JPS62278459A - エイズウイルス感染の検出方法 - Google Patents
エイズウイルス感染の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
3、発明の詳細な説明
〔発明の背景〕
l1発明の分野
いわゆる後天性免疫不全症候群(AIDS、エイズ)と
いう病気は、ごく最近確認されたばかりであるが、世界
中の多くの国々に恐るべき状況をもたらした。診断され
た年間症例数は急速に上昇し、非常に多数の死者が出た
。最近まで、この病気は明らかに、主として多数の性交
相手と同性愛関係にある男性、麻薬静注常用者、血友病
者、輸血を受けた者および前記の群の者と緊密な性的関
係のある者に流行した。エイズへの関心は高まっており
、この病気に関する多くの研究が既に行なわれてきたに
も拘わらず、この病気の原因および治療法は医学界およ
び科学界を惑わせ′るものであった。
いう病気は、ごく最近確認されたばかりであるが、世界
中の多くの国々に恐るべき状況をもたらした。診断され
た年間症例数は急速に上昇し、非常に多数の死者が出た
。最近まで、この病気は明らかに、主として多数の性交
相手と同性愛関係にある男性、麻薬静注常用者、血友病
者、輸血を受けた者および前記の群の者と緊密な性的関
係のある者に流行した。エイズへの関心は高まっており
、この病気に関する多くの研究が既に行なわれてきたに
も拘わらず、この病気の原因および治療法は医学界およ
び科学界を惑わせ′るものであった。
エイズの根本原理に関する重大な進歩および理解は、エ
イズ患者またはエイズ関連コンプレックス(ARC)患
者から得られた新規種類のレトロウィルスの単離であっ
た。この群のウィルスは、リンホアデノパシーウイルス
(Lymphadenopathy virus、LA
V)(ウニイン・ホブソン等、「セルJ(Ce11)、
40巻、9−17(1978年)記載〕、ひとTリンホ
トロビックウイルスl(human T Iympho
tropic virus [[、HTLV−[)Cラ
トナー等、「ネイチャー J(Nature)、313
巻、277−84(1985年)記載〕およびエイズー
アソシエイティッドレトロウイルス(A I D S
−associatedretrovirus、 AR
V) Cサンチェス・ベスカドール等、「サイエンスj
(S c 1ence)、227巻、484−492(
1985年)記載〕と様々に呼ばれている。形態学的お
よび生物学的見地によると、この群のウィルスはレンチ
ウィルス科と最も密接な関係にある。
イズ患者またはエイズ関連コンプレックス(ARC)患
者から得られた新規種類のレトロウィルスの単離であっ
た。この群のウィルスは、リンホアデノパシーウイルス
(Lymphadenopathy virus、LA
V)(ウニイン・ホブソン等、「セルJ(Ce11)、
40巻、9−17(1978年)記載〕、ひとTリンホ
トロビックウイルスl(human T Iympho
tropic virus [[、HTLV−[)Cラ
トナー等、「ネイチャー J(Nature)、313
巻、277−84(1985年)記載〕およびエイズー
アソシエイティッドレトロウイルス(A I D S
−associatedretrovirus、 AR
V) Cサンチェス・ベスカドール等、「サイエンスj
(S c 1ence)、227巻、484−492(
1985年)記載〕と様々に呼ばれている。形態学的お
よび生物学的見地によると、この群のウィルスはレンチ
ウィルス科と最も密接な関係にある。
人体におけるエイズウィルス感染の第一の標的は、T細
胞の特異的副次集団である。これらの患者の免疫不全が
重(なると、リンパ球集団におけるT細胞(T4)の割
合が著しく低下する。結果として、多くのT4ヘルパー
機能の有効性が低下する。そのような機能の一つがB細
胞による抗体の産生である。
胞の特異的副次集団である。これらの患者の免疫不全が
重(なると、リンパ球集団におけるT細胞(T4)の割
合が著しく低下する。結果として、多くのT4ヘルパー
機能の有効性が低下する。そのような機能の一つがB細
胞による抗体の産生である。
エイズ患者に起こる細胞免疫性の著しい低下およびTリ
ンパ球の副次集団の量的変化は、T細胞またはT細胞の
サブセットが、感染源と推定されているものの優先的標
的であり得ることを示唆する。他方、これらの変化は後
続の感染からも生じ得る。細胞免疫性が低下すると、こ
れに乗じてエイズ患者に重い感染症が発現し、患者の多
くはカポノ肉腫を発病する。多様なリンホアデノパンー
もまたエイズを発病する可能性のある同性愛の男性およ
び幼児について記載されている。リンホアデノパシーは
この病気の初期または軽い状態に対応し得る。
ンパ球の副次集団の量的変化は、T細胞またはT細胞の
サブセットが、感染源と推定されているものの優先的標
的であり得ることを示唆する。他方、これらの変化は後
続の感染からも生じ得る。細胞免疫性が低下すると、こ
れに乗じてエイズ患者に重い感染症が発現し、患者の多
くはカポノ肉腫を発病する。多様なリンホアデノパンー
もまたエイズを発病する可能性のある同性愛の男性およ
び幼児について記載されている。リンホアデノパシーは
この病気の初期または軽い状態に対応し得る。
現在HTLV−[[ウィルスに特異的な血清抗体の存在
を確立するための3種の主な試験がある。
を確立するための3種の主な試験がある。
最も広範に使用されている方法は、HT L V −I
IIウィルス性リすイトで被覆したウェルまたはビーズ
を用いる固相酵素免疫測定法(ELISA)スクリーン
である。血清陽性試料から得られた特異的抗体は、抗原
被覆表面に結合し、次いで酵素結合抗ひと抗体および適
当な色素原基質と結合する。
IIウィルス性リすイトで被覆したウェルまたはビーズ
を用いる固相酵素免疫測定法(ELISA)スクリーン
である。血清陽性試料から得られた特異的抗体は、抗原
被覆表面に結合し、次いで酵素結合抗ひと抗体および適
当な色素原基質と結合する。
第2の抗体検出方法は、EL I SAスクリーンの確
認試験として最もよく用いられる、エンザイムリンクト
イムノエレクトロトランスファープロットまたはウェス
タンプロット技術である。HTLV−■ウィルス性すゼ
イトをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(SDS−PAGE)により一連の帯に分割
すると、各々がウィルスゲノムの特定の生成物を規定す
る。次いで抗原帯をEL I SAスクリーンと同様、
ELISA法に用いるニトロセルロース膜にトランスプ
ロットする。ウェスタンプロットの原則的利点は、ウィ
ルス抗原を非常に高い特異性を与える個々の帯に分割す
ることである。ウェスタンプロットにより解明された2
つの帯があるが、それらの一方または両方が、この試験
のEL I SA部分により検出された場合、HTLV
−III特異的抗体の存在を示すものであると考えられ
る。第1の帯は24000ダルトンのコア蛋白質である
。第2の帯は41000ダルトンの糖蛋白質であり、こ
れはウィルスエンベロープの一部を構成スる。ELIS
Aスクリーンにおける結果が不確かな場合ウェスタンプ
ロットにより解明されることが多い。
認試験として最もよく用いられる、エンザイムリンクト
イムノエレクトロトランスファープロットまたはウェス
タンプロット技術である。HTLV−■ウィルス性すゼ
イトをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(SDS−PAGE)により一連の帯に分割
すると、各々がウィルスゲノムの特定の生成物を規定す
る。次いで抗原帯をEL I SAスクリーンと同様、
ELISA法に用いるニトロセルロース膜にトランスプ
ロットする。ウェスタンプロットの原則的利点は、ウィ
ルス抗原を非常に高い特異性を与える個々の帯に分割す
ることである。ウェスタンプロットにより解明された2
つの帯があるが、それらの一方または両方が、この試験
のEL I SA部分により検出された場合、HTLV
−III特異的抗体の存在を示すものであると考えられ
る。第1の帯は24000ダルトンのコア蛋白質である
。第2の帯は41000ダルトンの糖蛋白質であり、こ
れはウィルスエンベロープの一部を構成スる。ELIS
Aスクリーンにおける結果が不確かな場合ウェスタンプ
ロットにより解明されることが多い。
また、陽性スクリーン(特に低リスク群の対象間で)が
ウェスタンプロットで再び測定した場合陰性であると判
明することも多い。
ウェスタンプロットで再び測定した場合陰性であると判
明することも多い。
第3の抗体試験は、ウィルス感染リンパ様細胞を用いた
間接的免疫蛍光測定法であり、前記細胞をまず低音の血
清と反応させ、次いで蛍光色素コンツユゲート抗ひと抗
体と反応させる。感染細胞の蛍光性は陽性試験結果の構
成要素である。非感染リンパ様細胞を用いると陰性対照
が得られ、ウィルスではなく細胞に対して特異的な抗体
を検出できる。
間接的免疫蛍光測定法であり、前記細胞をまず低音の血
清と反応させ、次いで蛍光色素コンツユゲート抗ひと抗
体と反応させる。感染細胞の蛍光性は陽性試験結果の構
成要素である。非感染リンパ様細胞を用いると陰性対照
が得られ、ウィルスではなく細胞に対して特異的な抗体
を検出できる。
HTLV−III抗体に関するELISAスクリーンお
よびウェスタンプロット確認試験の使用は、国による血
液供給物から汚染血液製品を除去し、感染した臓器およ
び精液ドナーを検出するための有用なスクリーニング手
段であった。しかしながら、HT L V−[1ウイル
スに特異的な血清抗体の検出はエイズの診断とはならな
い。血清陽性の場合、患者が生きているウィルスに暴露
されたことがあるのか、感染しているのか、または活発
に増殖しているウィルスを保有しているのかは判明せず
、病気の経過に関す°る何等かの情報ら提供されない。
よびウェスタンプロット確認試験の使用は、国による血
液供給物から汚染血液製品を除去し、感染した臓器およ
び精液ドナーを検出するための有用なスクリーニング手
段であった。しかしながら、HT L V−[1ウイル
スに特異的な血清抗体の検出はエイズの診断とはならな
い。血清陽性の場合、患者が生きているウィルスに暴露
されたことがあるのか、感染しているのか、または活発
に増殖しているウィルスを保有しているのかは判明せず
、病気の経過に関す°る何等かの情報ら提供されない。
高率の血清陽性血友病者は、現在の技術では彼等の血液
中におけるウィルスの存在を示さない。前記患者は各々
加熱処理したファクター■製剤に含まれる不活化ウィル
スに′a露されたと思われろ。しかしながら、他の個々
の血清陽性者の場合、特異的抗体の存在およびHTLV
−IIIウィルス培養能力間の相関関係は強い。
中におけるウィルスの存在を示さない。前記患者は各々
加熱処理したファクター■製剤に含まれる不活化ウィル
スに′a露されたと思われろ。しかしながら、他の個々
の血清陽性者の場合、特異的抗体の存在およびHTLV
−IIIウィルス培養能力間の相関関係は強い。
ひと体液中のHT L V −IIIウィルス感染によ
る抗原の存在を検出する実用的な方法は、エイズの信頼
できる診断試験およびエイズ患者の処置における有効性
について試験中の幾つかの実験薬剤の効果を評価する手
段を提供する上で必要不可欠なものである。
る抗原の存在を検出する実用的な方法は、エイズの信頼
できる診断試験およびエイズ患者の処置における有効性
について試験中の幾つかの実験薬剤の効果を評価する手
段を提供する上で必要不可欠なものである。
現在、血液中のHTLV−III[ウィルスを検出する
原則的方法では、3日毎に新鮮な植物性血球凝集素(フ
ィトヘマグルチン、PHA)刺激抹消血液リンパ球(P
BL)を加えながら、患者のリンパ球をP HA刺激P
BLと混合する。次いで3日毎に上清試料を逆転写酵素
の存在に関して試験する。
原則的方法では、3日毎に新鮮な植物性血球凝集素(フ
ィトヘマグルチン、PHA)刺激抹消血液リンパ球(P
BL)を加えながら、患者のリンパ球をP HA刺激P
BLと混合する。次いで3日毎に上清試料を逆転写酵素
の存在に関して試験する。
電子顕微鏡法によりウィルスの存在に関して細胞を検査
する。明らかに、この方法は高水準の設備、P3封じ込
め並びに精巧な組織培養および分析能力を有する場合に
限定される。結果は数週間を必要とし得るもので、ウィ
ルスによるリンパ球培養感染の信頼性は疑わしい。H9
として知られているセルラインの使用はある程度有用で
あるが、前記の問題の大部分は残存している。
する。明らかに、この方法は高水準の設備、P3封じ込
め並びに精巧な組織培養および分析能力を有する場合に
限定される。結果は数週間を必要とし得るもので、ウィ
ルスによるリンパ球培養感染の信頼性は疑わしい。H9
として知られているセルラインの使用はある程度有用で
あるが、前記の問題の大部分は残存している。
2、関連技術の記載
エイズまたはエイズ抗体の存在を測定するある種の診断
技術は公知である。そのような技術の一つは、T細胞お
よびT細胞副次集団に関して行なわれろヘルパー−サプ
レッサー細胞測定法である。
技術は公知である。そのような技術の一つは、T細胞お
よびT細胞副次集団に関して行なわれろヘルパー−サプ
レッサー細胞測定法である。
ヘルパーサプレッサー比の逆転をエイズウィルスの存在
可能性を示すものとしてとらえる。この測定法の特異性
および感度は低い。別の技術はチモンン濃度の測定を行
うもので、濃度の上昇はエイズウィルスの存在を示す。
可能性を示すものとしてとらえる。この測定法の特異性
および感度は低い。別の技術はチモンン濃度の測定を行
うもので、濃度の上昇はエイズウィルスの存在を示す。
この技術は病気が進行した段階でのみ陽性の結果を示す
。さらに、この技術は、エイズウィルスの存在がわかっ
ている場合でも必ずしも常に陽性を示すわけではないこ
