CN111458520A - 新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒。本发明提供了本发明提供的试剂盒，为如下A：A所示的试剂盒包括如下单独包装的A1)‑A5)所述的物质：A1)由新型冠状病毒NC蛋白作为抗原制备的新型冠状病毒多克隆抗体；A2)抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体；A3)用于标记所述A1)的生物素；A4)用于偶联所述A2)的AlphaLISA受体微球；A5)链霉亲和素偶联供体微球；本发明采用一种重组新型冠状病毒NC蛋白制备多克隆抗体，用其偶联生物素后，与偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球和链霉亲和素偶联供体微球形成AlphaLISA检测体系，用于定性和定量检测新型冠状病毒。

Description

新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒。
背景技术
在现用的病毒检测方法中，免疫检测和核酸检测以其高效的检测速度和准确性被普遍采用。核酸检测由于需要核酸提取、实施扩增等步骤检测时间需要较长，因此快 速检测病毒抗体或抗原的免疫学诊断方法仍然是病毒检测研究的重点，这与免疫学诊 断方法相对于其他方法更为快捷方便有关。现有新冠病毒免疫学检测试剂盒多为 IgM/IgG抗体检测，抗体检测需要采集病人血液，而且受制于病人感染时间等因素，“假 阴性”问题较为严重。
AlphaLISA(amplified luminescent proximity homogeneous assay linkedimmunosorbent assay)技术是一种基于增强的化学发光的均相免疫检测技术。与传统 的需要洗涤的ELISA检测技术相比具有很大的优势，该技术具有高敏感性、精确性、 均一性、无需洗涤、检测时间短及样本需求量小等特点，使其成为一项快速发展的新 型检测技术。
发明内容
本发明一个目的是提供一种AlphaLISA检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，为如下A或B：
A所示的试剂盒包括如下单独包装的A1)-A5)所述的物质：
A1)由新型冠状病毒NC蛋白作为抗原制备的新型冠状病毒多克隆抗体；
A2)抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体；
A3)用于标记所述A1)的生物素；
A4)用于偶联所述A2)的AlphaLISA受体微球；
A5)链霉亲和素偶联供体微球；
所述新型冠状病毒NC蛋白，为如下a)或b)或c)：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由序列表中序列2第22-320位氨基酸序列组成的蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；
B所示的试剂盒包括如下单独包装的B1)-B3)所示的物质：
B1)偶联所述A2)的受体微球；
所述偶联所述A2)的受体微球为将A2)所示的抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和A4)所示的AlphaLISA受体微球偶联，得到。
B2)生物素标记的A1)；
所述生物素标记的A1)为将第一个目的中的A1)所示的新型冠状病毒多克隆抗体用A3)所示的生物素标记，得到；
B3)链霉亲和素偶联供体微球。
上述A1)所示的新型冠状病毒多克隆抗体按照如下方法制备：重组NC蛋白(序 列2)溶液(浓度为1mg/mL)为抗原，对新西兰白兔进行免疫，初次免疫0.25mg， 每隔10天免疫一次，第二次到第四次免疫剂量分别为0.5mg，1mg和2mg。免疫结 束后取兔全血(兔血清中抗体的效价为1:107)，纯化兔血清，得到新型冠状病毒多克隆 抗体。
本发明另一个目的是提供一种AlphaLISA检测新型冠状病毒N蛋白的体系。
本发明提供的体系，包括第一个目的试剂盒中的B1)-B3)；
所述偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球的浓度为10-100μg/mL，在本发明的实施例中具体为50μg/mL；
所述生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体的浓度为0.1-2μg/mL，在本发明的实施 例中具体为0.5μg/mL；
所述链霉亲和素偶联供体微球的工作浓度为10-100μg/mL，在本发明的实施例中具 体为40μg/mL。
本发明第3个目的是提供了一种AlphaLISA检测新型冠状病毒N蛋白的成套抗体。
本发明提供的成套抗体，包括第一个目的中的所述新型冠状病毒多克隆抗体。
上述成套抗体还包括第一个目的中的所述抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体。
本发明还有一个目的是提供如下应用。
本发明提供了第一个目的试剂盒中的偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受 体微球和所述生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体在如下1)-8)或制备具有如下1)-8)功能的AlphaLISA检测产品中的应用：
1)、检测或辅助检测新型冠状病毒；
2)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白；
