CN109781992A - 一种抗虫蛋白Cry1C的胶体金免疫层析速测卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物基因技术领域的一种抗虫蛋白Cry1C的胶体金免疫层析速测卡。所述速测卡包括卡壳和卡壳内的试纸条，卡壳上设有加样孔和观察窗，试纸条包括底板及粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫，所述加样孔设于样品垫上方，所述观察窗设于反应膜上方，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述金标垫包被抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体‑胶体金结合物。本发明的速测卡特异性强，灵敏度高，并且操作简便、快速、准确，适用于抗虫蛋白Cry1C的现场快速检测以及安全性评价。

Description

一种抗虫蛋白Cry1C的胶体金免疫层析速测卡

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡。

背景技术

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ-内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入多种农作物使其具有抗虫性。Cry1C蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。

转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物或者其衍生物中Cry1C蛋白进行快速的定性分析，研究开发Cry1C胶体金免疫层析速测卡具有非常大的意义。

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸 (HAuCL4)在还原剂如抗坏血酸、柠檬酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记技术是免疫层析快速诊断的核心技术，它以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应，其实质是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗虫蛋白Cry1C的胶体金免疫层析速测卡，从而应用于抗虫蛋白Cry1C的现场快速检测以及安全性评价。

为实现上述目的，本发明提供了一种抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，包括卡壳和卡壳内的试纸条，卡壳上设有加样孔和观察窗，试纸条包括底板及粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫，所述加样孔设于样品垫上方，所述观察窗设于反应膜上方，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述金标垫包被抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体-胶体金结合物。

上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在另一种实施方式中，抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.16697的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H31D2)分泌得到。

上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在另一种实施方式中，反应膜上所述反应膜上的检测线包被抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体，质控线包被羊抗鼠IgG。

上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在另一种实施方式中，所述反应膜上设有的包被抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.16698的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)分泌得到。

上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在另一种实施方式中，检测线和质控线间隔0.5-1.0cm。

上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在另一种实施方式中，所述样品垫与金标垫、金标垫反应膜、反应膜与吸水垫之间均设有1-2mm的重叠区。

上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在另一种实施方式中，所述底板为PVC(聚氯乙烯)板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在另一种实施方式中，所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水垫由滤纸制成。

本发明还提供了上述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡的检测方法，包括以下步骤：

1)待测样品前处理：若待测样品为液体，取40-60μL待测样品直接进行检测，若待测样品为非液体，则取待测样品90-110mg磨碎，加入0.5-1.5mL 样品处理液充分混匀，冰上静置25-35min后取上清40-60μL检测；样品处理液配方如表1所示：

表1

2)检测：将待测样品滴入加样孔内，室温下作用5-10min，然后观察结果；

3)检测结果分析：

阳性：质控线、检测线均呈现条带，说明待测样本中有Cry1C蛋白存在；

阴性：检测线不出现条带，质控线呈现条带，说明待测样本中没有Cry1C 蛋白存在；

失效：如果检测线、质控线均不出现条带或仅有检测线出现条带，说明试纸条失效。

本发明所涉及的Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/3H3 1D2)和 Cry1C单抗杂交瘤细胞株(PA1-1707016/5E10 1C6)，已于2018年11月08 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为CGMCC No.16697和CGMCC No.16698。

有益效果：本申请设计的抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡特异性强，灵敏度高，并且操作简便、快速、准确，适用于抗虫蛋白Cry1C的现场快速检测以及安全性评价。

附图说明

图1是本发明抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡的卡壳及卡壳内试纸条结构示意图。

图2是本发明抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡的检测结果示意图。

图3是本发明抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡在室温下检测转基因水稻阳性叶片样品的结果。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。

本发明抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡的卡壳及卡壳内试纸条结构示意图如图1所示；本发明抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡的检测结果示意图如图2所示，质控线(即C线)显色，检测线(即T线)肉眼可见，无论颜色深浅均判为阳性；C线显色，T线不显色，判为阴性；无效， C线不显色，T线无论是否显色均为无效；

实施例1检测转基因水稻叶片

取转基因水稻叶片100mg，经液氮研磨，与样本提取液充分混均，冰上静止30min后取上清50μL检测。室温下5min观察检测结果。具体结果详见图3，通过图3可知，原液中所含的Cry1C蛋白能被本申请所涉及的胶体金免疫层析速测卡特异检测到。