とが報告された。免疫細胞付着(ロゼツト阻害)技術の
使用を含む哺乳類対象におけるエイズの診断法は、ヨー
ロッパ特許出願公開第0154499号に開示されてい
る。米国特許第4520113号は、エイズおよび前エ
イズ症状を示す甑者の血清におけるHTLV−I[[に
対する抗体の血清学検出法を開示している。ひとT細胞
のヘルパー誘導機能と関連する後期分化抗原は、[ネイ
チャーJ(Nature)(1985)318巻465
−467に記載されている。特定のTリンホトロピック
レトロウイルス抗原を用いるエイズまたはリンホアデノ
パシー症候群の診断法は、ヨーロッパ特許出願公開第0
138667号に記載されている。
。さらに、この技術は、エイズウィルスの存在がわかっ
ている場合でも必ずしも常に陽性を示すわけではないこ
とが報告された。免疫細胞付着(ロゼツト阻害)技術の
使用を含む哺乳類対象におけるエイズの診断法は、ヨー
ロッパ特許出願公開第0154499号に開示されてい
る。米国特許第4520113号は、エイズおよび前エ
イズ症状を示す甑者の血清におけるHTLV−I[[に
対する抗体の血清学検出法を開示している。ひとT細胞
のヘルパー誘導機能と関連する後期分化抗原は、[ネイ
チャーJ(Nature)(1985)318巻465
−467に記載されている。特定のTリンホトロピック
レトロウイルス抗原を用いるエイズまたはリンホアデノ
パシー症候群の診断法は、ヨーロッパ特許出願公開第0
138667号に記載されている。
この発明は、例えば体液または培養培地のような媒質中
におけるHTLV−1感染細胞の存在の検出方法に関す
る。この方法は、媒質を感染の結果生成された抗原に対
するモノクローナル抗体と接触させ、抗体と抗原の結合
を検出することから成るものである。抗原はHTLV−
[[ウィルス遺伝子生成物であり得、またはそのような
生成物と結合し得る。別法として、抗原は感染の結果生
成され得、ヘルパーT細胞のようなリンパ球上に見出さ
れ得る。
におけるHTLV−1感染細胞の存在の検出方法に関す
る。この方法は、媒質を感染の結果生成された抗原に対
するモノクローナル抗体と接触させ、抗体と抗原の結合
を検出することから成るものである。抗原はHTLV−
[[ウィルス遺伝子生成物であり得、またはそのような
生成物と結合し得る。別法として、抗原は感染の結果生
成され得、ヘルパーT細胞のようなリンパ球上に見出さ
れ得る。
さらにこの発明は、宿主におけるエイズウィルス関連感
染検出免疫測定方法を含む。この方法は、宿主から採取
した体液を、感染が存在するときのみ存在する抗原と結
合するモノクローナル抗体と合わせ、そして抗原および
モノクローナル抗体から成る免疫複合体の存在に関して
上記混合物を検査することから成る。
染検出免疫測定方法を含む。この方法は、宿主から採取
した体液を、感染が存在するときのみ存在する抗原と結
合するモノクローナル抗体と合わせ、そして抗原および
モノクローナル抗体から成る免疫複合体の存在に関して
上記混合物を検査することから成る。
またこの発明はひとHTLV−IIII感染の結果生成
された血清抗原に結合し得る抗体を含む。抗原はHT
L V−IIIウィルス遺伝子生成物上にあり得、また
は)TTLV−IIIウィルス遺伝子生成物と結合し得
る。別法として、抗原はHTLV−(I[ウィルス感染
゛の結果リンパ球と結合し得る。本発明の抗体を発現す
る特性を有するハイブリッド連続セルラインもまた含ま
れる。
された血清抗原に結合し得る抗体を含む。抗原はHT
L V−IIIウィルス遺伝子生成物上にあり得、また
は)TTLV−IIIウィルス遺伝子生成物と結合し得
る。別法として、抗原はHTLV−(I[ウィルス感染
゛の結果リンパ球と結合し得る。本発明の抗体を発現す
る特性を有するハイブリッド連続セルラインもまた含ま
れる。
診断用キットもまた提供されるが、このキットは、エイ
ズウィルス病原体による感染の結果生成された抗原と結
合し得るモノクローナル抗体またはそのような抗体の標
識された誘導体を組み合わせてパッケージしたものであ
る。
ズウィルス病原体による感染の結果生成された抗原と結
合し得るモノクローナル抗体またはそのような抗体の標
識された誘導体を組み合わせてパッケージしたものであ
る。
この発明の別の態様は、細胞培養中のHT L V−[
ウィルス感染の早期発見方法に関する。この方法は、H
TLV−IIIウィルス感染が疑われる細胞を本発明の
モノクローナル抗体と合わせることから成る。抗体およ
び抗原の結合の検出は細胞培養におけるHTLV−fI
IIウィルス感染の存在を示す。
ウィルス感染の早期発見方法に関する。この方法は、H
TLV−IIIウィルス感染が疑われる細胞を本発明の
モノクローナル抗体と合わせることから成る。抗体およ
び抗原の結合の検出は細胞培養におけるHTLV−fI
IIウィルス感染の存在を示す。
またこの発明は、r(a)HTLV−III遺伝子生成
物またはその誘導体」と結合するモノクローナル抗体お
よび「藺期(b)遺伝子生成物または誘導体」から成る
複合体を含む組成物を含む。この発明による別の組成物
は、(a)HT L V −m遺伝子生成物以外でHT
LV−旧感染の結果生成された細胞結合抗原に結合し得
るモノクローナル抗体および(b)前記抗原から成る複
合体を含む。
物またはその誘導体」と結合するモノクローナル抗体お
よび「藺期(b)遺伝子生成物または誘導体」から成る
複合体を含む組成物を含む。この発明による別の組成物
は、(a)HT L V −m遺伝子生成物以外でHT
LV−旧感染の結果生成された細胞結合抗原に結合し得
るモノクローナル抗体および(b)前記抗原から成る複
合体を含む。
この発明の実施態様の記載を行う前に、若干の用語を定
義する。
義する。
「エイズ(AIDS)ウィルス」は、ArDs、ARC
SLADおよび関連疾患を引き起こすかまたは引き起こ
す疑いがあるものとして知られている)(TLサー■、
ARV、L A Vおよび関連ウィルスを包含する。
SLADおよび関連疾患を引き起こすかまたは引き起こ
す疑いがあるものとして知られている)(TLサー■、
ARV、L A Vおよび関連ウィルスを包含する。
「エイズ関連疾患」は、エイズ、エイズ関連コンプレッ
クス(ARC)、リンホアデノパンー(LAD)、進行
性一般すンホアデノパンー(PGL)およびエイズウィ
ルス感染が原因であることが知られているかまたは疑わ
れている関連疾患である病気を包含する。
クス(ARC)、リンホアデノパンー(LAD)、進行
性一般すンホアデノパンー(PGL)およびエイズウィ
ルス感染が原因であることが知られているかまたは疑わ
れている関連疾患である病気を包含する。
「溶性エイズ抗原」は、エイズウィルス感染の結果生成
され、細胞膜に結合せず、エイズ関連ウィルスに感染し
た者に特有の抗原を包含する。
され、細胞膜に結合せず、エイズ関連ウィルスに感染し
た者に特有の抗原を包含する。
「細胞結合エイズ抗原」は、細胞膜に結合した、エイズ
ウィルスに感染した者に特有の抗原を包含する。
ウィルスに感染した者に特有の抗原を包含する。
「体液」は、哺乳類対象の体から得られた液体または半
固体物質を包含する。液体材料は無菌または非無菌状態
であり得、通常細胞を含有する。液体物質はそれ以上処
理せずに使用され得るか、または液体物質を処理して細
胞、残骸などを除去し得る。体液の例には、全血、リン
パ液、血清、血漿、唾液、精液および脳脊髄液がある。
固体物質を包含する。液体材料は無菌または非無菌状態
であり得、通常細胞を含有する。液体物質はそれ以上処
理せずに使用され得るか、または液体物質を処理して細
胞、残骸などを除去し得る。体液の例には、全血、リン
パ液、血清、血漿、唾液、精液および脳脊髄液がある。
体液は、例えば注射器または針によるかまたは自然排出
により対象から採取され得る。
により対象から採取され得る。
「細胞」は、単細胞生物例えば細菌、および通常哺乳類
の体液から得られる正常および形質転換された細胞を包
含する。細胞は感染または非感染状態であり得、または
非培養または培養されたものであり得る。
の体液から得られる正常および形質転換された細胞を包
含する。細胞は感染または非感染状態であり得、または
非培養または培養されたものであり得る。
「リンパ球」は、リンパ腺およびリンパ節の細網組織に
生じる様々な白血球微粒子または細胞を包含する。核は
単一であり、一般に無顆粒として記載される原形質によ
り囲まれている。赤血球微粒子の大きさ程度の小さなリ
ンパ球および発達段階にあると思われるリンパ球で、小
さなリンパ球の2または3倍の大きさがあり、原形質の
大部分を含む大きなリンパ球がある。
生じる様々な白血球微粒子または細胞を包含する。核は
単一であり、一般に無顆粒として記載される原形質によ
り囲まれている。赤血球微粒子の大きさ程度の小さなリ
ンパ球および発達段階にあると思われるリンパ球で、小
さなリンパ球の2または3倍の大きさがあり、原形質の
大部分を含む大きなリンパ球がある。
「Tリンパ球」は、胸腺に由来するリンパ球を包含する
。T細胞の主な機能は、ヘルパーおよびサプレッサー機
能によるB細胞の免疫応答の調節である。T細胞は、一
般の抗体を産生じないため、Bリンパ球という名称の骨
髄から生じる抗体産生細胞とは異なる。
。T細胞の主な機能は、ヘルパーおよびサプレッサー機
能によるB細胞の免疫応答の調節である。T細胞は、一
般の抗体を産生じないため、Bリンパ球という名称の骨
髄から生じる抗体産生細胞とは異なる。
「ヘルパーT細胞」は、サプレッサー機能に対抗するヘ
ルパー機能でB細胞の免疫応答を調節することが主な機
能であるTリンパ球を包含する。
ルパー機能でB細胞の免疫応答を調節することが主な機
能であるTリンパ球を包含する。
「ウィルス遺伝子生成物」には、例えばRNAまたはD
N A +fi製によるエイズ関連ウィルス由来の抗
原が挙げられる。
N A +fi製によるエイズ関連ウィルス由来の抗
原が挙げられる。
この発明は、媒質中においてエイズ関連ウィルス例えば
HTLV−IIIに感染した細胞の存在を検出する方法
に関する。この方法は、媒質を感染の結果生成された抗
原に対するモノクローナル抗体と接触させ、さらに抗原
と抗体の結合を検出することから成るものである。抗原
および抗体間に結合が生じた場合は、媒質中の細胞にお
けるエイズ関連ウィルス感染の存在を示す。媒質は例え
ば体液または培養培地であり得る。抗原は溶性抗原また
は細胞結合抗原であり得る。さらに、抗原はウィルス遺
伝子生成物であるか、またはウィルス遺伝子生成物に結
合し得る。抗原がウィルス遺伝子生成物ではない場合は
、細胞のエイズ関連ウィルス感染の結果生成される。抗
原はリンパ球例えばヘルパーT細胞またはマクロファー
ジと結合し得る。普通、抗原がウィルス遺伝子生成物で
ある場合、この方法では感染細胞と抗体の結合の検出を
行う。
HTLV−IIIに感染した細胞の存在を検出する方法
に関する。この方法は、媒質を感染の結果生成された抗
原に対するモノクローナル抗体と接触させ、さらに抗原
と抗体の結合を検出することから成るものである。抗原
および抗体間に結合が生じた場合は、媒質中の細胞にお
けるエイズ関連ウィルス感染の存在を示す。媒質は例え
ば体液または培養培地であり得る。抗原は溶性抗原また
は細胞結合抗原であり得る。さらに、抗原はウィルス遺
伝子生成物であるか、またはウィルス遺伝子生成物に結
合し得る。抗原がウィルス遺伝子生成物ではない場合は
、細胞のエイズ関連ウィルス感染の結果生成される。抗
原はリンパ球例えばヘルパーT細胞またはマクロファー
ジと結合し得る。普通、抗原がウィルス遺伝子生成物で
ある場合、この方法では感染細胞と抗体の結合の検出を
行う。
この発明の範囲内に含まれる抗体は、H−TLV−■ウ
ィルス感染の結果生成された血清抗原に結合することが
できる。抗原はHTLV−[[ウィルス遺伝子生成物で
あるかまたはHTLV−IIIウィルス遺伝子生成物に
結合している。別法として、抗原はリンパ球と結合し得
、HTLV−III感染の結果生成される。普通、溶性
抗原はウィルス遺伝子生成物で(おない。
ィルス感染の結果生成された血清抗原に結合することが
できる。抗原はHTLV−[[ウィルス遺伝子生成物で
あるかまたはHTLV−IIIウィルス遺伝子生成物に
結合している。別法として、抗原はリンパ球と結合し得
、HTLV−III感染の結果生成される。普通、溶性
抗原はウィルス遺伝子生成物で(おない。
この発明の方法に有用なモノクローナル抗体は、ケーラ
ーおよびミルシュタイン、「ネイチャーJ(Natur
e)、265巻、495−497(1975)記載の標
準的技術にしたがい製造され得る。例えば、ひとリンパ
腫で生長したHTLV−III由来の部分的に精製され
たウィルス性すゼイト、H9セルラインが免疫原として
用いられ得る。HTLV−III抗原製剤の試料をマウ
スに注射し、時間を充分おいた後、マウスを殺し、ひ臓
細胞を摘出する。所望の免疫グロブリンの塩基配列をコ
ードするひ臓細胞染色体は、一般に非イオン性デタージ
エント、例えばポリエチレングリコールの存在下、ひ臓
細胞をミエローマセルラインと融合させることにより保
存(不死化)する。融合したハイブリドーマを含む生成
した細胞を選択培地、例えばI(AT−培地において生
長させ、そして生き残った細胞を制限希釈条件を用いて
前記培地中で生長させる。細胞を適当な容器、例えばマ
イクロタイターウェル中で生長させ、所望の特異性を有
するモノクローナル抗体について上清をスクリーンする
。
ーおよびミルシュタイン、「ネイチャーJ(Natur
e)、265巻、495−497(1975)記載の標
準的技術にしたがい製造され得る。例えば、ひとリンパ
腫で生長したHTLV−III由来の部分的に精製され
たウィルス性すゼイト、H9セルラインが免疫原として
用いられ得る。HTLV−III抗原製剤の試料をマウ
スに注射し、時間を充分おいた後、マウスを殺し、ひ臓
細胞を摘出する。所望の免疫グロブリンの塩基配列をコ