3)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白含量；
4)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒；
5)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白；
6)、检测或辅助检测待测样品中新型冠状病毒N蛋白含量；
7)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒；
8)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒N蛋白。
本发明还提供了第一个目的的试剂盒或第二个目的的体系或第3个目的的成套抗体 在如下1)-8)或制备具有如下1)-8)功能的AlphaLISA检测产品中的应用：
1)、检测或辅助检测新型冠状病毒；
2)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白；
3)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白含量；
4)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒；
5)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白；
6)、检测或辅助检测待测样品中新型冠状病毒N蛋白含量；
7)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒；
8)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒N蛋白。
上述应用中，所述检测为定量检测或定性检测。
本发明还有一个目的是提供一种构建检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：先制备生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体 和偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球，再用来构建检测或辅助检测新型冠状病毒的试剂盒；
所述生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体为将第一个目的中的A1)所示的新型冠 状病毒多克隆抗体用A3)所示的生物素标记，得到；
所述偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球为将第一个目的中的A2) 所示的所述抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和A4)所示的AlphaLISA受体微球偶联，得到。
本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白的方法。
本发明提供的方法包括如下步骤：将待测样品和第二个目的所述体系中的B1)-B3) 混匀，反应，检测发光信号，根据发光信号判断待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白。
上述检测发光信号采用全波长检测仪SPECTRAMAX i3(Molecular Devices)读取680nm的信号。以PE缓冲液作为空白对照。
将三个空白对照(PE缓冲液)检测信号值的平均值加上3倍的标准差定义为临界值，在680nm波长下，若待测样品的信号值高于或等于临界值，则待测样品中含有 病毒N蛋白；若待测样品的信号值低于临界值，则待测样品中不含有病毒N蛋白。
本发明采用一种重组新型冠状病毒NC蛋白制备多克隆抗体，用其偶联生物素后，与偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球和链霉亲和素偶联供体微球形成AlphaLISA检测体系，用于定性和定量检测新型冠状病毒N蛋白，从而检测是否含有 新型冠状病毒，这种检测方法与现有的荧光定量检测方法来说耗时短，且也能够达到较 高的灵敏度。
附图说明
图1为纯化的重组NC抗原。
图2为不同抗体组合的信噪比。
图3为M1-P1组合检测NC蛋白抗原的标准曲线。
图4为新型冠状病毒N蛋白的检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中采用过的试剂与仪器：
镍柱纯化A液配方：20mM PB缓冲液(81mL 0.2M Na2HPO4和19mL 0.2M NaH2PO4混合后，pH7.4，去离子水定容至1L)，0.5M NaCl，20mM咪唑；
镍柱纯化B液配方：40mM PB缓冲液(81mL 0.2M Na2HPO4和19mL 0.2M NaH2PO4混合后，pH7.4，去离子水定容至500mL)，0.5M NaCl，0.5M咪唑；
LB培养基购自OXOID公司，LURIABERTANI BROTH，25g溶于1L蒸馏水， 121℃高压15min；
镍柱和蛋白A柱购自GE公司，HisTrapTM HP 5mL；
小鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体分别为bsm-41411M(简称M1)和 bsm-41413M(简称M2)，购自北京博奥森生物技术有限公司；
新西兰白兔购自北京海淀区兴隆实验动物养殖场；
Sulfo-NHS-LC-Biotin(生物素)和脱盐柱购自Thermo公司；
