比例进行稀释，得到受体微球溶液；
所述(2)还包括如下步骤：用AlphaLISA反应缓冲液将所述生物素标记的SEB检测抗体按照1:1000的比例进行稀释，得到生物素化抗体溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述(3)还包括如下步骤：将所述受体微球溶液和所述生物素化抗体溶液混匀，得到混合液；将所述混合液加入所述检测孔中。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述(3)中，所述孵育的条件为37℃孵育15分钟；
或，所述(4)中，所述孵育的条件为37℃孵育10分钟。
10.根据权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于：所述(5)中，采用Spectramax I3的AlphaLISA模块读取所述检测孔的检测信号值，若待测样品的检测信号值大于本底值+3SD，则所述待测样品含有或候选含有B型金葡菌肠毒素，否则待测样品中不含有或候选不含有B型金葡菌肠毒素。
CN201810745182.3A 2018-07-09 2018-07-09 一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒 Active CN108872598B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810745182.3A CN108872598B (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810745182.3A CN108872598B (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108872598A true CN108872598A (zh) 2018-11-23
CN108872598B CN108872598B (zh) 2021-05-11

Family

ID=64300173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810745182.3A Active CN108872598B (zh) 2018-07-09 2018-07-09 一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108872598B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109870571A (zh) * 2018-12-29 2019-06-11 广东云天抗体生物科技有限公司 一种检测猴g-csf的酶联免疫试剂盒
CN109870570A (zh) * 2018-12-29 2019-06-11 广东云天抗体生物科技有限公司 一种检测猴il-18的酶联免疫试剂盒
CN111458520A (zh) * 2020-04-10 2020-07-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101498733A (zh) * 2009-03-17 2009-08-05 中国检验检疫科学研究院 一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片及其制备方法和检测方法
CN102746404A (zh) * 2004-11-12 2012-10-24 赞科股份有限公司 对FcRn的结合被改变的Fc变体
CN103383354A (zh) * 2012-05-03 2013-11-06 北京博迈世纪生物技术有限公司 一种检测肠毒素sea的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法
CN104749356A (zh) * 2015-01-07 2015-07-01 中国检验检疫科学研究院 呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法
CN105353129A (zh) * 2015-12-14 2016-02-24 北京华安麦科生物技术有限公司 一种蛋白g金黄色葡萄球菌肠毒素试剂盒及其制备方法
US20160075768A1 (en) * 2011-09-27 2016-03-17 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Adjuvant therapy for staphylococcal infection with enterotoxin specific mabs
CN105652003A (zh) * 2014-11-28 2016-06-08 北京华安麦科生物技术有限公司 金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒及其制备和使用方法
CN106662580A (zh) * 2014-08-06 2017-05-10 健康与环境慕尼黑德国研究中心赫姆霍茨中心（有限责任公司） 检测分析物的新聚簇
CN106701768A (zh) * 2016-12-16 2017-05-24 中国人民解放军南京军区福州总医院 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c201及其筛选方法和应用
CN107402297A (zh) * 2017-06-04 2017-11-28 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 基于免疫生物条形码的肠毒素b检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102746404A (zh) * 2004-11-12 2012-10-24 赞科股份有限公司 对FcRn的结合被改变的Fc变体
CN101498733A (zh) * 2009-03-17 2009-08-05 中国检验检疫科学研究院 一种复合检测多种类病原体的蛋白质悬浮芯片及其制备方法和检测方法
US20160075768A1 (en) * 2011-09-27 2016-03-17 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Adjuvant therapy for staphylococcal infection with enterotoxin specific mabs
CN103383354A (zh) * 2012-05-03 2013-11-06 北京博迈世纪生物技术有限公司 一种检测肠毒素sea的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法
CN106662580A (zh) * 2014-08-06 2017-05-10 健康与环境慕尼黑德国研究中心赫姆霍茨中心（有限责任公司） 检测分析物的新聚簇
CN105652003A (zh) * 2014-11-28 2016-06-08 北京华安麦科生物技术有限公司 金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒及其制备和使用方法
CN104749356A (zh) * 2015-01-07 2015-07-01 中国检验检疫科学研究院 呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法
CN105353129A (zh) * 2015-12-14 2016-02-24 北京华安麦科生物技术有限公司 一种蛋白g金黄色葡萄球菌肠毒素试剂盒及其制备方法
CN106701768A (zh) * 2016-12-16 2017-05-24 中国人民解放军南京军区福州总医院 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c201及其筛选方法和应用