ードするひ臓細胞染色体は、一般に非イオン性デタージ
エント、例えばポリエチレングリコールの存在下、ひ臓
細胞をミエローマセルラインと融合させることにより保
存(不死化)する。融合したハイブリドーマを含む生成
した細胞を選択培地、例えばI(AT−培地において生
長させ、そして生き残った細胞を制限希釈条件を用いて
前記培地中で生長させる。細胞を適当な容器、例えばマ
イクロタイターウェル中で生長させ、所望の特異性を有
するモノクローナル抗体について上清をスクリーンする
。
モノクローナル抗体の収率を高めるための様々な技術が
存在し、例えばハイブリドーマ細胞を哺乳類宿主の腹膜
腔に注射する方法があるが、この宿主が細胞を受は入れ
、その後腹水を採取する。
存在し、例えばハイブリドーマ細胞を哺乳類宿主の腹膜
腔に注射する方法があるが、この宿主が細胞を受は入れ
、その後腹水を採取する。
不充分な量のモノクローナル抗体しか腹水に集まらない
場合、宿主の血液から抗体を採取する。池の蛋白質およ
び他の汚染物質からモノクローナル抗体を単離および精
製するための様々な慣用手段が存在する(ケーラーおよ
びミルシュタイン、前出参照)。
場合、宿主の血液から抗体を採取する。池の蛋白質およ
び他の汚染物質からモノクローナル抗体を単離および精
製するための様々な慣用手段が存在する(ケーラーおよ
びミルシュタイン、前出参照)。
この発明の方法において有用なモノクローナル抗体の一
例には、3D8という名称のハイブリッド連続セルライ
ンにより発現された新規抗体がある。このモノクローナ
ル抗体は、細胞に結合したHTLV−[遺伝子生成物で
ある抗原上の決定基に結合する。エイズ感染細胞のリゼ
イトを、ドデンル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド
表面ゲル電気泳動(SDS−PAGE)に付す。ニトロ
セルロースに結合しfこモノクローナル抗体を、ウェス
タンプロット技術に従いS D S P A G E
ゲルにより展開した。抗体3D8は、55キロダルトン
および65キロダルトンの逆転写酵素(p55およびp
65)、24キロダルトンのコア蛋白質(p24)、4
1キロダルトンの糖蛋白質エンベロープ抗原(gp41
)および39キロダルトンの不確定蛋白質(p39)に
結合するということが決定された。
例には、3D8という名称のハイブリッド連続セルライ
ンにより発現された新規抗体がある。このモノクローナ
ル抗体は、細胞に結合したHTLV−[遺伝子生成物で
ある抗原上の決定基に結合する。エイズ感染細胞のリゼ
イトを、ドデンル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド
表面ゲル電気泳動(SDS−PAGE)に付す。ニトロ
セルロースに結合しfこモノクローナル抗体を、ウェス
タンプロット技術に従いS D S P A G E
ゲルにより展開した。抗体3D8は、55キロダルトン
および65キロダルトンの逆転写酵素(p55およびp
65)、24キロダルトンのコア蛋白質(p24)、4
1キロダルトンの糖蛋白質エンベロープ抗原(gp41
)および39キロダルトンの不確定蛋白質(p39)に
結合するということが決定された。
p55およびp65という名称の抗原、コア蛋白質抗原
p24および糖蛋白質エンベロープ抗原gp41は、「
サイエンスJ(ScienceXl 986)231巻
1289−1291に記載されている。不確定蛋白質p
28、p39、p49およびp52は、細胞に結合して
いるが)I T L V −m遺伝子生成物ではない抗
原であり得る。これらの抗原はエイズウィルス感染の結
果生成されたちのであり、細胞の感染したことを明らか
にする。他方、p28、p49およびp52蛋白質は、
ひとにおけろ免疫原ではないウィルス遺伝子生成物であ
り得る。p41、p55およびp65抗原は、溶性抗原
であると思われる。ウェスタンプロット観察に基づくと
、3D8抗体および下記の抗体は、上記抗原上の種々の
決定基を認識し得る。3DB抗体は1gMアイソタイプ
に属する。3DB抗体は正常なリンパ球またはセルライ
ンH9もしくはOEM由来の細胞には結合しない。
p24および糖蛋白質エンベロープ抗原gp41は、「
サイエンスJ(ScienceXl 986)231巻
1289−1291に記載されている。不確定蛋白質p
28、p39、p49およびp52は、細胞に結合して
いるが)I T L V −m遺伝子生成物ではない抗
原であり得る。これらの抗原はエイズウィルス感染の結
果生成されたちのであり、細胞の感染したことを明らか
にする。他方、p28、p49およびp52蛋白質は、
ひとにおけろ免疫原ではないウィルス遺伝子生成物であ
り得る。p41、p55およびp65抗原は、溶性抗原
であると思われる。ウェスタンプロット観察に基づくと
、3D8抗体および下記の抗体は、上記抗原上の種々の
決定基を認識し得る。3DB抗体は1gMアイソタイプ
に属する。3DB抗体は正常なリンパ球またはセルライ
ンH9もしくはOEM由来の細胞には結合しない。
この発明の方法において有用な別のモノクローナル抗体
の例には、3F7という名称のハイブリッド連続セルラ
インにより発現される新規抗体がある。5DS−PAG
Eおよびウェスタンプロット技術を用いて同様に測定し
た結果、抗体3F7はp24抗原、p49抗原、p55
抗原およびp65抗原に結合することがわかった。3F
7抗体は【gG 1アイソタイプに属する。3F7抗体
は正常なリンパ球、H9細胞またはOEM細胞と高い強
度では結合しない。「高い強度」の語は、フローサイト
メトリーにおける染色細胞および非染色細胞のピークが
離れていることを意味する。
の例には、3F7という名称のハイブリッド連続セルラ
インにより発現される新規抗体がある。5DS−PAG
Eおよびウェスタンプロット技術を用いて同様に測定し
た結果、抗体3F7はp24抗原、p49抗原、p55
抗原およびp65抗原に結合することがわかった。3F
7抗体は【gG 1アイソタイプに属する。3F7抗体
は正常なリンパ球、H9細胞またはOEM細胞と高い強
度では結合しない。「高い強度」の語は、フローサイト
メトリーにおける染色細胞および非染色細胞のピークが
離れていることを意味する。
この発明の方法において有用な別のモノクローナル抗体
の例には、3G12という名称のハイブリッド連続セル
ラインにより発現される新規抗体がある。5DS−PA
GEおよびウェスタンプロット技術を組み合わせて測定
した結果、抗体3G12はp24抗原およびp55抗原
に結合することがわかった。3G+2抗体はIgG
lアイソタイプに属する。3G+2抗体は正常なリンパ
球またはOEMEM細胞い強度では結合しない。
の例には、3G12という名称のハイブリッド連続セル
ラインにより発現される新規抗体がある。5DS−PA
GEおよびウェスタンプロット技術を組み合わせて測定
した結果、抗体3G12はp24抗原およびp55抗原
に結合することがわかった。3G+2抗体はIgG
lアイソタイプに属する。3G+2抗体は正常なリンパ
球またはOEMEM細胞い強度では結合しない。
この発明の方法において有用な別のモノクローナル抗体
の例には、2AI+という名称のハイブリッド連続セル
ラインにより発現される新規抗体がある。抗体2AII
はp24抗原、p39坑原およびp65抗原に結合する
。2AI+抗体はTgMである。2AI+抗体は正常な
リンパ球、H9まtこは06M細胞と高い強度では結合
しない。
の例には、2AI+という名称のハイブリッド連続セル
ラインにより発現される新規抗体がある。抗体2AII
はp24抗原、p39坑原およびp65抗原に結合する
。2AI+抗体はTgMである。2AI+抗体は正常な
リンパ球、H9まtこは06M細胞と高い強度では結合
しない。
この発明の方法において有用な別のモノクローナル抗体
の例には、12という名称のハイブリッド連続セルライ
ンにより発現される新規抗体がある。5DS−PAGE
およびウェスタンプロット技術により測定した結果、4
G2抗体はp24抗原およびp55抗原に結合すること
がわかった。
の例には、12という名称のハイブリッド連続セルライ
ンにより発現される新規抗体がある。5DS−PAGE
およびウェスタンプロット技術により測定した結果、4
G2抗体はp24抗原およびp55抗原に結合すること
がわかった。
4G2抗体は1gMアイソタイプに属する。4G2抗体
は正常なリンパ球、H9または06M細胞と高い強度で
は結合しない。
は正常なリンパ球、H9または06M細胞と高い強度で
は結合しない。
この発明の方法において有用な別のモノクローナル抗体
の例には、lE2という名称のハイブリッド連続セルラ
インにより発現される新規抗体がある。このモノクロー
ナル抗体はp55抗原およびp49抗原に結合する。I
E2抗体は1gMアイソタイプに属する。lE2抗体は
正常なリンパ球またはOEMEM細胞い強度では結合し
ない。
の例には、lE2という名称のハイブリッド連続セルラ
インにより発現される新規抗体がある。このモノクロー
ナル抗体はp55抗原およびp49抗原に結合する。I
E2抗体は1gMアイソタイプに属する。lE2抗体は
正常なリンパ球またはOEMEM細胞い強度では結合し
ない。
この発明の方法において有用な別のモノクローナル抗体
の例には、3GBという名称のハイブリッド連続セルラ
インにより発現される新規抗体がある。抗体3G8はp
24抗原、p39抗原およびp41抗原に結合する。3
GB抗体は1gMアイソタイプである。3G8抗体は正
常なリンパ球、H9細胞またはOEMEM細胞い強度で
は結合しない。
の例には、3GBという名称のハイブリッド連続セルラ
インにより発現される新規抗体がある。抗体3G8はp
24抗原、p39抗原およびp41抗原に結合する。3
GB抗体は1gMアイソタイプである。3G8抗体は正
常なリンパ球、H9細胞またはOEMEM細胞い強度で
は結合しない。
この発明の方法において有用な別のモノクローナル抗体
の例には、IcI lという名称のハイブリッド連続セ
ルラインにより発現される新規抗体がある。抗体ICI
Iはp55抗原およびp65抗原に結合する。IcI
l抗体はIgMである。セルラインICI +はセルラ
イン3D8を再クローニングすることにより得られた。
の例には、IcI lという名称のハイブリッド連続セ
ルラインにより発現される新規抗体がある。抗体ICI
Iはp55抗原およびp65抗原に結合する。IcI
l抗体はIgMである。セルラインICI +はセルラ
イン3D8を再クローニングすることにより得られた。
明らかに、セルライン3D8は2種のセルラインすなわ
ち3G8および+Ct tの混合物である。3D8由来
の各の細胞を単離および生長させると、2種のセルライ
ン、308およびIC11が得られる。308およびt
ct tのウェスタンプロットパターンを合わせたもの
を3DBのウェスタンプロットパターン上に重ね合わせ
ることができろ。
ち3G8および+Ct tの混合物である。3D8由来
の各の細胞を単離および生長させると、2種のセルライ
ン、308およびIC11が得られる。308およびt
ct tのウェスタンプロットパターンを合わせたもの
を3DBのウェスタンプロットパターン上に重ね合わせ
ることができろ。
モノクローナル抗体の有用な結合フラグメント、例えば
t ab、 F (ab’ )2、Fvなどらまたこの
発明の範囲およびモノクローナル抗体の定義に含まれろ
。抗体フラグメントは常用の技術により得られる。例え
ば、有用な結合フラグメントはパパインまたはペプシン
を用いた抗体のペブチグーゼ消化により製造され得る。
t ab、 F (ab’ )2、Fvなどらまたこの
発明の範囲およびモノクローナル抗体の定義に含まれろ
。抗体フラグメントは常用の技術により得られる。例え
ば、有用な結合フラグメントはパパインまたはペプシン
を用いた抗体のペブチグーゼ消化により製造され得る。
この発明の新規抗体の面記具体例はネズミ由来のIgG
および[gMに分類される抗体に属するが、これらに限
定するわけではない。ネズミ、ひと、ラットを含む他の
哺乳類またはこれら以外のものに由来する、前記抗体お
よび前記抗体との機能等偏性を有する抗体またはこれら
の組み合わせもこの発明の範囲内に含まれ、同様にIg
A、IgEなどの種類に属するアイソタイプおよびまた
IgGおよびIgMの種類に属する他のアイソタイプを
含む他の種類のもの、例えば前記1gA、IgEなども
含まれる。「機能等価性」の語は、抗体が前述の抗原に
結合することができ、そのような抗原との結合に関して
この発明の抗体と匹敵し得ることを意味する。すなわち
、そのような抗体を前記抗原を含有する試料と合わせた
場合、前記抗体は前記抗原と結合1−1この発明の抗体
が前記抗原と結合するのを阻む。哺乳類(例、ひと)モ
ノクローナル抗体は、オルマン等、「プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ゛
エンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オ
ブ・アメリカJ(P roe、 NaL、 Acad、
S ci。
および[gMに分類される抗体に属するが、これらに限
定するわけではない。ネズミ、ひと、ラットを含む他の
哺乳類またはこれら以外のものに由来する、前記抗体お
よび前記抗体との機能等偏性を有する抗体またはこれら
の組み合わせもこの発明の範囲内に含まれ、同様にIg
A、IgEなどの種類に属するアイソタイプおよびまた
IgGおよびIgMの種類に属する他のアイソタイプを
含む他の種類のもの、例えば前記1gA、IgEなども
含まれる。「機能等価性」の語は、抗体が前述の抗原に
結合することができ、そのような抗原との結合に関して
この発明の抗体と匹敵し得ることを意味する。すなわち
、そのような抗体を前記抗原を含有する試料と合わせた
場合、前記抗体は前記抗原と結合1−1この発明の抗体