1/2area 96孔板，AlphaLISA受体微球(6772002)和链霉亲和素偶联供体微球(6760002)购自PerkinElmer公司；
硼氢化钠和羧甲基羟胺等试剂购自Sigma公司，其它常规试剂购自国药集团。
蛋白纯化仪：AKTA公司，UPC-900；超声破碎仪：Qsonica Q125；全波长检测仪：Molecular Devices公司SPECTRAMAX i3。
PE缓冲液为25mM HEPES(pH7.4，0.1％酪蛋白，1mg/mL葡聚糖-500，0.5％TritonX-100和0.05％proclin-300)，购自PerkinElmer公司。
PBS配方：20mM PB缓冲液，pH7.4，100mM NaCl；其中，PB缓冲液为81mL 0.2MNa2HPO4和19mL 0.2M NaH2PO4混合后，pH7.4，去离子水定容至1L。
新型冠状病毒N蛋白的氨基酸序列的genbank号为YP_009724397，提交日为2020年1月17日。
实施例1、AlphaLISA检测试剂盒的制备及检测方法的建立
一、AlphaLISA检测试剂盒的制备
1、新型冠状病毒重组NC蛋白抗原的制备
1)表达菌株构建
生工生物工程(上海)股份有限公司合成新型冠状病毒(SARS-CoV-2)N蛋白C 端299个氨基酸(简称NC蛋白)的编码DNA分子(序列1)。
重组载体pET15b-NC为将序列1所示的DNA分子替换pET15b载体(生工生物 工程(上海)股份有限公司)的NdeI和BamHI酶切位点之间序列，得到的载体，NC 蛋白与载体上的His标签及酶切位点共表达得到重组NC蛋白，其氨基酸序列为序列2， 其中序列2第22-320位为NC蛋白，其余为his标签和酶切位点等。
将表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到表达菌株。
2)重组抗原诱导表达
(1)将上述1)制备的表达菌株接种于5mL含100μg/mL氨苄抗生素的LB培养 基中，37℃180rpm复苏过夜培养；
(2)转接于500mL含100μg/mL氨苄抗生素的LB培养基中，水浴摇床37℃180rpm 培养至OD600＝0.6；
(3)加入IPTG至终浓度1mM，30℃160rpm诱导3.5h；
(4)8000rpm4℃离心10min集菌，用预冷的PBS溶液清洗菌体一次，用100mL 纯化A液重悬菌体，超声50min(超声3s，间隔3s，功率75W)；
(5)将超声后样本8000rpm4℃离心10min，收集上清。
3)重组抗原纯化
使用AKTA-FPLC纯化仪纯化上清中的目的蛋白，纯化步骤如下：
(1)分别用纯化AB液洗泵；
(2)用纯化A液平衡镍柱至紫外值不再变化，并将紫外值归零；
(3)将超声上清进行上样，并收集穿透液；
(4)用纯化A液平衡镍柱至紫外值不再变化；
(5)使用梯度洗脱的方法，分别用25％、50％、75％、100％的B液进行洗脱， 分管收集；
(6)收集结束后，分别用蒸馏水和20％乙醇洗泵，将收集的样本进行SDS-PAGE 检测。
(7)取纯度高的几管收集液在PBS中4℃过夜透析，中间换一次透析液，用超 滤管超滤浓缩后定量保存待用，得到重组NC蛋白溶液。
重组NC蛋白溶液(溶剂为PBS)，浓度为1mg/mL。
电泳检测重组NC蛋白溶液，结果如图1所示，可以看出，得到34.67kD的重组 NC蛋白(序列2)。
2、新型冠状病毒多抗制备
1)兔血清的获得
用上述1制备好的重组NC蛋白溶液(浓度为1mg/mL)为抗原，对新西兰白兔 进行免疫，初次免疫0.25mg，每隔10天免疫一次，第二次到第四次免疫剂量分别为 0.5mg，1mg和2mg。免疫结束后取兔全血，通过间接ELISA方法测定兔血清中抗 体的效价。
采用0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释重组NC蛋白，浓度为5μg/mL，酶联孔 100μL/孔4℃包被过夜，200μL PBST(20mM PB，pH7.4，100mM NaCl，0.5％Tween-20) 洗液洗板3次，加入200μL 3％BSA溶液，37℃封闭2h；加入100μL梯度稀释兔血清， 10倍稀释，稀释液为PBS(20mM PB，pH7.4，100mM NaCl)，37℃反应30min；200μL 洗液洗板3次，加入100μL HRP标记的羊抗兔抗体，37℃反应30min；200μL洗液洗板 3次，加入100μL显色液，室温反应10min，加入50μL终止液，在OD450条件下进行 检测。将阴性对照的4个重复的平均值加上3倍的标准差作为临界值，高于临界值的兔 血清稀释梯度为1:107。
结果兔血清中抗体的效价为1:107。
2)纯化兔血清获得新型冠状病毒多抗
将上述兔血清经过蛋白A柱纯化，取兔血清2mL，5mM PB(81mL 0.2M Na2HPO4和19mL0.2M NaH2PO4混合后，pH7.4，去离子水定容至4L)缓冲液稀释100倍后上 样，上样流速3mL/min，5mM PB(pH7.4)缓冲液平衡，线性洗脱，洗脱液为0.1M 柠檬酸盐缓冲液(称取一水合柠檬酸21g，去离子水定容至1L，配置成0.1M柠檬酸 溶液；称取二水合柠檬酸三钠29.4g，去离子水定容至1L，配置成0.1M柠檬酸钠溶 液；0.1M柠檬酸溶液和0.1M柠檬酸钠溶液4：1混合，即得pH3.4柠檬酸盐缓冲液)， 分步收集3ml/管(每管加10％的1.5M Tris缓冲液(称取18.17g Tris，溶解于80mL去 离子水，浓HCL调pH至8.8，去离子水定容至100ml)用于中和洗脱液)，经PBS透 析过夜，超滤管浓缩，获得兔多克隆抗体溶液(浓度为1mg/ml)，编号P1，即为新型 冠状病毒多抗溶液。
3、小鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体
小鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体M1和M2分别稀释在PBS溶剂中，得到小 鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体M1溶液(浓度为1mg/mL)和小鼠抗新型冠状病 毒N蛋白单克隆抗体M2溶液(浓度为1mg/mL)。
4、AlphaLISA检测试剂盒
生物素、上述2制备的新型冠状病毒多抗、上述3的小鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体、AlphaLISA受体微球和链霉亲和素偶联供体微球可用于制备AlphaLISA检测 试剂盒。
二、新型冠状病毒AlphaLISA抗原检测体系及检测方法的建立
检测原理如下：采用AlphaLISA技术特异性检测新型冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白)，当样品中病毒N蛋白一端与受体微球偶联的抗体结合，N蛋白另一端与生物素 标记的抗体，形成双抗体夹心，抗体偶联的生物素再与链霉亲和素偶联供体微球结 合，使得受体微球和供体微球靠近，分子间距离小于200nm，680nm波长激光激发供 体微球将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧，单体氧扩散到受体微球发生一 系列化学发光反应，发射520-620nm光。当样品中不存在病毒N蛋白时，不形成双 抗体夹心，则受体微球和供体微球均在溶液中游离，自由扩散，距离大于200nm，单 体氧无法扩散到受体微珠，不会发光，不会有信号的产生。该方法不需要样本前处 理，操作非常简单，从加样到结果判读只需要15min。
具体方法如下：
1、抗体生物素化
称取2.2mg Sulfo-NHS-LC-Biotin溶于400μL超纯水中，得到10mM的生物素溶液；
在1mg上述一制备的抗体溶液(1mg/mL，1mL)中加入30μL的配制好的生物素 溶液，室温下旋转混合反应60min，脱盐柱纯化，去除掉未结合的生物素，得到生物素 标记抗体存放于4℃备用。
上述抗体溶液分别为P1溶液、M1溶液和M2溶液，分别得到生物素标记P1抗体 溶液、生物素标记M1抗体溶液和生物素标记M2抗体溶液(生物素标记在抗体的N 端，通过酰胺键将生物素与抗体偶联)。
2、受体微球同抗体的偶联
1)吸取25μL浓度为20mg/mL AlphaLISA受体微球和75μL的PBS缓冲液(20mM PB，pH7.4，100mM NaCl)，加入到1.5mL的EP管中，16000g，15min离心，弃上清 液后，用100μLPBS(pH 7.4)洗涤两次，得到AlphaLISA受体微球溶液(浓度为5mg/mL)；
2)50mM HEPES缓冲液(称取11.92g HEPES，溶解于800mL去离子水，1M NaOH 调pH至7.4，去离子水定容至1L)稀释抗体溶液至1mg/mL，得到稀释后抗体溶液；
取100μL抗体溶液(1mg/mL)加入到上述1)得到的洗涤好的AlphaLISA受体微 球溶液中，再加入0.625μL 10％(体积百分含量，v/v，溶剂为去离子水)的吐温-20、10 μL 400mM硼氢化钠水溶液，混匀，37℃中孵育24h，得到反应液；
3)在上述2)得到的反应液中加入10μL的羧甲氧基胺溶液(65mg/mL，800mM 氢氧化钠水溶液作为溶剂)，37℃封闭1h后，16000g，离心15min；
4)100μL的100mM Tris-HCl(称取12.11g Tris，溶解于80mL去离子水，浓HCL 调pH至8.0，去离子水定容至1L)洗涤两次，含有0.05％Proclin-300(v/v)的PBS缓 冲液(20mMPB，pH7.4，100mM NaCl)100μL重悬并超声(超声振幅20％，超1s，停 1s，作用是减少微球聚集，是重悬更均匀)，存于4℃备用，得到偶联抗体的受体微球溶 液(溶剂为PBS缓冲液，浓度为5mg/mL；受体微球表面醛基修饰，与抗体N端的氨 基结合，通过酰胺键将受体微球与抗体偶联)。
上述抗体分别为P1溶液、M1溶液和M2溶液，分别得到偶联抗体P1的受体微球 溶液(溶剂为PBS缓冲液，浓度为5mg/mL)、偶联抗体M1的受体微球溶液(溶剂为PBS 缓冲液，浓度为5mg/mL)和偶联抗体M2的受体微球溶液(溶剂为PBS缓冲液，浓度 为5mg/mL)。
3、新型冠状病毒AlphaLISA抗原检测体系中抗体配对的优化
向1/2area 96孔板中加入20μL上述2得到的不同的偶联抗体的受体微球溶液和不同的生物素标记抗体组合，浓度分别为50μg/mL和0.5μg/mL，加入5μL上述一制备的 新型冠状病毒重组NC蛋白抗原溶液(浓度为10ng/ml)作为待测样本，37℃孵育7.5min 后，加入25μL 40μg/mL的链霉亲和素偶联供体微球，37℃孵育5min后，全波长检测 仪SPECTRAMAX i3(Molecular Devices)读取680nm的信号。
以PE缓冲液作为空白对照。
上述偶联抗体的受体微球溶液及其配对使用的生物素标记抗体组合具体如下：
M1-P1组合：偶联单克隆抗体M1的受体微球溶液和生物素标记多克隆P1抗体溶液；
P1-M1组合：偶联多克隆抗体P1的受体微球溶液和生物素标记单克隆M1抗体溶液；
M2-P1组合：偶联单克隆抗体M2的受体微球溶液和生物素标记多克隆P1抗体溶液；
P1-M2组合：偶联多克隆抗体P1的受体微球溶液和生物素标记单克隆M2抗体溶液；
M1-M2组合：偶联单克隆抗体M1的受体微球溶液和生物素标记单克隆M2抗体溶液；
M2-M1组合：偶联单克隆抗体M2的受体微球溶液和生物素标记单克隆M1抗体溶液；
