CN116003582B

CN116003582B - 检测冠状病毒的抗体及其应用

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Publication number: CN116003582B
Application number: CN202210317797.2A
Authority: CN
Inventors: 魏化伟; 张伦
Original assignee: Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Dongkang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-29
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2042-03-29
Also published as: CN116003582A

Abstract

本发明公开了检测冠状病毒的抗体及其应用，所述抗体包括含有三个CDR的重链可变区和三个CDR的轻链可变区；其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、3、4所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、11、12所示。本发明同时公开了编码上述抗体的核酸分子、载体、宿主细胞及其应用。

Description

检测冠状病毒的抗体及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物技术、免疫学领域，涉及检测冠状病毒的抗体及其应用。

背景技术

2019冠状病毒病(COVID-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的一种传染病。SARS-CoV-2是自然界发现的第七种未知冠状病毒，具有很强的感染和变异能力。COVID-19可以通过接触传播，而且普遍易感，主要症状为发热、咳嗽等，潜伏期一般在2周内。该病的表现形式主要以呼吸系统疾病表现为主，起初出现发热、干咳，一周后呼吸不畅，患者常因呼吸窘迫及脓毒症休克导致死亡。COVID-19的临床表现大致可分为三个阶段：初期为病毒携带的无症状感染，轻症患者表现为上呼吸道感染，严重者出现缺氧、肺部“磨玻璃样”病变及高病毒载量的急性呼吸窘迫综合征(Guilpain P，Clement Le Bihan,Foulongne V，et al.Rituximab for granulomatosis with polyangiitis in thepandemic of covid-19:lessons from a case with severe pneumonia[J].Annals ofthe Rheumatic Diseases,2020,43(65):217-249.)。

SARS-CoV-2引物设计可参考的序列有限，且病毒容易在传播中突变，这些原因均可导致病毒核酸试验结果出现假阴性，导致一些可疑患者无法及时诊断。质量参差不齐的试剂盒，不合格的取样管，不一样的取样部位，还有RNA提取技术不同，患者用药条件不同，均是新冠病毒核酸检测产生假阴性结果的原因。对于高度怀疑的病人，需要进行多重核酸测试来确认。所以寻找新的、有效的监测方法对疾病的控制和治疗至关重要。而SARS-CoV-2特异性抗体检测不受上述因素和临床用药等原因干扰，可避免核酸检测的缺点。

鉴于SARS-CoV-2用于诊断相应感染的现有测定的问题，在本领域中迫切需要改进的，尤其是更灵敏的，更特异性的，和因此更可靠的用于诊断SARS-CoV-2感染的工具和方法，尤其是用于SARS-CoV-2感染的早期诊断，以实现更具靶病毒特异性和从而更有效的治疗。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗SARS-CoV-2N蛋白的单克隆抗体及其应用。

具体方案如下：

本发明的第一方面提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括含有三个CDR的重链可变区和三个CDR的轻链可变区；其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、3、4所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、11、12所示。

在一些实施方案中，所述重链可变区还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4；轻链可变区还包括轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:5、6、7、8所示；轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO:13、14、15、16所示。

在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含：

(a)与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的重链可变区序列；

(b)与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90％，优选95％序列同一性的轻链可变区序列；或者

(c)如(a)中的重链可变区序列和如(b)中的轻链可变区序列。

在优选的实施方案中，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。

在进一步的实施方案中，所述单克隆抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。

本发明的第二方面提供了核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段。

本发明的第三方面提供了载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

在一些实施方案中，所述载体包含与抗体可操作性地连接的信号肽。

本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体。

在一些实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞。

在一些实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞。

在一些实施方案中，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

本发明第五方面提供了一种药物偶联物，所述偶联物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述药物偶联物还包含选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。

本发明第六方面提供了一种组合物，所述组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的药物偶联物。

在进一步的实施方案中，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的第七方面提供了一种用于检测或测定样本中冠状病毒的产品，所述产品包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述产品还包括处理样本的试剂。

在一些实施方案中，所述冠状病毒包括SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV。

在本发明的具体实施方案中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

本发明的第八方面提供了一种制备本发明第一方面所述单克隆抗体的方法，所述方法包括步骤：

培养本发明第四方面所述的宿主细胞，回收单克隆抗体。

在进一步的实施方案中，所述方法还包括对所述单克隆抗体进行纯化。

本发明第九方面提供了一种检测本中N蛋白的方法，使本发明第一方面所述的单克隆抗体接触待测样本；确定所述待测样本中冠状病毒N蛋白的存在或水平。

本发明第十方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的药物偶联物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的产品在检测冠状病毒N蛋白或冠状病毒感染中的应用；

2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的药物偶联物、本发明第六方面所述的组合物、本发明第七方面所述的产品在制备诊断冠状病毒感染相关疾病的产品中的应用；

3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的药物偶联物、本发明第六方面所述的组合物在制备预防和/或治疗冠状病毒感染相关疾病的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述疾病为COVID。

在本发明的具体实施方案中，所述疾病为COVID-19。

附图说明

图1是检测单克隆抗体4B8的电泳图；

图2是检测单克隆抗体4B8的HPLC图；

图3是ELISA检测单克隆抗体4B8的结合活性图。

具体实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，发现了一个抗冠状病毒N蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体具有较高的亲和活性。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体制备物的优势在于它们一般未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。

在本发明中，单克隆抗体涵盖与所述抗体的氨基酸序列或者编码该抗体的任何核苷酸序列具有一定程度的序列一致性或序列同源性的序列，本发明中，“同源性”可等同于“一致性”。

本领域技术人员还将理解的是，抗体可以进行各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度常常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化中的变化。常见修饰是由于羧肽酶的作用导致的羧基末端碱性残基(诸如赖氨酸或精氨酸)的缺失。

如本发明所用，“同一性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用，“相似性”指示在比对的序列的任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基为相似类型。例如，亮氨酸可被置换成异亮氨酸或缬氨酸。可通常彼此置换的其它氨基酸包括(但不限于)：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)，天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)，天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)，以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。

通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常，这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容忍更大的变化。氨基酸取代通常是单个碱基的；插入通常将为大约一个至大约二十个氨基酸残基的数量级，虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一个至大约二十个氨基酸残基，虽然在一些情况下，缺失可以大得多。

进一步，包括但并不限于构架区域、高可变区域、尤其是CDR3区域的可变区域的氨基酸序列被改性。通常，轻链或重链区域包括三个高可变区域(包括三个CDR)和更保守的区域(所谓的构架区域(FR))。高可变区域包括来自CDR的氨基酸残基和来自高可变环的氨基酸残基。可将本领域技术人员已知的计算机算法诸如Gap或Bestfit用于最优化地比对要对比的氨基酸序列，且定义相似或相同的氨基酸残基。可通过本领域已知的通用的分子生物学方法(包括PCR、寡核苷酸定点诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis)和定点诱变(site-directed mutagenesis))改变亲本单克隆抗体或其部分，或通过有机合成方法获得功能性变异体。

本发明公开的抗体和片段从宿主细胞以良好水平表达。因此，抗体和/或结合片段的性质适合用于商业规模的表达。

抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。“Fab”是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分；“Fab′”是指包含了部分铰链区的Fab片段；“F(ab′)2”指的是Fab’的二聚体；“Fv”指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段，并且可以来源自任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔子，但不限于此。抗体的功能性部分，例如本文所述的一个或多个CDR，可以通过共价键与二级蛋白质或小分子化合物连接，并用作针对特定靶标的靶标治疗剂。

本发明中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

本发明对载体没有特别的限制，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒、黏粒、病毒、噬菌体和其他常规用于例如遗传工程的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体。

在一个实施方案中，载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达，并因此保证由此编码的本发明的抗体的可变链结构域在选择的宿主中的表达。在进一步的实施方案中，一种或多种载体包含进一步的序列以确保不仅表达本发明的所述可变链结构域，而且也表达包含本发明的所述可变链结构域的全长抗体。

表达载体可以例如是克隆载体、双元载体或整合型载体。表达包括核酸分子的转录，例如转录成可翻译的mRNA。

载体的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适合于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部为Invitrogen)。适合于在爪蟾属(Xenopus)胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。

通常，载体可含有一种或多种用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)和一种或多种表达盒。另外，可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列连接。这种调控序列是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点(IRES)和任选的确保转录终止和转录物稳定的调控元件。确保转录起始的这种调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件，其包括在本发明的核酸分子的下游。进一步的例子包括Kozak序列和侧翼为用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列，编码分泌信号的核苷酸序列，或取决于所用的表达系统的信号序列，其能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基。载体也可含有编码一种或多种蛋白伴侣的另外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。

合适的复制起点的额外的例子包括，例如，全长ColE1、截短的ColEI、SV40病毒和M13复制起点，而合适的启动子的额外的例子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、lacZ启动子、四环素启动子/操纵基因(tetp/o)、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG-启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒立即早期增强子的组合)、gai10启动子、人延伸因子1α-启动子、AOX1启动子、GAL1启动子CaM-激酶启动子，lac，trp或tac启动子，T7或T5启动子，lacUV5启动子，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒(AcMNPV)多角体启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的珠蛋白内含子。增强子的一个例子是例如SV40-增强子。确保转录终止的调控元件的非限制性的额外例子包括SV40-聚腺苷酸化位点、tk-聚腺苷酸化位点、不依赖ρ因子的lpp终止子或AcMNPV多角体聚腺苷酸化信号。选择标记的进一步的非限制性实例包括dhfr，其赋予了对氨甲蝶呤的抗性，npt，其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素(paromycin)的抗性和hygro，其赋予对潮霉素的抗性。已经描述了额外的选择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸；甘露糖6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性或赋予对杀稻瘟素S抗性的来自土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶。

在进一步的实施方案中，载体是真核表达质粒，其含有由包括内含子A的5`CMV启动子和3`BGH聚腺苷酸化序列组成的表达盒。

合适的细菌表达宿主包括例如衍生自JM83、W3110、KS272、TG1、K12、BL21(例如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)或的菌株。

为了促进本发明的核酸分子的纯化，可将标签(tag)序列插入表达载体中。标签的实例包括(但不限于)六个组氨酸标签、myc标签或FLAG标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。

在本发明中，任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列或所述的核酸分子的表达。可使用细菌(例如大肠杆菌)及其它微生物系统，或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。上述细胞包含(但并不限于)哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。作为哺乳动物细胞，可优选使用选自(但并不限于)由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞组成的组中的一种作为宿主细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

在本发明的具体实施方案中，所述的宿主细胞为HEK293细胞。

可以设计本发明的核酸分子和/或载体以通过例如基于化学的方法(聚乙烯亚胺、磷酸钙、脂质体，DEAE-葡聚糖、核转染、非化学方法(电穿孔、声孔效应、光转染、基因电转移、流体递或细胞与本发明的核酸分子接触时自然发生的转化)、基于粒子的方法(基因枪、磁转染、穿刺转染)、基于噬菌体载体的方法和病毒方法引入细胞。例如，衍生自诸如反转录病毒、牛痘病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、Semliki病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将核酸分子递送至靶向的细胞群体中。另外，杆状病毒系统也可以用作本发明核酸分子的真核表达系统中的载体。

因此，本发明还涉及用于生产表达根据本发明的单克隆抗体的宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将如上所述的核酸体外或离体导入感受态宿主细胞中，

(2)在体外或离体培养获得的重组宿主细胞，和

(3)可选地选择表达和/或分泌所述单克隆抗体的细胞。此类重组宿主细胞可用于产生根据本发明的单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术生产，诸如例如任何化学、生物学、遗传学或酶学技术，单独或组合地。

特别地，本发明的宿主细胞接着可以用于表达以及培养目的，用于大量药物生产的抗体表达。还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何适当的培养技术，包括但是不局限于静置培养、转瓶培养、腹水流体、中空纤维型生物反应盒、模块化小型发酵罐、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等等。

作为一种可选择的实施方式，本发明中的产品包括本发明所制备的抗体或其功能片段。作为另外一种可选择的实施方式，本发明的产品包括诊断组合物，所述诊断组合物包括至少一种可检测的标签，诸如可检测的部分/试剂。标签可非共价地缀合至本发明的单克隆抗体。标签还可通过共价键直接缀合至单克隆抗体。可选择地，标签可利用一种或多种连接化合物缀合至上述单克隆抗体。用于将标签缀合至单克隆抗体的技术对本领域的技术人员是公知的。作为标签的可检测的部分/试剂优选为选自由(但并不限于)酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射材料和非放射性的顺磁金属离子组成的组中的一种。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括但不限于FITC，5-羧基荧光素，6-羧基荧光素；罗丹明类型的标记，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺；花菁；藻红蛋白；德克萨斯红；及其类似物。荧光标记可以使用本文公开的技术与靶分子中包含的醛基缀合。合适的发光物质包括鲁米诺，吖啶化合物，腔肠素和类似物，二氧杂环丁烷，基于过氧草酸的系统及其衍生物；合适的生物发光物质包括荧光素酶、荧光素和水母素；并且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。