が前記抗原と結合するのを阻む。哺乳類(例、ひと)モ
ノクローナル抗体は、オルマン等、「プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ゛
エンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オ
ブ・アメリカJ(P roe、 NaL、 Acad、
S ci。
US AXl 980)77巻5429−5431、エ
ンゲルマン等、「ヒユーマン・ハイブリドーマズ・アン
ド・モノクローナル・アンティボディーズJ(Huma
n Hybridomas and Monoclon
al Antibodies)、プレナム・プレス、ニ
ューヨーク、ニューヨーク(1985)記載の技術によ
り製造され得る。融合技術はネズミハイブリドーマの製
造に関して前述したものと同様である。次のセルライン
は、ハイブリッド連続セルラインの製造に使用され得る
ものの例である、N5−1(アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、A
TCC)、5P−2(ATCC)、!−I L −1(
ベントレックス、ボートランド、メイン)。
ンゲルマン等、「ヒユーマン・ハイブリドーマズ・アン
ド・モノクローナル・アンティボディーズJ(Huma
n Hybridomas and Monoclon
al Antibodies)、プレナム・プレス、ニ
ューヨーク、ニューヨーク(1985)記載の技術によ
り製造され得る。融合技術はネズミハイブリドーマの製
造に関して前述したものと同様である。次のセルライン
は、ハイブリッド連続セルラインの製造に使用され得る
ものの例である、N5−1(アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、A
TCC)、5P−2(ATCC)、!−I L −1(
ベントレックス、ボートランド、メイン)。
この発明による方法を実施するには、体液の試料を対象
から確保し、下記の方法で製造する。リンパ球を製造す
るために単核細胞を血液の残りから分離する。例えば、
抹消の血液をヘパリンにより抗凝固性にし、等量の燐酸
緩衝液で希釈し、密度勾配遠心分離に掛けることにより
、残りの血液から単核細胞(第一にリンパ球)を分離す
る。次いで細胞を緩衝液中で洗浄し、そして1xCあた
り5xto8個の細胞割合で少量(例、o、ot−t%
、好ましくは約0.1%)のゼラチンおよび少量(例、
0.01−1%、好ましくは約0.1%)のアジ化ナト
リウムを含む緩衝液に懸濁する。別法として、白血球細
胞の分離は全血液溶血法により行うことができる。
から確保し、下記の方法で製造する。リンパ球を製造す
るために単核細胞を血液の残りから分離する。例えば、
抹消の血液をヘパリンにより抗凝固性にし、等量の燐酸
緩衝液で希釈し、密度勾配遠心分離に掛けることにより
、残りの血液から単核細胞(第一にリンパ球)を分離す
る。次いで細胞を緩衝液中で洗浄し、そして1xCあた
り5xto8個の細胞割合で少量(例、o、ot−t%
、好ましくは約0.1%)のゼラチンおよび少量(例、
0.01−1%、好ましくは約0.1%)のアジ化ナト
リウムを含む緩衝液に懸濁する。別法として、白血球細
胞の分離は全血液溶血法により行うことができる。
血清を製造するためには、抹消の血液を広いガラス管に
引き入れ、凝固させ、次いで遠心分離することにより、
凝塊から血清を分離する。
引き入れ、凝固させ、次いで遠心分離することにより、
凝塊から血清を分離する。
試料の量は、使用する特定の測定方法および分析すべき
特定の体液により異なる。下記の試料の量は例として挙
げるものであって限定するわけではない。当技術分野に
精通しておれば、この明細書の記載に基づいてこの発明
の方法を広範に実施することができるはずである。血清
または血漿試料の場合、試料の量は一般に約0 、1
rsQ〜5 、 OmQ、好ましくはl 、 OrtQ
〜20肩Qの範囲である。精液試料の場合、量は一般に
約0.05+Q−1,0スQ1好ましくはOl〜05婬
である。
特定の体液により異なる。下記の試料の量は例として挙
げるものであって限定するわけではない。当技術分野に
精通しておれば、この明細書の記載に基づいてこの発明
の方法を広範に実施することができるはずである。血清
または血漿試料の場合、試料の量は一般に約0 、1
rsQ〜5 、 OmQ、好ましくはl 、 OrtQ
〜20肩Qの範囲である。精液試料の場合、量は一般に
約0.05+Q−1,0スQ1好ましくはOl〜05婬
である。
次ぎに試料における抗体および抗原の結合条件下、試料
を前述の抗体の1つまたはそれらの組み合わせと接触さ
せることにより、免疫すなわち抗原−抗体複合体を形成
させる。測定法の性質により、抗体を支持体と結合させ
たり水性媒質中に存在させることができる。抗体および
試料間の接触は一般に水性緩衝媒質中で行なわれる。用
いることができる緩衝液には、燐酸緩衝液、トリス緩衝
液重炭酸緩衝液などがある。使用されるpl(は、試料
および抗体の性質により異なり、一般に約5〜8の範囲
である。さらに水性媒質は約0〜40%の量で有機極性
溶媒を含有し得る。有機極性溶媒は水溶性であり、一般
に約1−10個の炭素原子および約1〜4個の酸素原子
を有する。また抗体濃度は測定法の性質および試験すべ
き試料の8虫により異なる。抗体の量は一般にLmQ当
たり0゜5μ9〜2μ7の範囲である。
を前述の抗体の1つまたはそれらの組み合わせと接触さ
せることにより、免疫すなわち抗原−抗体複合体を形成
させる。測定法の性質により、抗体を支持体と結合させ
たり水性媒質中に存在させることができる。抗体および
試料間の接触は一般に水性緩衝媒質中で行なわれる。用
いることができる緩衝液には、燐酸緩衝液、トリス緩衝
液重炭酸緩衝液などがある。使用されるpl(は、試料
および抗体の性質により異なり、一般に約5〜8の範囲
である。さらに水性媒質は約0〜40%の量で有機極性
溶媒を含有し得る。有機極性溶媒は水溶性であり、一般
に約1−10個の炭素原子および約1〜4個の酸素原子
を有する。また抗体濃度は測定法の性質および試験すべ
き試料の8虫により異なる。抗体の量は一般にLmQ当
たり0゜5μ9〜2μ7の範囲である。
測定法の性質により異なるが試料および抗体間の接触時
間経過後、合わせたものを処理することにより未反応の
抗体を除去することができる。これは、水性の通常は緩
衝媒質で洗浄することにより達成され得る。一般に、洗
浄溶液は未反応の抗体を除去するのに充分な量にするべ
きである。洗浄段階の回数および形式は、ヘテロジニア
ス測定アプローチを用いるかまたはホモジニアス測定ア
プローチを用いるかにより異なる。
間経過後、合わせたものを処理することにより未反応の
抗体を除去することができる。これは、水性の通常は緩
衝媒質で洗浄することにより達成され得る。一般に、洗
浄溶液は未反応の抗体を除去するのに充分な量にするべ
きである。洗浄段階の回数および形式は、ヘテロジニア
ス測定アプローチを用いるかまたはホモジニアス測定ア
プローチを用いるかにより異なる。
次ぎに、対象におけるエイズ関連ウィルス感染の存在の
指標である、試料中の抗体と抗原の結合の存在を観察す
る。すなわち、形成された抗原−抗体(免疫)1合体の
数を測定する。結合の存在を測定するために、試料中の
抗原の存在に応じて検出可能なシグナルを発生する手段
をアッセイ系に組み入れる。例えば、エイズ関連ウィル
ス感染の存在の有無に応じて検出可能なシグナルを発生
し得る物質である標識とアッセイに使用される抗体をコ
ンツユゲートすることができる。標識は、例えば酵素、
放射性同位元素、粒子、支持体、色素原、化学ルミネッ
サー、蛍光剤、補酵素、遊離基またはバクテリオファー
ジであり得る。抗体に関して用いられる標識の数は、一
般に本発明方法の必要条件および標識を抗体に結合する
部位の宵効性により決定される。標識を抗体に結合する
方法は当業界では公知である。例えば、米国特許第47
20450.4235869.3935074および3
996345号参照。
指標である、試料中の抗体と抗原の結合の存在を観察す
る。すなわち、形成された抗原−抗体(免疫)1合体の
数を測定する。結合の存在を測定するために、試料中の
抗原の存在に応じて検出可能なシグナルを発生する手段
をアッセイ系に組み入れる。例えば、エイズ関連ウィル
ス感染の存在の有無に応じて検出可能なシグナルを発生
し得る物質である標識とアッセイに使用される抗体をコ
ンツユゲートすることができる。標識は、例えば酵素、
放射性同位元素、粒子、支持体、色素原、化学ルミネッ
サー、蛍光剤、補酵素、遊離基またはバクテリオファー
ジであり得る。抗体に関して用いられる標識の数は、一
般に本発明方法の必要条件および標識を抗体に結合する
部位の宵効性により決定される。標識を抗体に結合する
方法は当業界では公知である。例えば、米国特許第47
20450.4235869.3935074および3
996345号参照。
別法として、抗体に特異的な標識された結合パートナ−
を用いることができ、これには例えば、使用された抗体
に特異的な標識抗体または前記抗体と結合する標識抗原
が有り得る。モノクローナル抗体がネズミに由来する場
合、この方法で使用される抗体に特異的な標識された抗
マウス免疫グロブリンが用いられ得る。そのような免疫
グロブリンは、適当な宿主にモノクローナル抗体を注射
し、適当な時間をおいて注射された宿主の血液から抗マ
ウス免疫グロブリンを採取することによる標準的技術に
したがって得ることができる。
を用いることができ、これには例えば、使用された抗体
に特異的な標識抗体または前記抗体と結合する標識抗原
が有り得る。モノクローナル抗体がネズミに由来する場
合、この方法で使用される抗体に特異的な標識された抗
マウス免疫グロブリンが用いられ得る。そのような免疫
グロブリンは、適当な宿主にモノクローナル抗体を注射
し、適当な時間をおいて注射された宿主の血液から抗マ
ウス免疫グロブリンを採取することによる標準的技術に
したがって得ることができる。
この発明の方法および抗体は、抗原抗体反応を含む殆ど
の測定法に適用され得る。測定法はホモジニアスまたは
へテロジニアスであり得る。ホモジニアス測定アプロー
チの場合、必要ならば試料を前処理することにより望ま
しくない物質を除去し得る。免疫反応は、一般に特異的
抗体、標識された分析質(アナライト)および興味の対
象である試料が関与する。標識されたアナライトと抗体
の結合に際して、標識から生じるシグナルは直接的また
は間接的に修飾される。それらの範囲の免疫反応および
検出は共にホモジニアス溶液中で行なわれる。用いられ
得る免疫化学的標識には、遊離基、蛍光染料、酵素、バ
クテリオファージ、補酵素などがある。ホモジニアス測
定法の例としては、米国特許第3817837号に記載
された酵素変調免疫測定技術(EMTT、商標)がある
。
の測定法に適用され得る。測定法はホモジニアスまたは
へテロジニアスであり得る。ホモジニアス測定アプロー
チの場合、必要ならば試料を前処理することにより望ま
しくない物質を除去し得る。免疫反応は、一般に特異的
抗体、標識された分析質(アナライト)および興味の対
象である試料が関与する。標識されたアナライトと抗体
の結合に際して、標識から生じるシグナルは直接的また
は間接的に修飾される。それらの範囲の免疫反応および
検出は共にホモジニアス溶液中で行なわれる。用いられ
得る免疫化学的標識には、遊離基、蛍光染料、酵素、バ
クテリオファージ、補酵素などがある。ホモジニアス測
定法の例としては、米国特許第3817837号に記載
された酵素変調免疫測定技術(EMTT、商標)がある
。
ヘテロジニアス測定アプローチの場合、試薬は通常試料
、抗体および検出可能なシグナルを発生する手段である
。試料を一般に支持体、例えばプレートまたはスライド
上に置き、水相中で抗体と接触させる。次いで、支持体
を液相から分離し、シグナル発生手段により支持体相ま
たは液相における検出可能なシグナルを調べる。ヘテロ
ジニアス測定法における検出可能なシグナル発生手段と
しては、放射性標識、蛍光剤、酵素などの使用がある。
、抗体および検出可能なシグナルを発生する手段である
。試料を一般に支持体、例えばプレートまたはスライド
上に置き、水相中で抗体と接触させる。次いで、支持体
を液相から分離し、シグナル発生手段により支持体相ま
たは液相における検出可能なシグナルを調べる。ヘテロ
ジニアス測定法における検出可能なシグナル発生手段と
しては、放射性標識、蛍光剤、酵素などの使用がある。
ヘテロノニアス免疫測定法の例としては、放射線免疫検
定法(RI A)、免疫蛍光法、酵素免疫測定法、例え
ばエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ(固相
酵素免疫測定法、ELISA1米国特許第365409
0.3839153.3850752.4016043
号および再発行特許第29169号参照)がある。
定法(RI A)、免疫蛍光法、酵素免疫測定法、例え
ばエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ(固相
酵素免疫測定法、ELISA1米国特許第365409
0.3839153.3850752.4016043
号および再発行特許第29169号参照)がある。
面性の免疫測定技術は、マツジオによる「エンザイムー
イムノアブセイj(Enzyms −1mmunoas
say)、シー・アール・シー・プレス社、ポカ・シー
トン、フロリダ(1980)に更に詳細に記載されてい
る。
イムノアブセイj(Enzyms −1mmunoas
say)、シー・アール・シー・プレス社、ポカ・シー
トン、フロリダ(1980)に更に詳細に記載されてい
る。
また例えば米国特許第3690834.3791932
.3817837.3850578.3853987.