P1-P1组合：偶联多克隆抗体P1的受体微球溶液和生物素标记多克隆P1抗体溶液；
结果：
M1-P1组合：10ng/ml抗原溶液的信号平均值为215520，空白对照的信号平均值为4522，信噪比为47.66；
P1-M1组合：10ng/ml抗原溶液的信号平均值为28408，空白对照的信号平均值为7080，信噪比为4.01；
M2-P1组合：10ng/ml抗原溶液的信号平均值为159327，空白对照的信号平均值为5587，信噪比为28.52；
P1-M2组合：10ng/ml抗原溶液的信号平均值为51487，空白对照的信号平均值为7482，信噪比为6.88；
M1-M2组合：10ng/ml抗原溶液的信号平均值为228473，空白对照的信号平均值为12313，信噪比为18.56；
M2-M1组合：10ng/ml抗原溶液的信号平均值为91481，空白对照的信号平均值为10368，信噪比为8.82；
P1-P1组合：10ng/ml抗原溶液的信号平均值为15939，空白对照的信号平均值为2941，信噪比为5.42；
计算组合信噪比(各组合10ng/ml抗原溶液的信号值/空白对照的信号值)。
结果如图2所示，可以看出，相较于单克隆抗体和单克隆抗体组合、多克隆抗 体和多克隆抗体组合、多克隆抗体和单克隆抗体组合，单克隆抗体和多克隆抗体的 组合(即单克隆抗体偶联受体微球，多克隆抗体标记生物素)信噪比更高，M1-P1 和M2-P1均高于其它组合，M1和P1这对单克隆抗体和多克隆抗体的组合信噪比最 高。
因此，偶联单克隆抗体M1的受体微球溶液和生物素标记多克隆P1抗体溶液为最优配对使用抗体。
4、AlphaLISA抗原检测方法建立
1)定性检测
向1/2area 96孔板中加入20μL上述2得到的偶联单克隆抗体M1的受体微球溶液和对应的上述1得到的生物素标记多克隆P1抗体溶液，浓度分别为50μg/mL和0.5 μg/mL，加入5μL待测样品，37℃孵育7.5min后，加入25μL 40μg/mL的链霉亲和素偶 联供体微球，37℃孵育5min后，全波长检测仪SPECTRAMAX i3(Molecular Devices) 读取680nm的信号。
以PE缓冲液作为空白对照。
将三个空白对照(PE缓冲液)检测信号值的平均值加上3倍的标准差定义为临界值，在680nm波长下，若待测样品的信号值高于或等于临界值，则待测样品中含有 病毒N蛋白；若待测样品的信号值低于临界值，则待测样品中不含有病毒N蛋白。
2)定量检测
不同浓度的新型冠状病毒重组NC蛋白抗原溶液，用PE缓冲液稀释上述一制备的新型冠状病毒重组NC蛋白抗原溶液，得到200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml， 12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml，1.56ng/ml，781pg/ml，391pg/ml，195pg/ml， 98pg/ml和49png/ml新型冠状病毒重组NC蛋白抗原溶液。
向1/2area 96孔板中加入20μL上述2得到的偶联单克隆抗体M1的受体微球溶液和对应的上述1得到的生物素标记多克隆P1抗体溶液，浓度分别为50μg/mL和0.5 μg/mL，加入5μL不同浓度的新型冠状病毒重组NC蛋白抗原溶液作为标准品，37℃孵 育7.5min后，加入25μL 40μg/mL的链霉亲和素偶联供体微球，37℃孵育5min后，全 波长检测仪SPECTRAMAXi3(Molecular Devices)读取680nm的信号。
以PE缓冲液作为空白对照。
GraphPad Prism软件绘制标准曲线，四参数拟合，计算R2。
以新型冠状病毒重组NC蛋白抗原不同浓度的对数为横坐标，检测信号值的对数为纵坐标，制备标准曲线，R2为0.9948(图3)。
将待测样品替换为标准品，检测待测样品的信号值，再代入上述标准曲线中，获得待测样品中新型冠状病毒N蛋白的浓度。
将12个空白对照的平均值加上3倍的标准差的值代入标曲，所对应的新型冠状病毒重组NC蛋白抗原浓度即为最低检测限，即162pg/ml。
实施例2、AlphaLISA抗原检测方法检测新型冠状病毒N蛋白
向1/2area 96孔板中加入20μL偶联单克隆抗体M1的受体微球溶液和对应的生物素标记多克隆P1抗体溶液，浓度分别为50μg/mL和0.5μg/mL，加入5μL不同浓度的 新型冠状病毒N蛋白抗原溶液(新型冠状病毒N蛋白抗原购自义翘神州生物技术有限公 司，产品目录号40588-V08B，PE缓冲液将其稀释至浓度分别为100ng/ml，10ng/ml和 1ng/ml)作为待测样本，37℃孵育7.5min后，加入25μL 40μg/mL的链霉亲和素偶联供 体微球，37℃孵育5min后，全波长检测仪SPECTRAMAX i3(Molecular Devices)读取680nm的信号。
以PE缓冲液作为空白对照。
将三个空白对照(PE缓冲液)检测信号值的平均值加上3倍的标准差定义为临界值，在680nm波长下，若待测样品的信号值高于或等于临界值，则待测样品中含有 病毒N蛋白；若待测样品的信号值低于临界值，则待测样品中不含有病毒N蛋白。
结果如图4所示，100ng/ml新型冠状病毒N蛋白抗原溶液的信号平均值为435567，10ng/ml新型冠状病毒N蛋白抗原溶液的信号平均值为74836，1ng/ml新型冠状病毒N 蛋白抗原溶液的信号平均值为9984，空白对照的信号平均值为3606，空白对照的信号标 准差为226.44，计算得临界值为4285；100ng/ml、10ng/ml和1ng/ml的新型冠状病毒N 蛋白抗原溶液的信号值均高于临界值，证明该方法可以检测新型冠状病毒N蛋白。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 新型冠状病毒AlphaLISA抗原快速检测试剂盒