实施例2抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡的检验

1.内容：

1.1准备工作：(取样量不低于20份，用于检验；复检、留样及其他特殊情况可另行抽取)

1.1.1对该检验项目所涉及的仪器或相关设备进行检查、调整、必要时进行核准。

1.1.2核对检验成品名称、批号、批量等信息是否与指令一致；

1.2外观：试剂(盒)各组分是否齐全、是否完整、液体有无惨漏；标签是否清晰易识别。

1.3膜条宽度：使用游标卡尺(精度为0.02mm)随机检测2条试纸，计算2次测定结果的平均值，结果应符合《Cry1C胶体金成品质量标准》要求。

1.4液体移动速度：按照说明书进行操作，加入样本后开始计时，记录样本从加样到完全流过检测窗的时间(t)；用游标卡尺测量加样窗到检测窗的上沿距离(L)，计算了L/t即为液体移动速度，结果应符合《Cry1C胶体金成品质量标准》要求。

1.5净含量：取试剂盒中样本稀释液组分，使用通用量具测量，检测结果应符合《Cry1C胶体金成品质量标准》要求。

1.6性能：检测企业参考品，应符合以下标准：

1.6.1最低检出限：重复测试最低检出限参考品10次，计算结果。结果应符合《Cry1C胶体金成品质量标准》要求；

计算方法：

LLD＝

式中：X――系列测定值；

――测定均值；

n――测定次数；

S――标准差；

LLD――最低检出限

1.6.2准确度：用不少于40个在测定范围内的不同浓度样本，以制造商指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂(盒)操作方法以及比对方法分别进行测定。

计算方法：

式中：Bias――相对偏差；

――测定均值；

X――校准品、标准品或参考物质定值。

1.6.3重复性：检测重复性参考品CV1和CV2，每份重复检测不低于10 次，分别计算每个水平变异系数(CV)，结果应符合《Cry1C胶体金成品质量标准》要求：

计算方法：

式中：X――系列测定值；

――测定均值；

n――测定次数；

S――标准差；

CV――批内变异系数。

通过上述检验，本申请所得到的胶体金免疫层析速测卡检测限：10ppb (ng/mL)。

前述对本发明的具体实施例的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。

Claims (9)

1.一种抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，包括卡壳和卡壳内的试纸条，卡壳上设有加样孔和观察窗，试纸条包括底板及粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫，所述加样孔设于样品垫上方，所述观察窗设于反应膜上方，所述反应膜上设有检测线和质控线，其特征在于，所述金标垫包被抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体-胶体金结合物。

2.根据权利要求1所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.16697的杂交瘤细胞株3H3 1D2分泌得到。

3.根据权利要求1所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述反应膜上的检测线包被抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体，质控线包被羊抗鼠IgG。

4.根据权利要求3所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，反应膜上设有的包被抗虫蛋白Cry1C单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.16698的杂交瘤细胞株5E101C6分泌得到。

5.根据权利要求1所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述检测线和质控线间隔0.5-1.0cm。

6.根据权利要求1所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述样品垫与金标垫、金标垫反应膜、反应膜与吸水垫之间均设有1-2mm的重叠区。

7.根据权利要求1所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述底板为聚氯乙烯板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

8.根据权利要求1所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水垫由滤纸制成。

9.权利要求1所述抗虫蛋白Cry1C胶体金免疫层析速测卡的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)待测样品前处理：若待测样品为液体，取40-60μL待测样品直接进行检测，若待测样品为非液体，则取待测样品90-110mg磨碎，加入0.5-1.5mL样品处理液充分混匀，冰上静置25-35min后取上清40-60μL检测；

所述样品处理液的配方为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10mL，使用时添加1片蛋白酶抑制剂及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；

2)检测：将待测样品滴入加样孔内，室温下作用5-10min，然后观察结果；

3)检测结果分析：

阳性：质控线、检测线均呈现条带，说明待测样本中有Cry1C蛋白存在；

阴性：检测线不出现条带，质控线呈现条带，说明待测样本中没有Cry1C蛋白存在；

失效：如果检测线、质控线均不出现条带或仅有检测线出现条带，说明试纸条失效。