3867517.3901654.3935074.3
98 =4533.39963.15および40988
76号参照(ただし、これで残らず列挙したわけではな
い)。
.3817837.3850578.3853987.
3867517.3901654.3935074.3
98 =4533.39963.15および40988
76号参照(ただし、これで残らず列挙したわけではな
い)。
この発明による測定法の実施態様は、例として挙げたも
のであって限定を目的とした訳ではないが、例えばスラ
イドまたはペトリ皿のウェルのような支持体の使用が関
与する。この技術は、適当な固定材料例えばアセトンに
より分析試料を支持体上に固定し、この発明のモノクロ
ーナル抗体とスライド上の試料をインキュベートするこ
とを含む。適当な緩衝液、例えば燐酸緩衝食塩水で洗浄
後、支持体をモノクローナル抗体の標識された特異的結
合パートナ−と接触させる。所望に応じてインキュベー
ション後、スライドを水性緩衝液で再び洗浄し、モノク
ローナル抗体と試料の結合を測定する。標識が蛍光性で
ある場合、スライドをカバーグラス上の蛍光性抗体固定
液で覆い、次いで蛍光顕微鏡で4査することにより結合
程度を測定することができる。他方、標識は、この発明
のモノクローナル抗体とコンジュゲートした酵素であり
得、酵素活性の存在を調べることにより結合程度を測定
することができ、沈澱形成、着色などかられかる。
のであって限定を目的とした訳ではないが、例えばスラ
イドまたはペトリ皿のウェルのような支持体の使用が関
与する。この技術は、適当な固定材料例えばアセトンに
より分析試料を支持体上に固定し、この発明のモノクロ
ーナル抗体とスライド上の試料をインキュベートするこ
とを含む。適当な緩衝液、例えば燐酸緩衝食塩水で洗浄
後、支持体をモノクローナル抗体の標識された特異的結
合パートナ−と接触させる。所望に応じてインキュベー
ション後、スライドを水性緩衝液で再び洗浄し、モノク
ローナル抗体と試料の結合を測定する。標識が蛍光性で
ある場合、スライドをカバーグラス上の蛍光性抗体固定
液で覆い、次いで蛍光顕微鏡で4査することにより結合
程度を測定することができる。他方、標識は、この発明
のモノクローナル抗体とコンジュゲートした酵素であり
得、酵素活性の存在を調べることにより結合程度を測定
することができ、沈澱形成、着色などかられかる。
この発明の別の実施態様は、この発明によるモノクロー
ナル抗体が付着する表面の使用を含む。
ナル抗体が付着する表面の使用を含む。
表面の基礎構造は、様々な形態をとり得、様々な組成を
有し、組成物またはラミネートの混合物またはそれらの
組み合わせであり得る。表面は、多様な形状を呈し得、
使用法および測定法に従い様々な寸法を有し得る。表面
の例としては、パッド、ビーズ、ディスクまたは平面状
、凹状もしくは凸状のストリップがあり得る。厚さは厳
密なものではないが、一般に約0.1〜2zmの厚さで
あり、好都合な直径または他の寸法を有する。表面は一
般的にロッド、チューブ、毛管、ファイバー、ストリッ
プ、ディスク、プレート、キュベツトなどの上に支えら
れる。表面は、一般的に多孔質および多官能性であるか
、または多官能化されることによりこの発明のモノクロ
ーナル抗体の共有結合を可能にし、また検出可能なシグ
ナルの発生手段の一部を形成する他の化合物の結合を可
能にすることができるものである。
有し、組成物またはラミネートの混合物またはそれらの
組み合わせであり得る。表面は、多様な形状を呈し得、
使用法および測定法に従い様々な寸法を有し得る。表面
の例としては、パッド、ビーズ、ディスクまたは平面状
、凹状もしくは凸状のストリップがあり得る。厚さは厳
密なものではないが、一般に約0.1〜2zmの厚さで
あり、好都合な直径または他の寸法を有する。表面は一
般的にロッド、チューブ、毛管、ファイバー、ストリッ
プ、ディスク、プレート、キュベツトなどの上に支えら
れる。表面は、一般的に多孔質および多官能性であるか
、または多官能化されることによりこの発明のモノクロ
ーナル抗体の共有結合を可能にし、また検出可能なシグ
ナルの発生手段の一部を形成する他の化合物の結合を可
能にすることができるものである。
広範な種類の天然および合成の両方を含む有機および無
機ポリマー並びにそれらの組み合わせが、固体表面材料
として使用され得る。ポリマーの例には、ポリエチレン
、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリス
チレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタ
レート)、レーヨン、ナイロン、ポリ(ビニルブチレー
ト)、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース
、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ラテックスなど
がある。使用され得る他の材料には、紙、ガラス類、セ
ラミック、金属、メタロイド、半導体材料、サーメット
、シリケートなどがある。またゲル、ゼラチン、リボ多
糖類、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミ
ド類を形成する基質または例えばデキストラン、ポリア
ルキレングリコール類(炭素原子2〜3個を何するアル
キレン)のような幾つかの水相を形成するポリマー類ま
たは界面活性剤例えばリン脂質も含まれる。
機ポリマー並びにそれらの組み合わせが、固体表面材料
として使用され得る。ポリマーの例には、ポリエチレン
、ポリプロピレン、ポリ(4−メチルブテン)、ポリス
チレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタ
レート)、レーヨン、ナイロン、ポリ(ビニルブチレー
ト)、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース
、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ラテックスなど
がある。使用され得る他の材料には、紙、ガラス類、セ
ラミック、金属、メタロイド、半導体材料、サーメット
、シリケートなどがある。またゲル、ゼラチン、リボ多
糖類、シリケート、アガロースおよびポリアクリルアミ
ド類を形成する基質または例えばデキストラン、ポリア
ルキレングリコール類(炭素原子2〜3個を何するアル
キレン)のような幾つかの水相を形成するポリマー類ま
たは界面活性剤例えばリン脂質も含まれる。
この発明によるモノクローナル抗体と表面の結合は、文
献に記載された公知技術により達成され得る。例えば、
チバタによる「インモビライズド・エンザイムズJ(I
a+a+obilized Enzymes)、ハルス
タッド・プレス、ニューヨーク(1978)およびクア
トレカサスによる「ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリーJ(J、Bio、Chet )245巻
3059(’1970)参照。
献に記載された公知技術により達成され得る。例えば、
チバタによる「インモビライズド・エンザイムズJ(I
a+a+obilized Enzymes)、ハルス
タッド・プレス、ニューヨーク(1978)およびクア
トレカサスによる「ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリーJ(J、Bio、Chet )245巻
3059(’1970)参照。
この発明の実施態様に従って測定を実施する場合、試料
を水性媒質と混合し、媒質をこの発明によるモノクロー
ナル抗体を含有する表面と接触させる。またシグナル発
生系の成分および補助物質があればこれらも水性媒質に
含まれ得、同時または後で加えられることにより表面と
結合した検出可能なシグナルを提供する。検出可能なシ
グナルの発生手段には、標識アナライトの媒質への混入
または標識とコンジュゲートされた2番目のモノクロー
ナル抗体の使用が挙げられる。分離および洗浄段階は必
要に応じて実施される。検出されたシグナルは、エイズ
関連ウィルス感染の存在に対応する。前記支持体上の表
面に関する検量および測定もこの発明の範囲内に含まれ
る。
を水性媒質と混合し、媒質をこの発明によるモノクロー
ナル抗体を含有する表面と接触させる。またシグナル発
生系の成分および補助物質があればこれらも水性媒質に
含まれ得、同時または後で加えられることにより表面と
結合した検出可能なシグナルを提供する。検出可能なシ
グナルの発生手段には、標識アナライトの媒質への混入
または標識とコンジュゲートされた2番目のモノクロー
ナル抗体の使用が挙げられる。分離および洗浄段階は必
要に応じて実施される。検出されたシグナルは、エイズ
関連ウィルス感染の存在に対応する。前記支持体上の表
面に関する検量および測定もこの発明の範囲内に含まれ
る。
表面測定実施に関して前述した様々な一般的技術をさら
に広範に説明したものとしては、米国特許第42999
16.4391904.4533629および4540
659号がある。
に広範に説明したものとしては、米国特許第42999
16.4391904.4533629および4540
659号がある。
この発明の方法および新規抗体による技術の別の例とし
ては、非ブローサイトメトリー技術がある。分析試料お
よび標識にコンジュゲートされた本発明のモノクローナ
ル抗体を合わせ、エイズ関連ウィルス抗原が試料中に存
在する場合に凝集を起こす条件下でインキュベートする
。望ましいインキュベーション時間は、通常的lθ〜3
7℃の中温で約10〜600秒、好ましくは約10〜2
00秒である。インキュベーション後、媒質を検査して
凝集の結果化じた蛍光変化の有無を測定する。このため
に、スリット手段により発せられた小直径の光線または
好ましくはレーザーを用いて相対的サイズに基づき粒子
を識別する非フローサイトメトリー技術が用いられ得る
。この技術は蛍光パルス高度分析または蛍光揺動の相関
関係を用いる。ブリッグス等、「ホモジニアス・フルオ
レッセンス・イムノアッセイ」、「サイエンスj(Sc
ience)212巻、1266〜+267(198+
)およびニコリ等、rフルオレッセンス・イムノアッセ
イ・ペースト・オン・ロングタイム・コレレーンヨンズ
・オン・ナンバー・フラクチュエーションズ」、[プロ
シーディングズ・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
才ブ・サイエンノーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステ
ーブ・オン・アメリカJ(PrQC,Natl、^ca
d、 Sci、 USA)、7@(8)4904〜49
08(+980)。
ては、非ブローサイトメトリー技術がある。分析試料お
よび標識にコンジュゲートされた本発明のモノクローナ
ル抗体を合わせ、エイズ関連ウィルス抗原が試料中に存
在する場合に凝集を起こす条件下でインキュベートする
。望ましいインキュベーション時間は、通常的lθ〜3
7℃の中温で約10〜600秒、好ましくは約10〜2
00秒である。インキュベーション後、媒質を検査して
凝集の結果化じた蛍光変化の有無を測定する。このため
に、スリット手段により発せられた小直径の光線または
好ましくはレーザーを用いて相対的サイズに基づき粒子
を識別する非フローサイトメトリー技術が用いられ得る
。この技術は蛍光パルス高度分析または蛍光揺動の相関
関係を用いる。ブリッグス等、「ホモジニアス・フルオ
レッセンス・イムノアッセイ」、「サイエンスj(Sc
ience)212巻、1266〜+267(198+
)およびニコリ等、rフルオレッセンス・イムノアッセ
イ・ペースト・オン・ロングタイム・コレレーンヨンズ
・オン・ナンバー・フラクチュエーションズ」、[プロ
シーディングズ・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
才ブ・サイエンノーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステ
ーブ・オン・アメリカJ(PrQC,Natl、^ca
d、 Sci、 USA)、7@(8)4904〜49
08(+980)。
非フローサイトメトリー技術において蛍光の変化を測定
する好ましい方法では、米国特許第4564598号に
記載されたファイバーオプティックサイトメーターを使
用する。興味の対象である物質の存在の有無または量の
検出に関して分散液中の粒子の存在を測定するための方
法および装置が開示されている。光ファイバーを用いて
、蛍光を受容およびカウントし得る程度の比較的小容量
を画定する。この容量は、粒子1個だけまたは予定の揺
動(フラクチュエーション)をもたらす数個の粒子が存
在しやすい容量と対応する。試料中のアナライトの存在
に応じて蛍光揺動を変化させる様々な技術を用いること
により、アナライトの存在の有無を測定することができ
る。この揺動を、静止モードまたは複数の容量の試料を
取ることにより一定の期間にわたって観察する。次いで
、既知の量のアナライトを含有する溶液で得られた観察
結果と比較することにより測定を行う。
する好ましい方法では、米国特許第4564598号に
記載されたファイバーオプティックサイトメーターを使
用する。興味の対象である物質の存在の有無または量の
検出に関して分散液中の粒子の存在を測定するための方
法および装置が開示されている。光ファイバーを用いて
、蛍光を受容およびカウントし得る程度の比較的小容量
を画定する。この容量は、粒子1個だけまたは予定の揺
動(フラクチュエーション)をもたらす数個の粒子が存
在しやすい容量と対応する。試料中のアナライトの存在
に応じて蛍光揺動を変化させる様々な技術を用いること
により、アナライトの存在の有無を測定することができ
る。この揺動を、静止モードまたは複数の容量の試料を
取ることにより一定の期間にわたって観察する。次いで
、既知の量のアナライトを含有する溶液で得られた観察
結果と比較することにより測定を行う。
この発明の別の実施態様では、リンパ球上のHTLV−
IIII発現を検出する「全細胞ELISAJ試験にお
いて本発明のモノクローナル抗体を用いる。
IIII発現を検出する「全細胞ELISAJ試験にお
いて本発明のモノクローナル抗体を用いる。
すなわち、分光光度計測定法において、例えば密度勾配
遠心分離により抹消唾液のリンパ球を単離し、水性蛋白
質含有培地(例えば、うし胎児血清、グルタミンおよび
r(PM[/640を含有する水性培地)に懸澗する。
遠心分離により抹消唾液のリンパ球を単離し、水性蛋白
質含有培地(例えば、うし胎児血清、グルタミンおよび
r(PM[/640を含有する水性培地)に懸澗する。
少量1例えば50μQの細胞懸濁液試料を96ウエルマ
イクロタイタープレートのウェルに加え、例えば約1分
〜5時間インキュベートし得る。細胞波頂ウェルを洗浄
後、本発明の成体試料を各ウェルに加え、1分〜3時間
インキュベートする。洗浄後、色素原基質、例えば才
。
イクロタイタープレートのウェルに加え、例えば約1分
〜5時間インキュベートし得る。細胞波頂ウェルを洗浄
後、本発明の成体試料を各ウェルに加え、1分〜3時間
インキュベートする。洗浄後、色素原基質、例えば才
。
ルトフエニレンジアミンおよび過酸化水素を各ウェルに
加え、1分〜1時間インキュベートする。分光光度計に
より結果を読み取ることができる。顕微鏡観察を行う場
合、リンパ球の緩衝懸濁液を0℃〜37℃の温度で1分
〜3時間抗体とインキュベートする。細胞を洗浄し、次
いでO℃〜37℃で1分〜3時間前記抗体の酵素標識抗
体と混合する。洗浄後、酵素基質を加え、シグナルの存
在について細胞を検査する。
加え、1分〜1時間インキュベートする。分光光度計に
より結果を読み取ることができる。顕微鏡観察を行う場
合、リンパ球の緩衝懸濁液を0℃〜37℃の温度で1分
〜3時間抗体とインキュベートする。細胞を洗浄し、次
いでO℃〜37℃で1分〜3時間前記抗体の酵素標識抗
体と混合する。洗浄後、酵素基質を加え、シグナルの存
在について細胞を検査する。
この発明による別の実、m態様では、ドツト・プロット
技術を用いてエイズ関連ウィルス感染と関連のある抗原
の存在を検出する。そのようなアプローチの場合、正常
血清の試料に並べて少量、例えばlμQの患者血清試料
をニトロセルロースストリップ上に置く。本発明のモノ
クローナル抗体を含有する水性緩衝媒質、例えば燐酸緩
衝食塩水およびゼラチンに前記ストリップを約1〜60
分間浸し、次いでモノクローナル抗体の標識抗体を加え
る。
技術を用いてエイズ関連ウィルス感染と関連のある抗原
の存在を検出する。そのようなアプローチの場合、正常
血清の試料に並べて少量、例えばlμQの患者血清試料
をニトロセルロースストリップ上に置く。本発明のモノ
クローナル抗体を含有する水性緩衝媒質、例えば燐酸緩
衝食塩水およびゼラチンに前記ストリップを約1〜60
分間浸し、次いでモノクローナル抗体の標識抗体を加え
る。
、この発明による別の実施態様では、リンパ球上のHT
LV−IIIウィルスに関するフローサイトメトリーベ
ースの検出系を使用する。フローサイトメトリーは蛍光
活性化細胞ソーター(FACS)分析を意味する。フロ
ーサイトメトリーの操作原理は詳細に検討されている。
LV−IIIウィルスに関するフローサイトメトリーベ
ースの検出系を使用する。フローサイトメトリーは蛍光
活性化細胞ソーター(FACS)分析を意味する。フロ
ーサイトメトリーの操作原理は詳細に検討されている。
例えばボナー等、[レビュー・オン・サイエンティフィ
ック・インスッルメンツJ(Rev、 5cient、
IIIstrum、Xl 972)43巻404−4
09、ヘルツエンベルブ等、「プロシーディングズ・オ
ン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシー
ズ・オプ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オン・アメリ
カJ(Proc、 Natn、 Acad、 Sci、
U、S、A、Xl 979)76巻1453−145
5、ミラー等、「ジャーナル・才プ・イムノロジカル・
メソッズJ(J、 Immunol、 Methods
)、(1981)47巻+ 3−24、ローケン等、同
書(1982)50巻R85−Rl12、およびクルス
、「アナリティカル・バイオケミストリーJ(Anal
、 Biochem、X l 982 ) 125巻2
25−242参照。蛍光抗体で標識された試料の単一細
胞懸濁液を一列で細いレーザー光線に通す。
ック・インスッルメンツJ(Rev、 5cient、
IIIstrum、Xl 972)43巻404−4
09、ヘルツエンベルブ等、「プロシーディングズ・オ
ン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシー
ズ・オプ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オン・アメリ
カJ(Proc、 Natn、 Acad、 Sci、
U、S、A、Xl 979)76巻1453−145
5、ミラー等、「ジャーナル・才プ・イムノロジカル・
メソッズJ(J、 Immunol、 Methods
)、(1981)47巻+ 3−24、ローケン等、同
書(1982)50巻R85−Rl12、およびクルス
、「アナリティカル・バイオケミストリーJ(Anal
、 Biochem、X l 982 ) 125巻2
25−242参照。蛍光抗体で標識された試料の単一細
胞懸濁液を一列で細いレーザー光線に通す。
発生した蛍光を光学系により光と直角に集める。
各細胞から発生した蛍光を測定して蓄積し、その蓄積さ
れたデータから問題の抗原の存在の有無を測定する。
れたデータから問題の抗原の存在の有無を測定する。
この発明による別の実施態様では、臨床試料の短期間ウ
ィルス培養によるエイズ関連ウィルス感染の検出を行う
。試料をH9またはCEM細胞と培養し、次いでフロー
サイトメトリー、スライド試験などの原理を用いて検出
する。「H9」は、T細胞リンパ腫セルラインを意味す
る。rCEMlは、T細胞リンパ腫セルラインを意味す
る。「短期間」は、20〜30日を必要とする本方法に
対して2〜48時間、好ましくは10〜24時間を意味
する。
ィルス培養によるエイズ関連ウィルス感染の検出を行う
。試料をH9またはCEM細胞と培養し、次いでフロー
サイトメトリー、スライド試験などの原理を用いて検出
する。「H9」は、T細胞リンパ腫セルラインを意味す
る。rCEMlは、T細胞リンパ腫セルラインを意味す
る。「短期間」は、20〜30日を必要とする本方法に
対して2〜48時間、好ましくは10〜24時間を意味
する。
血清におけるエイズ関連ウィルス抗原に対する抗体検出
のスクリーニングテストと組み合わせたこの方法および
新規モノクローナル抗体の使用もまたこの発明の範囲内
に含まれる。例えば、患者の試料は公知の抗体検出方法
を用いてスクリーンされ得る。従って、そのような抗体
の存在に関して陽性と認められた患者を確認することが
できる。
のスクリーニングテストと組み合わせたこの方法および
新規モノクローナル抗体の使用もまたこの発明の範囲内
に含まれる。例えば、患者の試料は公知の抗体検出方法
を用いてスクリーンされ得る。従って、そのような抗体
の存在に関して陽性と認められた患者を確認することが
できる。
次いでそのような患者から採取した試料をこの発明にし
たがって分析することにより、その患者にエイズ関連ウ
ィルス感染が存在するかどうかを診断することができる
。
たがって分析することにより、その患者にエイズ関連ウ
ィルス感染が存在するかどうかを診断することができる
。
この発明はまた重連の方法を実施するための診断用キッ
トを含む。そのキットの場合、試薬を同じかまたは別の
容器に組み合わせてパッケージした状態で入れることに
より、アナライトil[の変化に対するノブナル応答を
実質的に最適化し得る試薬の割合をもたらすことができ
る。−具体例において、診断用キットは、(a)既に詳
しく記載したモノクローナル抗体またはそのような抗体
の組み合わせ、および(b)前記モノクローナル抗体に
特異的な結合パートナ−と検出可能なシグナルを発生し
得る標識とのコンジュゲートを含み得る。
トを含む。そのキットの場合、試薬を同じかまたは別の
容器に組み合わせてパッケージした状態で入れることに
より、アナライトil[の変化に対するノブナル応答を
実質的に最適化し得る試薬の割合をもたらすことができ
る。−具体例において、診断用キットは、(a)既に詳
しく記載したモノクローナル抗体またはそのような抗体
の組み合わせ、および(b)前記モノクローナル抗体に
特異的な結合パートナ−と検出可能なシグナルを発生し
得る標識とのコンジュゲートを含み得る。
また試薬は補助薬剤、例えば緩衝剤および蛋白質安定剤
、多糖類などを含み得る。さらに診断用キットは必要な
らば、標識がその一成分であるングナル発生系の他の成
分、試験においてバックグラウンド妨害を低減する薬剤
、制御試薬、試験を行うための装置などを含み得る。
、多糖類などを含み得る。さらに診断用キットは必要な
らば、標識がその一成分であるングナル発生系の他の成
分、試験においてバックグラウンド妨害を低減する薬剤
、制御試薬、試験を行うための装置などを含み得る。
別の具体例の場合、診断用キットは本発明のモノクロー
ナル抗体および検出可能なシグナルを発生し得る標識の
コン・シュゲートを含み得る。前記の補助薬剤もまた存
在し得る。
ナル抗体および検出可能なシグナルを発生し得る標識の
コン・シュゲートを含み得る。前記の補助薬剤もまた存
在し得る。
以下、実施例によりこの発明を更に詳しく説明する。
実施例I
HTLV−III抗原に対するモノクローナル抗体の産
生。
生。
3月令の雌のB A L B / cおよびRBF/D
NマウスをHT L V −III抗原製剤により免疫
化した。
NマウスをHT L V −III抗原製剤により免疫
化した。
抗原製剤は、国立癌研究所(NCI)から入手された、
H9セルライン、すなわちひとリンパ腫中でのHT L
V −[[増殖由来の部分的に精製したウイルスリゼ
イトであった。各々のマウスをポリスチレンラテックス
粒子上の5〜20μ9の抗原で免疫化し、溶性抗原lO
μりの静脈投与(1,V、)および腹膜内投与(1,P
、)を行うことにより1週間間隔で増強した。1週間間
隔でマウスから血清を採取し、ウェスタンプロット分析
にかけてHTLV−[+ウィルス抗原に対する抗体の検
出を行った。
H9セルライン、すなわちひとリンパ腫中でのHT L
V −[[増殖由来の部分的に精製したウイルスリゼ
イトであった。各々のマウスをポリスチレンラテックス
粒子上の5〜20μ9の抗原で免疫化し、溶性抗原lO
μりの静脈投与(1,V、)および腹膜内投与(1,P
、)を行うことにより1週間間隔で増強した。1週間間
隔でマウスから血清を採取し、ウェスタンプロット分析
にかけてHTLV−[+ウィルス抗原に対する抗体の検
出を行った。
ウェスタンプロット分析は、5週間の免疫期間にわたっ
てHTLV−III抗原に対する抗体の著しい産生を示
した。免疫化の3.4および5週間後HTLV−[ウィ
ルス抗原に対して反応を示すマウスを選択して融合に用
いた。公表された方法を用いて(HL−1の場合、タラ
ガート等、「サイエンスJ(ScienceX 198
3 ) 219巻1228.5P−2の場合、シュルマ
ン等、「ネイチャーJ(NatureXI 978)2
76巻269)、ひ臓細胞を5P−2またはHL−1ミ
エローマセルラインと融合した。スクリーニング方法を
選択して1〜lOμ9/スaの範囲で抗体を検出した。
てHTLV−III抗原に対する抗体の著しい産生を示
した。免疫化の3.4および5週間後HTLV−[ウィ
ルス抗原に対して反応を示すマウスを選択して融合に用
いた。公表された方法を用いて(HL−1の場合、タラ
ガート等、「サイエンスJ(ScienceX 198
3 ) 219巻1228.5P−2の場合、シュルマ
ン等、「ネイチャーJ(NatureXI 978)2
76巻269)、ひ臓細胞を5P−2またはHL−1ミ
エローマセルラインと融合した。スクリーニング方法を
選択して1〜lOμ9/スaの範囲で抗体を検出した。
最初のスクリーンとしてELISA法により免疫グロブ
リン産生を検出し、次いでHTLV−[抗原に対してE
LrSAスクリーンを行った(第1表)が、これはモノ
クローナル抗体が)(TLV−III抗原に対して特異
的であることを示している。陽性のウェルを展開し、ウ
ェスタンプロット分析により試験した。
リン産生を検出し、次いでHTLV−[抗原に対してE
LrSAスクリーンを行った(第1表)が、これはモノ
クローナル抗体が)(TLV−III抗原に対して特異
的であることを示している。陽性のウェルを展開し、ウ
ェスタンプロット分析により試験した。
ウェスタンプロット分析による陽性培養をクローンし、
特性を付与した。こうしてハイブリッド連続セルライン
3D8.3F7.3G12.2A11.4G2およびI