CN107402297A (zh) * 2017-06-04 2017-11-28 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 基于免疫生物条形码的肠毒素b检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOKE PATOU 等: ""Staphylococcus aureus enterotoxin B, protein A,and lipoteichoic acid stimulations in nasal polyps"", 《J ALLERGY CLIN IMMUNOL》 *
NATHALIE KHREICH 等: ""Detection of Staphylococcus enterotoxin B using fluorescent immunoliposomes as label for immunochromatographic testing"", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109870571A (zh) * 2018-12-29 2019-06-11 广东云天抗体生物科技有限公司 一种检测猴g-csf的酶联免疫试剂盒
CN109870570A (zh) * 2018-12-29 2019-06-11 广东云天抗体生物科技有限公司 一种检测猴il-18的酶联免疫试剂盒
CN111458520A (zh) * 2020-04-10 2020-07-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒
CN111458520B (zh) * 2020-04-10 2023-09-15 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN108872598B (zh) 2021-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang Gold nanoparticle-based immunochromatographic test for identification of Staphylococcus aureus from clinical specimens
Pride et al. Validation of an immunodiagnostic assay for detection of 13 Streptococcus pneumoniae serotype-specific polysaccharides in human urine
Wang et al. Rapid detection of Bacillus anthracis spores using a super-paramagnetic lateral-flow immunological detectionsystem
CN108872598A (zh) 一种B型金葡菌肠毒素的AlphaLISA检测试剂盒
Kalb et al. Mass spectrometric detection of ricin and its activity in food and clinical samples
CN102482346B (zh) 对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌特异的抗体及将其用于甲氧西林抗性葡萄球菌的检测方法和试剂盒
EP3176582A1 (en) Mycoplasma pneumoniae detection reagent and application of same
Rasooly et al. Development of an in vitro activity assay as an alternative to the mouse bioassay for Clostridium botulinum neurotoxin type A
CN108152512A (zh) 肝素结合蛋白检测试剂盒及其制备方法
Morel et al. Fast and sensitive detection of Bacillus anthracis spores by immunoassay
Pruksaphon et al. An inexpensive point-of-care immunochromatographic test for Talaromyces marneffei infection based on the yeast phase specific monoclonal antibody 4D1 and Galanthus nivalis agglutinin
Wu et al. Employment of teicoplanin-coated magnetic particles for quantifying gram-positive bacteria via catalase-catalyzed hydrolysis reaction of H2O2
Gray et al. Toward low-cost affinity reagents: lyophilized yeast-scFv probes specific for pathogen antigens
Benedek et al. Laboratory experience with the liaison analyzer in the diagnosis of Clostridium difficile-associated diarrhea
Sachdeva et al. An electrochemiluminescence assay for the detection of bio threat agents in selected food matrices and in the screening of Clostridium botulinum outbreak strains associated with type A botulism
US9133527B2 (en) Cell wall protein CwpV (CD0514) as a diagnostic marker for Clostridium difficile ribotype 027
Mercier et al. Diagnosing invasive mold infections: what is next
CN112424602A (zh) 生物样品中(1→3)-β-D-葡聚糖的免疫分析方法、(1→3)-β-D-葡聚糖分析试剂盒以及(1→3)-β-D-葡聚糖免疫分析方法中使用的生物样品碱性预处理溶液
Neumann et al. Innovative and Highly Sensitive Detection of Clostridium perfringens Enterotoxin Based on Receptor Interaction and Monoclonal Antibodies
CN109781992A (zh) 一种抗虫蛋白Cry1C的胶体金免疫层析速测卡
CN110208543A (zh) 血管内皮生长因子检测试剂盒及其使用方法和应用
Li et al. iTRAQ-based proteomic analysis of wheat bunt fungi Tilletia controversa, T. caries, and T. foetida
CN110244042B (zh) 羊腐败梭菌的间接elisa检测试剂盒
WO2012159075A1 (en) Bioprobe compositions and their methods of use
CN103575892A (zh) 用于cea定量检测的试剂盒及其制备、使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant