CN102433339B

CN102433339B - 一种HCV核酸适配体及其在制备HCV-cAg检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN102433339B
Application number: CN201110274973A
Authority: CN
Inventors: 王佳颖; 朱之炜; 郑祖惠; 丁兴龙; 韩娟; 张增丽; 李夫东; 王恒; 江长林
Original assignee: Shandong Lab Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Lab Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2011-09-16
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2031-09-16
Also published as: CN102433339A

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒核心抗原核酸适配体，其中所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；同时本发明还公开了所述丙型肝炎病毒核心抗原核酸适配体在制备HCV核心抗原检测试剂盒中的应用。利用本发明所述适配体及其制备HCV核心抗原检测试剂盒可检出pg/ml级的核心抗原，极大的提高了丙肝核心抗原检测试剂盒的灵敏度，对于窗口期感染者的早期诊断具有重要的临床诊断意义和广阔的应用前景。

Description

一种HCV核酸适配体及其在制备HCV-cAg检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及一种肝炎病毒核酸适配体及其应用，尤其涉及一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体及其在制备丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)检测试剂盒中的应用。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)感染引起的，已成为全球性严重的卫生问题和健康难题。HCV为嗜肝性慢性病毒，经HCV感染后的患者临床症状极不典型，容易造成漏诊。与乙肝相比，丙肝更易发生慢性化，且易早期出现肝硬化、肝癌，死亡率较高，因此HCV的检测对丙型肝炎病毒感染的早期诊断和指导临床治疗有重大的意义。

目前用于HCV感染诊断的两项主要指标为抗-HCV检测和HCV RNA检测，抗-HCV检测存在大约70d的“窗口期”(即从病毒感染起至可以检测出该病毒标准物之前的时期)，这一时期具有很强的感染性，在此时期进行输血、注射等都极有可能造成HCV感染，从而引起疾病的传播，此外该方法也不能用于丙肝患者的疗效监测；而HCVRNA在晚期肝病患者中含量很少，往往检测不到，且该方法技术和环境要求较高，其应用受到很大的限制。2001年Ortho公司推出了检测HCV核心抗原ELISA试剂盒，2005年湖南景达制药有限公司推出了HCV游离核心抗原检测试剂盒，该试剂盒操作简易，对人员、仪器的要求较为简单，但是一旦体内产生了抗体，血清中的抗原、抗体便形成了抗原-抗体复合物，其检测的灵敏度便会大大降低。鉴于此，开发一种快速、操作简单易用、检测灵敏度高的方法在临床诊断中具有十分重要的意义。

近年来，核酸适配体(aptamer)技术有了进一步的发展。核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术从人工合成的DNA文库中筛选得到的能与相应配体专一性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。它分子量小，这段序列可以是RNA，修饰RNA，ssDNA或dsDNA，它具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，更容易进行修饰和标记，更加稳定，且易与传统的酶联免疫技术相结合。适配体富集作用强，可捕捉到血清中微量的疾病靶标标志物，通过酶标记抗体的信号放大程序，实现了对感染性疾病的快速、灵敏、特异性检测，并且还可完成多指标的联合检测，故在疾病的诊断上有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体及其在制备HCV核心抗原检测试剂盒中的应用。

本发明所述丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，上述适配体连接或标记了生物素或荧光素。

本发明所述丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体在制备HCV核心抗原检测试剂盒中的应用。

其中：所述HCV核心抗原检测试剂盒由如下组分构成：

96人份抗HCV-cAg单克隆抗体酶标板1块，阴性对照1瓶，阳性对照1瓶，样品稀释液1瓶，生物素标记HCV-cAg寡核苷酸适配体(Bio-HCV-cAg aptamer)稀释液1瓶，辣根过氧化物酶标记亲和素(Avi-HRP)稀释液1瓶，洗涤液1瓶，显色剂A1瓶，显色剂B1瓶，终止液1瓶，说明书1份，不干胶封片3片。

上述酶标板为透明聚苯乙烯96或48孔酶标板，且其各孔包被有浓度为5ug/ml的包被抗体(所述包被抗体包含HCV核心区2～180氨基酸位置)，包被缓冲液为pH4.7～4.9醋酸盐缓冲液稀释；生物素标记HCV-cAg寡核苷酸适配体(Bio-HCV-cAg aptamer)稀释液为标记上了生物素的丙型肝炎病毒核心抗原寡核苷酸序列的溶液；辣根过氧化物酶标记亲和素(Avi-HRP)稀释液为做了相适稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素(Avi-HRP)；显色体系为3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)体系。

本发明的丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体可以捕获溶液中的丙型肝炎病毒核心蛋白，也可以检测溶液中丙型肝炎病毒的核心蛋白，利用其制备的HCV核心抗原检测试剂盒可以克服现有的检测方法的缺陷，提高检测的灵敏度，且操作简便、特异性强，周期短，极有利于丙型肝炎血清学诊断和血液筛查。

综上，与现有技术相比，本发明的核酸适配体及利用其制备的HCV核心抗原检测试剂盒还具有以下突出优点：

1、使用HCV-cAg aptamer取代了抗--HCV-cAg二抗，具有以下优势：

1)HCV-cAg aptamer通过体外筛选过程进化，不依靠动物、细胞及内环境，易于获得；

2)aptamer筛选周期更短，筛选过程自动化，能应用于大规模的工业生产，节约成本；

3)aptamer较抗体更为稳定，具有较高的特异性和亲和力，重复性好，可有效降低实际生产中批次间的差异。

2、本发明使用BA-ELISA进行检测，该方法利用了生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System BAS)，可以进一步放大检测信号，与aptamer的联合使用，可检出pg/ml级的核心抗原，极大的提高了丙肝核心抗原检测试剂盒的灵敏度，对于窗口期感染者的早期诊断具有重要的临床诊断意义，也预示着良好的应用前景。

附图说明

图1HCV-cAg抗原核酸检测试剂盒的应用方法(ELISA法)检测原理示意图

1为ELISA酶标板；2为抗HCV-cAg单克隆包被抗体；3为捕获的HCV-cAg；4为Bio-HCV-cAg aptamer；5为生物素；6为HRP底物显色反应；7为亲和素；8为HRP辣根过氧化物酶。

图2HCV-cAg适配体二级结构预测图(DNAsis软件分析)。

具体实施方式

实施例1丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体的筛选及确定

依据公开的丙型肝炎病毒核心抗原蛋白氨基酸序列(重点是HCV核心区2～180氨基酸)，以常规方法设计随机核苷酸文库，进行丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体的筛选和优化，最终确定丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体寡核苷酸序列如下(以SEQ ID No.1所示)：

agcagcatga agtcatcgtt gatgttgctg ttatggtagc atgttgcagg tggtatcaac 60

ggagtagctg cacacatgtc acctactgca acc 93

进一步的，将上述丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体寡核苷酸分子用DNAsis软件分析，预测其二级结构如图2所示。

实施例2丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)核酸适配体在制备HCV核心抗原检测试剂盒中的应用

HCV核心抗原检测试剂盒的构成：

上述丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒的制备及实际应用：

1、选聚苯乙烯96孔酶标板，包被抗HCV-cAg单克隆抗体制成检测酶标板：

抗体检测板的最佳制备条件为，使用包被单克隆抗体以最佳包被抗体浓度(5ug/ml)，用pH4.7～4.9醋酸盐缓冲液稀释，每孔加200μl于检测板孔内，置4℃16小时以上。弃去包被液，用PBST洗涤液充分洗涤各孔，每次300μl/孔，随之拍干。加入封闭液，200μl/孔，4℃封闭16小时以上，随后弃去封闭液拍干，室温(不高于25℃)干燥4小时。干燥后的酶标板，迅速真空封口包装，将封装好的板存于2-8℃。

2、阳性对照和阴性对照的制备：

阳性对照为：从HCV感染者静脉采血后分离血清，经EIA和分片段确认HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原均阳性；经PCR法测定HCV为阳性，抗HIV、HBsAg为阴性，60℃水浴1小时后除菌过滤，-20℃保存。

阴性对照为：正常献血员血清，经HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原分别检测均为阴性、抗HIV、HBsAg及TP亦为阴性的人血清，除菌过滤后-20℃保存。

3、Bio-HCV-cAg aptamer的制备：

生物素标记HCV-cAg寡核苷酸适配体序列如下：

5′-Biotin-AGCAGCATGAAGTCATCGTTGATGTTGCTGTTATGGTAGCATGTTGCAGGTGGTATCAACGGAGTAGCTGCACACATGTCACCTACTGCAACC-3′

以上Bio-HCV-cAg aptamer由上海生物工程有限公司合成。

4、Avi-HRP稀释液的配制：

链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物(Avi-HRP)购于南京赛泓瑞生物科技有限公司，效价：1∶500～1∶2000，用PBST稀释1000倍。

5、HCV-cAg样品稀释液、浓缩洗涤液的配制：

6、显色系统试剂的配制：

7、本发明的丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒的应用及操作程序：

(1)平衡：从冷藏环境中取出的试剂及样品，应于室温(18～25℃)平衡约30分钟。

(2)配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水作20倍稀释成工作浓度洗涤液，如产生结晶，应待其于室温溶解后再稀释。

(3)加样：取96孔包被酶标板，预设置空白、阴性、阳性对照各2孔。每孔中先加入100μl样品稀释液(空白对照每孔加入200μl样品稀释液)；然后阴、阳性对照孔加入100μl阴、阳性对照，其余孔按设定各加入100μl待测样品；加样完毕后用不干胶封片封盖反应板，37℃振荡孵育60分钟。

(4)洗板：甩去板孔中的液体，在吸水纸上拍干；用工作浓度洗涤液洗板6次，最后拍干。

(5)加Bio-HCV-cAg aptamer稀释液：每孔加入200μl，用不干胶封片封盖反应板，37℃孵育60分钟。

(7)洗板：同(4)。

(8)加Avi-HRP结合物：每孔加入200μl，37℃孵育30分钟；

(9)洗板：同(4)。

(10)加底物：每孔先后加入显色剂A、显色剂B各100μl，避光显色20分钟。

(9)测定：每孔加50μl终止液，混匀。10分钟内以酶标仪450nm和630nm(参比波长)双波长测定各孔OD值。

(10)以阴性对照吸光度(0D)的平均值+0.05为临界值(CUT OFF)；待检样品的0D值＞临界值(CUT OFF)为阳性，待测样品0D值＜临界值(CUT OFF)为阴性为判定标准进行判定。

本发明中所述单克隆抗体和重组抗原购自湖南远泰生物技术有限公司。

8、试剂盒的特异性、灵敏度、精密度的检测：

1)以阴、阳性血清作为质控测试试剂特异性及准确性。用5份阴性血清检定，无一例阳性；用5份阳性血清检定，无一例阴性。

结果统计见表1：

表1准确性及特异性试验结果(0D值)

2)精密性试验：结果统计见表2：

表2精密性试验结果(OD值)

精密性：CV％＝6.06％，小于15％。

3)灵敏度试验：以HCV抗原浓度梯度检测不同量抗原时试剂反应灵敏度。

结果统计见表3：

表3灵敏度试验结果(0D值)

试验结果表明，最低检出限为10pg/ml；在所设定cut off临界值下，标本阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，符合质控标准。

Claims

1.一种丙型肝炎病毒核心抗原核酸适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述丙型肝炎病毒核心抗原核酸适配体在制备HCV核心抗原检测试剂盒中的应用。