F5を製造した。
特性を付与した。こうしてハイブリッド連続セルライン
3D8.3F7.3G12.2A11.4G2およびI
F5を製造した。
上記セルラインにより発現された幾つかのモノクローナ
ル抗体は、多重の帯を検出する。このことは、種々の蛋
白質上に共有されたエピトープの発現、様々な分子サイ
ズを有する前駆体分子の検出または異種の蛋白質に共通
した炭水化物決定基の検出を示し得る。モノクローナル
抗体と反応させる前に過よう素酸ナトリウムによりウェ
スタンプロットストリップを処理しても、染色パターン
はあまり変化しなかった。この観察により、炭水化物エ
ピトープがモノクローナル抗体により検出されるという
見込みは低減する。抗HTLV−[モノクローナル抗体
の中で正常なリンパ球またはマストリンパ球セルライン
と反応するものはない。
ル抗体は、多重の帯を検出する。このことは、種々の蛋
白質上に共有されたエピトープの発現、様々な分子サイ
ズを有する前駆体分子の検出または異種の蛋白質に共通
した炭水化物決定基の検出を示し得る。モノクローナル
抗体と反応させる前に過よう素酸ナトリウムによりウェ
スタンプロットストリップを処理しても、染色パターン
はあまり変化しなかった。この観察により、炭水化物エ
ピトープがモノクローナル抗体により検出されるという
見込みは低減する。抗HTLV−[モノクローナル抗体
の中で正常なリンパ球またはマストリンパ球セルライン
と反応するものはない。
しかしながら、そのうちの3種(1E2、3F7および
3G!2)はH9細胞と反応する。このことは、HTL
V−111抗原製剤がある程度H9抗原を含有し、H9
蛋白質に対するモノクローナル抗体が産生され1ここと
を示唆する。
3G!2)はH9細胞と反応する。このことは、HTL
V−111抗原製剤がある程度H9抗原を含有し、H9
蛋白質に対するモノクローナル抗体が産生され1ここと
を示唆する。
実施例2
フローサイトメトリーによるHTLV−III抗原の検
出。
出。
リンパ球上のHTLV−[[抗原発現の検出における本
発明の幾つかのモノクローナル抗体の有用性を評価する
ために、ラテックスビーズ(2,7μ)をHTLV−I
II抗原リゼイトで被覆し、フローサイトメトリーによ
る抗原検出を行った。やぎ抗マウスIg−蛍光性第2抗
体試薬〔タボ(TAGO)、バーリンゲーム、カリフォ
ルニア〕を用いた場合、幾つかの抗体は蛍光強度の変動
によって示したように、HTLV−III抗原を検出し
た(第2表)。この実験から、フローサイトメトリーに
より本発明のモノクローナル抗体を用いて大きな粒子上
でHTLV−III抗原が検出され得ることが証明され
た。
発明の幾つかのモノクローナル抗体の有用性を評価する
ために、ラテックスビーズ(2,7μ)をHTLV−I
II抗原リゼイトで被覆し、フローサイトメトリーによ
る抗原検出を行った。やぎ抗マウスIg−蛍光性第2抗
体試薬〔タボ(TAGO)、バーリンゲーム、カリフォ
ルニア〕を用いた場合、幾つかの抗体は蛍光強度の変動
によって示したように、HTLV−III抗原を検出し
た(第2表)。この実験から、フローサイトメトリーに
より本発明のモノクローナル抗体を用いて大きな粒子上
でHTLV−III抗原が検出され得ることが証明され
た。
実施例3
別の実験では、HTLV−III抗原は上記モノクロー
ナル抗体の1つを用いてラテックスビーズ上に捕獲され
た。このアプローチの場合IE2または3D8をラテッ
クスビーズに吸着させてからビーズを洗浄した。次いで
、洗浄されたビーズをト(TLV−IIIウイルスリゼ
イトに暴露し、再び洗浄し、次に検出抗体と混合した。
ナル抗体の1つを用いてラテックスビーズ上に捕獲され
た。このアプローチの場合IE2または3D8をラテッ
クスビーズに吸着させてからビーズを洗浄した。次いで
、洗浄されたビーズをト(TLV−IIIウイルスリゼ
イトに暴露し、再び洗浄し、次に検出抗体と混合した。
検出には、3G12を使用した(XgG+アイソタイプ
)。洗浄後、蛍光性やぎ抗マウスIgG、ガンマ鎖特異
性第2抗体と反応させ、生成した試料をフローサイトメ
トリーにより評価した。第3表かられかるように、これ
ら2種のモノクローナル抗体を用いたこの捕獲および検
出方法はHTLV−III抗体を確認する有効な手段で
ある。またモノクローナル抗体は、3G12を用いて抗
原を捕獲し、3D8を用いて捕獲された決定基を同定す
る遵法でも用いることができた。
)。洗浄後、蛍光性やぎ抗マウスIgG、ガンマ鎖特異
性第2抗体と反応させ、生成した試料をフローサイトメ
トリーにより評価した。第3表かられかるように、これ
ら2種のモノクローナル抗体を用いたこの捕獲および検
出方法はHTLV−III抗体を確認する有効な手段で
ある。またモノクローナル抗体は、3G12を用いて抗
原を捕獲し、3D8を用いて捕獲された決定基を同定す
る遵法でも用いることができた。
実施例4
エイズ患者の血液におけるHTLV−III抗原の検出
。
。
次に実施例3に記載した二重抗体捕獲技術を用いて、エ
イズ患者および対照患者から採取した血液試料からHT
L V −III抗原を捕獲した。20個の陽性と確
認されたHTLV−III抗体試料による比較試験では
、11個の試料にウィルスが検出された。これらの試料
はウェスタンプロット分析により陽性を示したが、直接
ウィルス培養による確認は行わなかった。
イズ患者および対照患者から採取した血液試料からHT
L V −III抗原を捕獲した。20個の陽性と確
認されたHTLV−III抗体試料による比較試験では
、11個の試料にウィルスが検出された。これらの試料
はウェスタンプロット分析により陽性を示したが、直接
ウィルス培養による確認は行わなかった。
さらに別の実験では、ニトロセルロース上に試料をプロ
ットし、修正ELISA技術で抗原を検出することによ
りHTLV−III抗原が臨床試料から直接的に検出さ
れた。そのようなアプローチの場合、lμeの正常血清
と並べてIIQの患者血清をニトロセルロースのストリ
ップ上に置く。次いでストリップを10分間PBS−ゼ
ラチンに浸し、さらにPBS−ゼラチン中にアルカリホ
スファターゼコンジュゲートやぎ抗マウス抗体を室温で
1時間浸す。3回洗浄後、ブロモクロロインドールホス
フェート(BCIP)/ニトロブルーテトラゾリウム(
NBT)から成る基質をストリップに適用する。ウィル
ス抗原陽性血清ドツトは、10分以内に紫色のドツトを
発生する。正常血清は色の変化を全く示さない。第4表
のデータはこれらの試験結果を示す。クローン3D8お
よび3G8は、エイズ患者および国立癌研究所(NCI
)より人手されたエイズ陽性対照血清から採取された大
部分の試料においてHTLV−III抗原を検出した。
ットし、修正ELISA技術で抗原を検出することによ
りHTLV−III抗原が臨床試料から直接的に検出さ
れた。そのようなアプローチの場合、lμeの正常血清
と並べてIIQの患者血清をニトロセルロースのストリ
ップ上に置く。次いでストリップを10分間PBS−ゼ
ラチンに浸し、さらにPBS−ゼラチン中にアルカリホ
スファターゼコンジュゲートやぎ抗マウス抗体を室温で
1時間浸す。3回洗浄後、ブロモクロロインドールホス
フェート(BCIP)/ニトロブルーテトラゾリウム(
NBT)から成る基質をストリップに適用する。ウィル
ス抗原陽性血清ドツトは、10分以内に紫色のドツトを
発生する。正常血清は色の変化を全く示さない。第4表
のデータはこれらの試験結果を示す。クローン3D8お
よび3G8は、エイズ患者および国立癌研究所(NCI
)より人手されたエイズ陽性対照血清から採取された大
部分の試料においてHTLV−III抗原を検出した。
ウィルス培養との直接比較は実施しなかった。
実施例5
全細胞技術を用いたHTLV−[[[の検出修正全細胞
ELISA技術を用いて、ウェスタンプロット分析によ
り陽性であると確認された患者のリンパ球上にHTLV
−IIII抗原発現が検出された。この試験では細胞を
顕微鏡により検出した。
ELISA技術を用いて、ウェスタンプロット分析によ
り陽性であると確認された患者のリンパ球上にHTLV
−IIII抗原発現が検出された。この試験では細胞を
顕微鏡により検出した。
また分光光度計により検出することもできる。分光光度
計による方法の場合、抹消血液のリンパ球を密度勾配遠
心分離により単離し、IzC当たり2×106個の細胞
濃度で2ミリモルのし一グルタミンおよび20%うし胎
児血清を含むRPMII640(標準的組織培養培地)
に@澗した。この細胞懸濁液50μジを96ウエルマイ
クロタイタープレートの平底ウェルに加え、約3時間イ
ンキュベートした。細胞被覆ウェルを洗浄後、抗HTL
V−[モノクローナル抗体3D8をウェルに加え、1時
間インキュベートした。洗浄後、くえん酸緩i; +
+I、L −7−−l、’/ ブ? S ・
i / r’+ On )/ :呂un−−−素基質
を各ウェルに加え、30分間インキュベートした。陽性
着色反応を分光光度計により読み取った。顕微鏡による
方法では、リンパ球を0.1%ゼラチンを含む燐酸緩衝
食塩水に懸濁し、1時間4℃でモノクローナル抗体3D
8とインキュベートした。次いで細胞を2回洗浄し、次
に4℃で1時間アルカリホスファターゼコンツユゲート
やぎ抗マウスIgG/rgMと混合した。洗浄後、細胞
を基質B(、IPと混合した。顕微鏡で観察すると、1
(TLV−1[[陽性細胞は明るい青色ないし暗い青色
に染色した。結果を第5表に示す。
計による方法の場合、抹消血液のリンパ球を密度勾配遠
心分離により単離し、IzC当たり2×106個の細胞
濃度で2ミリモルのし一グルタミンおよび20%うし胎
児血清を含むRPMII640(標準的組織培養培地)
に@澗した。この細胞懸濁液50μジを96ウエルマイ
クロタイタープレートの平底ウェルに加え、約3時間イ
ンキュベートした。細胞被覆ウェルを洗浄後、抗HTL
V−[モノクローナル抗体3D8をウェルに加え、1時
間インキュベートした。洗浄後、くえん酸緩i; +
+I、L −7−−l、’/ ブ? S ・
i / r’+ On )/ :呂un−−−素基質
を各ウェルに加え、30分間インキュベートした。陽性
着色反応を分光光度計により読み取った。顕微鏡による
方法では、リンパ球を0.1%ゼラチンを含む燐酸緩衝
食塩水に懸濁し、1時間4℃でモノクローナル抗体3D
8とインキュベートした。次いで細胞を2回洗浄し、次
に4℃で1時間アルカリホスファターゼコンツユゲート
やぎ抗マウスIgG/rgMと混合した。洗浄後、細胞
を基質B(、IPと混合した。顕微鏡で観察すると、1
(TLV−1[[陽性細胞は明るい青色ないし暗い青色
に染色した。結果を第5表に示す。
実施例6
フローサイトメトリーによるリンパ球上のHTLV−I
II発現の検出。
II発現の検出。
HT L V −I[1はT4リンパ球を攻撃し、これ
らの細胞中に増殖する。クローン3D8および3G12
を用いたフローサイトメトリーによりT4細胞上におけ
るt−r T L V −[抗原の発現を検出した。
らの細胞中に増殖する。クローン3D8および3G12
を用いたフローサイトメトリーによりT4細胞上におけ
るt−r T L V −[抗原の発現を検出した。
この試験における試料はら盲検用としてオレゴンエイズ
タスクフォースにより提供された。実施された測定は、
セルライン’r、、T、T、BおよH8 びNKから成るモノクローナル抗体パネル、ウェスタン
プロット分析、T /T比および上記3種S の抗HTLV−IIIモノクローナル抗体に対するT
およびT4カテゴリーにおける陽性細胞の%an を含むものであった。患者群には、明白なAIDS、A
RC,P(1,Lおよびウェスタンプロットでは陽性で
あるが症状は認められない者が含まれた。
タスクフォースにより提供された。実施された測定は、
セルライン’r、、T、T、BおよH8 びNKから成るモノクローナル抗体パネル、ウェスタン
プロット分析、T /T比および上記3種S の抗HTLV−IIIモノクローナル抗体に対するT
およびT4カテゴリーにおける陽性細胞の%an を含むものであった。患者群には、明白なAIDS、A
RC,P(1,Lおよびウェスタンプロットでは陽性で
あるが症状は認められない者が含まれた。
対照には、危険度の高い群および性別および年令のマツ
チした危険度の低い者が含まれた。82名の患者を評価
した。データを第6表に示す。試料のうち46個は、H
TLV−III抗体ウェスタンプロット分析で陽性を示
した患者から採取したものであった。
チした危険度の低い者が含まれた。82名の患者を評価
した。データを第6表に示す。試料のうち46個は、H
TLV−III抗体ウェスタンプロット分析で陽性を示
した患者から採取したものであった。
モノクローナル抗体3D8および3G12は、V−[[
1抗体の発現を検出した。病気の重さおよび陽性細胞数
の間には一般的な相関関係が存在する。
1抗体の発現を検出した。病気の重さおよび陽性細胞数
の間には一般的な相関関係が存在する。
患者群における最低値はま、だ症状の認められない者で
あった。応答範囲は、3D8または3G12によりT4
細胞のパーセンテージとして5%−55%陽性の範囲で
変化した。比較すると危険度の高い対照は0−5%の範
囲であった。対照のうち1名は7.5%の値を示した。
あった。応答範囲は、3D8または3G12によりT4
細胞のパーセンテージとして5%−55%陽性の範囲で
変化した。比較すると危険度の高い対照は0−5%の範
囲であった。対照のうち1名は7.5%の値を示した。
興味深いことに、この患者の場合この時点ではウェスタ
ンプロット分析で陰性を示したが、T Hz T S比