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 897
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 60
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 120
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 180
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 240
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 300
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 360
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 420
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 480
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 540
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 600
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 660
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 720
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 780
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 840
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcc 897
<210> 2
<211> 320
<212> PRT
<213>Artificial sequence
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile
20 25 30
Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly
35 40 45
Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln
50 55 60
Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg
85 90 95
Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala
100 105 110
Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu
115 120 125
Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly
130 135 140
Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg
145 150 155 160
Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly
165 170 175
Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu
180 185 190
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe
195 200 205
Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu
210 215 220
Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu
225 230 235 240
Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys
245 250 255
His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp
260 265 270
Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys
275 280 285
Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe
290 295 300
Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
305 310 315 320

Claims (9)

1.一种AlphaLISA检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，为如下A或B：
A所示的试剂盒包括如下单独包装的A1)-A5)所述的物质：
A1)由新型冠状病毒NC蛋白作为抗原制备的新型冠状病毒多克隆抗体；
A2)抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体；
A3)用于标记所述A1)的生物素；
A4)用于偶联所述A2)的AlphaLISA受体微球；
A5)链霉亲和素偶联供体微球；
所述新型冠状病毒NC蛋白，为如下a)或b)或c)：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由序列表中序列2第22-320位氨基酸序列组成的蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质；
B所示的试剂盒包括如下单独包装的B1)-B3)所示的物质：
B1)偶联所述A2)的受体微球；
B2)生物素标记的A1)；
B3)链霉亲和素偶联供体微球。
2.一种AlphaLISA检测新型冠状病毒N蛋白的体系，包括权利要求1中的B1)-B3)；
所述偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球的浓度为10-100μg/mL；
所述生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体的浓度为0.1-2μg/mL；
所述链霉亲和素偶联供体微球的工作浓度为10-100μg/mL。
3.一种AlphaLISA检测新型冠状病毒N蛋白的成套抗体，包括权利要求1中所述新型冠状病毒多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的成套抗体，其特征在于：所述成套抗体还包括权利要求1中所述抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体。
5.权利要求1中所述偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球和权利要求1中所述生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体在如下1)-8)或制备具有如下1)-8)功能的AlphaLISA检测产品中的应用：
1)、检测或辅助检测新型冠状病毒；
2)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白；
3)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白含量；
4)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒；
5)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白；
6)、检测或辅助检测待测样品中新型冠状病毒N蛋白含量；
7)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒；
8)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒N蛋白。
6.权利要求1所述的试剂盒或权利要求2所述的体系或权利要求3或4所述的成套抗体在如下1)-8)或制备具有如下1)-8)功能的AlphaLISA检测产品中的应用：
1)、检测或辅助检测新型冠状病毒；
2)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白；
3)、检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白含量；
4)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒；
5)、检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白；
6)、检测或辅助检测待测样品中新型冠状病毒N蛋白含量；
7)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒；
8)、检测或辅助检测待测者是否感染新型冠状病毒N蛋白。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述检测为定量检测或定性检测。
8.一种制备检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒的方法，包括如下步骤：先制备生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体和偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球，再构建检测或辅助检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒；
所述生物素标记的新型冠状病毒多克隆抗体为将权利要求1中的所述新型冠状病毒多克隆抗体用所述生物素标记，得到；
所述偶联抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的受体微球为将权利要求1中的所述抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和所述AlphaLISA受体微球偶联，得到。
9.一种检测或辅助检测待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白的方法，包括如下步骤：将待测样品和权利要求2所述体系中的B1)-B3)混匀，反应，检测发光信号，根据发光信号判断待测样品中是否含有新型冠状病毒N蛋白。
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