本发明所述的单克隆抗体也可缀合至治疗剂以形成免疫缀合物，例如抗体-药物缀合物(ADC)。适宜治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰酶抑制剂、出核抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂优选是经由可切割接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)缀合。

本发明还提供了其他多肽，如包含单克隆抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，用于检测或测定目标抗原(例如N蛋白)的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。

免疫检测或测定方法是使标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、流式细胞技术、物理化学方法等。

冠状病毒感染相关疾病可以通过用本发明的抗体或抗体片段检测或测定N蛋白来诊断。

在本发明中，对用于检测或测定目标抗原(例如N蛋白)的样品没有特别限制，只要它具有包含表达目标抗原(例如N蛋白)的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。

本发明中的药物组合物包括本发明的单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，诸如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质的辅助物质可存在于所述组合物中。这些载剂使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以便患者摄入。

合适的施用形式包括适用于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速注射或连续输液、静脉内、可吸入或皮下形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可采用在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可含有配制试剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，根据本发明的抗体或其抗原结合片段可呈干燥形式，用于在使用之前用合适的无菌液体重构。还可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。

一旦配制，本发明的组合物可直接施用至受试者。因此，本文提供根据本发明的抗体或其抗原结合片段用于制造药剂的用途。

待治疗的受试者可以是动物。优选地，根据本发明的药物组合物经调整以用于向人受试者施用。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1单克隆抗体的筛选

1、重组新冠N蛋白的合成

合成SARS-CoV-2病毒的N蛋白序列，构建至pEM5.1载体；抽提转染用质粒；转染至HEK293细胞，培养细胞7天；收获上清，Ni柱纯化，经过浓缩置换缓冲液，得到重组新冠N蛋白，重组新冠N蛋白序列来源Uniprot P0DTC9。序列如SEQ ID NO：1所示。

2、免疫

第一次用福氏完全佐剂，每只100μg，腹腔注射，总剂量0.5ml/只，间隔3周进行第二次免疫；第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为50μg/0.5ml/只，间隔2周进行第三次免疫；第三次注射后10天准备细胞融合；

取饲养细胞，可按10⁵/孔使用，于融合前一天铺板10⁵个/100μl/孔；取小鼠免疫脾细胞与准备好的骨髓瘤细胞用融合剂PEG进行融合，铺入已经加入饲养细胞的96细胞培养板，100μl/孔。

3、杂交瘤细胞的筛选和克隆

通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，铺重组表达N蛋白过夜；洗板，加脱脂奶粉封闭，37℃，1h；洗板，加入100ul 96孔培养液上清，37℃，孵育1h；洗板，加入HRP标记羊抗鼠二抗，37℃，孵育30min；洗板，加入显色液，显色10min，加入终止液，读取OD450的数值；筛选高表达量细胞株进行亚克隆培养。

4、测序

收集细胞，采用Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)20为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入载体，进行转化，挑选阳性克隆送测序。

5、结果

筛选出抗SARS-CoV-2的单克隆抗体4B8，序列如表1所示。

表1单克隆抗体4B8的序列

实施例2单克隆抗体4B8的功能性研究

1、单克隆抗体的表达和纯化

1)对筛选出的序列进行化学合成，并克隆至真核表达载体中。

2)对质粒扩增提取。

3)将编码抗体的质粒瞬时转染入哺乳动物细胞HEK293。

4)收集上清，利用亲和层析方法，纯化获得单克隆抗体。

5)结果，纯化后的抗体表达量是175mg/L。

2、单克隆抗体的理化性质检测

2.1凝胶电泳检测单克隆抗体的纯度

1)仪器设备

名称	生产厂家	型号
			化学发光成像仪	Tanon	Tanon-5200
电泳仪	BIO-RAD	poweerpac basic
			电泳槽	BIO-RAD	DYC-Mini4

2)主要试剂

名称	生产厂家	规格	货号
				1M Tris-HCl缓冲液	北京索莱宝科技有限公司	60ml/瓶	20200911
1.5M Tris-HCl缓冲液	北京索莱宝科技有限公司	100ml/瓶	20200911
				10％SDS	北京索莱宝科技有限公司	10ml/瓶	20200911
FastStain	Gene Universal	1000ml/瓶	21DA
				30％制胶液(29:1)	北京索莱宝科技有限公司	500ml/瓶	20210414
彩虹180广谱蛋白Marker	北京索莱宝科技有限公司	250μl(50T)	1202F021

3)样品制备

取20μl的样品与5μl的5×还原buffer混合均匀，在95℃中加热5min，冷却；

取20μl的样品与5μl的5×非还原buffer混合均匀。

4)电泳

配置胶，加适量的电泳缓冲液，加样，进行电泳。

5)染色与脱色

电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，室温染色1h或更长时间；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，室温脱色4-24h。完成脱色后，用ddH₂O浸泡，参照Marker蛋白，与未染色凝胶对比，切下所需蛋白成分的凝胶，收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。

6)结果

结果如图1所示，单克隆抗体的检测纯度均大于95％。

2.2HPLC检测单克隆抗体的纯度

1)仪器设备

2)主要试剂

3)流动相配制

将磷酸氢二钾三水、磷酸二氢钾和氯化钾加入到约900ml纯化水中，搅拌溶解，定容至1L，用pH计测量，确定其pH在6.2±0.1之间。0.22μm滤膜过滤，室温保存。

4)样品制备

系统适用性样品：MIL62标准品用流动相稀释至2mg/ml

供试品：待测样品用流动相稀释至2mg/ml。

5)色谱条件

6)结果

结果如图2所示，单克隆抗体的检测纯度均大于95％。

3、单克隆抗体的结合活性检测

1)包被：用包被液将抗原N蛋白稀释成2μg/ml，混匀，加入96孔包被板，100μl/孔，封膜封闭，4℃过夜。

2)洗板机洗涤3次，最后一次不能有液体残留在板子上，用吸水纸拍干板子表面的液体。

3)封闭：加入5％奶粉(0.5g奶粉溶于10mlDPBS)，300μl/孔，37℃孵育1h，按照步骤2)洗板3次。

4)将抗体进行梯度稀释，100μl/孔，37℃反应1h，按照步骤2)洗板3次。

5)加二抗：用DPBS按照1:2000稀释，加入96孔板，100μl/孔，37℃反应1h，按照步骤2)洗板3次。

6)显色：加入TMB，100μl/孔，室温避光显色10min。

7)终止：加入2N H₂SO₄，100μl/孔。

8)酶标仪测OD450，10min内检测

9)结果

结果如图3所示，单克隆抗体4B8可以与抗原N蛋白特异性结合，并且呈现浓度依赖性，EC₅₀为0.01577μg/ml。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 苏州东抗生物科技有限公司

<120> 检测冠状病毒的抗体及其应用

<141> 2022-03-29

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala His His His His His His

420 425

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp Tyr Ala

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Arg Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

20 25

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Trp Asn Trp Asn Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 7

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr

1 5 10 15

Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Asn Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Glu Ile Ser Asn Tyr

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Tyr Ser Ser

1

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser

20 25

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 15

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Glu Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含三个CDR的重链可变区和三个CDR的轻链可变区；其中，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO :2、3、4所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10、11、12所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4；轻链可变区还包括轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4，其中，重链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5、6、7、8所示；轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13、14、15、16所示。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含：

（a）与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变区序列；

（b）与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变区序列；或者

（c）如（a）中的重链可变区序列和如（b）中的轻链可变区序列。

4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含;

（1）与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少 95%序列同一性的重链可变区序列；

（2）与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的轻链可变区序列；或者

（3）如（1）中的重链可变区序列和如（2）中的轻链可变区序列。

5.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体。

6.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体；所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞，其中所述真核细胞不包括植物细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

10.一种药物偶联物，其特征在于，所述偶联物包含权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体。

11.根据权利要求10所述的药物偶联物，其特征在于，所述药物偶联物还包含选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子或酶。

12.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7-9任一项所述的宿主细胞或权利要求10-11任一项所述的药物偶联物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体。

14.一种用于检测或测定样本中冠状病毒的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体。

15.根据权利要求14所述的产品，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂。

16.一种制备权利要求1-4任一项所述单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

培养权利要求7-9任一项所述的宿主细胞，回收单克隆抗体。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述单克隆抗体进行纯化。

18.一种非诊断目的的检测样本中N蛋白的方法，其特征在于，

使权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体接触待测样本；确定所述待测样本中冠状病毒N蛋白的存在或水平。

19.如下任一项所述的应用：

1）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7-9任一项所述的宿主细胞、权利要求14或15所述的产品在非诊断目的的检测冠状病毒N蛋白或冠状病毒感染中的应用；

2）权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7-9任一项所述的宿主细胞、权利要求14或15所述的产品在制备诊断冠状病毒感染相关疾病的产品中的应用。