は逆転していた。3G12の方が、基底レベルが高く、
またHTLV−I11tiu原発現細胞パーセンテージ
も高かった(第6表参照)。
ンプロット分析で陰性を示したが、T Hz T S比
は逆転していた。3G12の方が、基底レベルが高く、
またHTLV−I11tiu原発現細胞パーセンテージ
も高かった(第6表参照)。
これらのデータは、患者がまだ症状を示していない幾つ
かの場合でもウェスタンプロット陽性患者のT細胞上の
HTLV−[抗原発現が効果的に検出され薄ることを示
す。またこれは危険度の高い群において抗体形成面にウ
ィルスの発現を検出する手段でもあり得る。この試験に
おけるさらに別の対照群には、ヘルペス!および2、C
MVおよび肝炎患者が含まれていた。これらのウィルス
対照群の患者は上記モノクローナル抗体により検出され
た抗原を発現しなかった。
かの場合でもウェスタンプロット陽性患者のT細胞上の
HTLV−[抗原発現が効果的に検出され薄ることを示
す。またこれは危険度の高い群において抗体形成面にウ
ィルスの発現を検出する手段でもあり得る。この試験に
おけるさらに別の対照群には、ヘルペス!および2、C
MVおよび肝炎患者が含まれていた。これらのウィルス
対照群の患者は上記モノクローナル抗体により検出され
た抗原を発現しなかった。
実施例7
フローサイトメトリーを用いるH9細胞上のHTLV−
111抗原発現の検出。
111抗原発現の検出。
一般にH9セルラインは培養によるHTLV−■抗原を
検出し、続いて細胞における逆転写酵素の生成を測定す
るのに用いる。モノクローナル3D8、IF5および3
G+2が実際に患者のT4細胞上のHTLV−I[1抗
原を検出していたことを証明するために、H9細胞を用
いて次の対照実験を実施した。H9細胞を、細胞不含有
HTLV−■懸濁液または)(TLV−iI[抗原を発
現しているT4リンパ球を含む2種のウィルス含有調製
物と培養した。培養の48時間後H9細胞を本発明のモ
ノクローナル抗体および対照抗体により測定した、第7
表かられかるように、クローン3D8、IF5および3
G12は、H9細胞が感染したときのみH9細胞上のH
TLV−I[1抗原発現を検出した。細胞不含有I−I
T L V −IIIウィルスまたはHTLV−[陽
性T4細胞による感染は、同様に有効であっrこ。アイ
ソタイプ対照モノクローナル抗体は変化を示さなかった
。
検出し、続いて細胞における逆転写酵素の生成を測定す
るのに用いる。モノクローナル3D8、IF5および3
G+2が実際に患者のT4細胞上のHTLV−I[1抗
原を検出していたことを証明するために、H9細胞を用
いて次の対照実験を実施した。H9細胞を、細胞不含有
HTLV−■懸濁液または)(TLV−iI[抗原を発
現しているT4リンパ球を含む2種のウィルス含有調製
物と培養した。培養の48時間後H9細胞を本発明のモ
ノクローナル抗体および対照抗体により測定した、第7
表かられかるように、クローン3D8、IF5および3
G12は、H9細胞が感染したときのみH9細胞上のH
TLV−I[1抗原発現を検出した。細胞不含有I−I
T L V −IIIウィルスまたはHTLV−[陽
性T4細胞による感染は、同様に有効であっrこ。アイ
ソタイプ対照モノクローナル抗体は変化を示さなかった
。
第1表
市販のスクリーニングキットにおけるHTLV−111
抗原の検出 3F7 10−’ 2.O*
2.01G−’ 1.102 1
.430to−’ 0.43 0.6
203D8 IG−’ 2.0
2.01G−’ 1.712
1.430to−’ 1.252
0.8213012 10−11.1162
2.010−’ 0,721
0.921110−’ 0.210
0.2862All 10″G、641
0.58910−0.112 0.126 10−’ 0.05 G、0612
2 10−’ (1,7810,6
8210−’ 0.112 0.15
3to−’ 0,05 0.05*E
LISA吸収(吸収単位で) 第2表 抗1−I T L V −III f−ツクローナル抗
体によるHTLV−■被覆ビーズのフローサイトメトリ
ー測定3G8 603D8
822A11
773F7 75
1E2 80a) 抗β−hCG 0.8b) RPMI 1640 0.8a)β−ひ
とじゅう毛膜生殖腺刺激ホルモンの抗体b)標準的組織
培養培地 第3表 ラテックスピーズを用いたモノクローナルIgM抗体捕
獲−モツクローナルIgG抗体検出による血清中のHT
LV−III抗原の検出 −−−一一響一喝−−鴫−−−−轡−―−+響−イト
a) 3D8 3012 NHS O,6a
)細胞培養からのウィルス感染細胞の製造、細胞を採取
し、遠心分離にかけ、デタージェントで溶解。
抗原の検出 3F7 10−’ 2.O*
2.01G−’ 1.102 1
.430to−’ 0.43 0.6
203D8 IG−’ 2.0
2.01G−’ 1.712
1.430to−’ 1.252
0.8213012 10−11.1162
2.010−’ 0,721
0.921110−’ 0.210
0.2862All 10″G、641
0.58910−0.112 0.126 10−’ 0.05 G、0612
2 10−’ (1,7810,6
8210−’ 0.112 0.15
3to−’ 0,05 0.05*E
LISA吸収(吸収単位で) 第2表 抗1−I T L V −III f−ツクローナル抗
体によるHTLV−■被覆ビーズのフローサイトメトリ
ー測定3G8 603D8
822A11
773F7 75
1E2 80a) 抗β−hCG 0.8b) RPMI 1640 0.8a)β−ひ
とじゅう毛膜生殖腺刺激ホルモンの抗体b)標準的組織
培養培地 第3表 ラテックスピーズを用いたモノクローナルIgM抗体捕
獲−モツクローナルIgG抗体検出による血清中のHT
LV−III抗原の検出 −−−一一響一喝−−鴫−−−−轡−―−+響−イト
a) 3D8 3012 NHS O,6a
)細胞培養からのウィルス感染細胞の製造、細胞を採取
し、遠心分離にかけ、デタージェントで溶解。
b)エイズと診断された患者の血清。
第4表
ドツトプロット技術を用いたモノクローナル抗体3D8
によるHTLV−I[1の検出 試験された全試料−14 試料の分類 ドツトプロット陽性数エイ
ズと診断 2/4ウエスタンプロツト
陽性 315ウエスタンプロツト陰性 0
15第5表 モノクローナル抗体3D8を用いた顕微鏡全細胞ELI
SA法によるHTLV−I[[(7)検出エイズ
19.0エイズ
l095ウエスタンプロツト陽性
4.4ウエスタンプロツト陽性 23ウエ
スタンプロツト陽性 6.8ウエスタンプロツ
ト陽性 0.4ウエスタンプロツト陽性
0.6第6表 フローサイトメトリーによるT4リンパ球上のHTLV
−IIII発現の検出 )゛αラフト+/−) − 3D8/T4 XfSE 1.4±0.3* 9.O
f4.2 25±7 7.:J土1.4
5.8±1.1統計値 p< 0.QOO
l 0.000I Q、000+ 0.QO
Olpb< 0.05 0.05 pb< 0.05 3012/T4 X±SE 8.4±2.8 2111
t6.l 44±10.1 29t4.2
24t4.ll統計値 p< 0.00
01 0.0001 0.000+ Q、000
1p< IS O,06 pbく N5 a)マン−ホウ(ブトニーU試験 b)フィッシャー精密値 c)Asym−無症状の患者、すなわち、エイズ抗体に
関して陽性血清であったが、ARCまたはPGL患者に
みられるリンパ節肥大のような明白な症状またはエイズ
患者にみられる感染疾患が認められない者。
によるHTLV−I[1の検出 試験された全試料−14 試料の分類 ドツトプロット陽性数エイ
ズと診断 2/4ウエスタンプロツト
陽性 315ウエスタンプロツト陰性 0
15第5表 モノクローナル抗体3D8を用いた顕微鏡全細胞ELI
SA法によるHTLV−I[[(7)検出エイズ
19.0エイズ
l095ウエスタンプロツト陽性
4.4ウエスタンプロツト陽性 23ウエ
スタンプロツト陽性 6.8ウエスタンプロツ
ト陽性 0.4ウエスタンプロツト陽性
0.6第6表 フローサイトメトリーによるT4リンパ球上のHTLV
−IIII発現の検出 )゛αラフト+/−) − 3D8/T4 XfSE 1.4±0.3* 9.O
f4.2 25±7 7.:J土1.4
5.8±1.1統計値 p< 0.QOO
l 0.000I Q、000+ 0.QO
Olpb< 0.05 0.05 pb< 0.05 3012/T4 X±SE 8.4±2.8 2111
t6.l 44±10.1 29t4.2
24t4.ll統計値 p< 0.00
01 0.0001 0.000+ Q、000
1p< IS O,06 pbく N5 a)マン−ホウ(ブトニーU試験 b)フィッシャー精密値 c)Asym−無症状の患者、すなわち、エイズ抗体に
関して陽性血清であったが、ARCまたはPGL患者に
みられるリンパ節肥大のような明白な症状またはエイズ
患者にみられる感染疾患が認められない者。
*T、リンパ球上の3D8および3G12モノクロ一ナ
ル抗体のパーセンテージとしてフローサイトメトリーに
より検出された陽性細胞の数。
ル抗体のパーセンテージとしてフローサイトメトリーに
より検出された陽性細胞の数。
第7表
H9細胞上のHTLV−III発現の検出t/りo−f
ル抗体 無 細胞不含有1(ルス感染 HTLV−11
1感染十T4細胞第2 抗体対照 6.2* 6.4
3.13D8 7.5 +8.
5 29.71E2 14.9
40.8 41.93012
32.2 82.8
94.0抗−11cG対照 3.4 5.6
4.6*フローサイトメトリーによ
る細胞陽性パーセント。
ル抗体 無 細胞不含有1(ルス感染 HTLV−11
1感染十T4細胞第2 抗体対照 6.2* 6.4
3.13D8 7.5 +8.
5 29.71E2 14.9
40.8 41.93012
32.2 82.8
94.0抗−11cG対照 3.4 5.6
4.6*フローサイトメトリーによ
る細胞陽性パーセント。
ハイブリッド連続セルラインIE2.3D8および3G
12は、1986年5月19日イ寸でブダペスト条約に
基づいて、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン(ATCC)、1230+。
12は、1986年5月19日イ寸でブダペスト条約に
基づいて、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン(ATCC)、1230+。
パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド2
0852に寄託され、それぞれHB9100、HE11
.O+およびHB9102のATCC受託番号が与えら
れた。ハイブリッド連続セルライン3G8およびIcI
Iは、1986年5月28日付でブダペスト条約に基づ
いてATCCに寄託され、それぞれ1(B9114およ
びHB9115のATCC受託番号が与えられた。
0852に寄託され、それぞれHB9100、HE11
.O+およびHB9102のATCC受託番号が与えら
れた。ハイブリッド連続セルライン3G8およびIcI
Iは、1986年5月28日付でブダペスト条約に基づ
いてATCCに寄託され、それぞれ1(B9114およ
びHB9115のATCC受託番号が与えられた。
特に上記具体例に基づいて、この発明の詳細な記載を行
った。しかしながら、変形および修正がこの発明の主旨
および範囲内で実施され得るものと当然理解されよう。
った。しかしながら、変形および修正がこの発明の主旨
および範囲内で実施され得るものと当然理解されよう。
Claims (19)
- (1)媒質中におけるHTLV−III感染細胞の存在の
検出方法であって、媒質を感染の結果生成された抗原に
対するモノクローナル抗体と接触させ、そして前記抗体
と前記抗原の結合を検出する(ただし前記抗原がウイル
ス遺伝子生成物である場合は前記抗体と前記感染細胞の
結合を検出する)ことからなる方法。 - (2)前記媒質が好ましくは全血、リンパ液、血清、血
漿、精液、唾液および脳脊髄液から成る群から選ばれる
ひとの体液であるか、または前記媒質が培養培地である
、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (3)抗原がウイルス遺伝子生成物であるかまたはウイ
ルス遺伝子生成物に結合している、特許請求の範囲第1
項記載の方法。 - (4)抗原が感染の結果生成されたものであって、ウイ
ルス遺伝子生成物ではない、特許請求の範囲第1項記載
の方法。 - (5)抗原がリンパ球(好ましくはリンパ球はヘルパー
T細胞である)またはマクロファージに結合している、
特許請求の範囲第4項記載の方法。 - (6)抗原が、それぞれ約24、28、39、41、5
5、65、49および52キロダルトンの分子としての
特徴を有する抗原の群から選ばれる、特許請求の範囲第
1項記載の方法。 - (7)抗体が、3D8、3F7、3G12、2A11、
4G2、1E2、3G8および1C11の特性を有する
ハイブリッド連続セルラインの群から選ばれたハイブリ
ッド連続セルラインから得られる、特許請求の範囲第1
項記載の方法。 - (8)抗体が標識とコンジュゲートされた、特許請求の
範囲第1項記載の方法。 - (9)宿主におけるエイズウイルス関連感染検出免疫測
定方法であって、 宿主から採取した体液を、感染が存在するときのみ存在
する抗原と結合するモノクローナル抗体と合わせ、そし
て 前記抗原および前記モノクローナル抗体から成る免疫複
合体(ただし、抗原がウイルス遺伝子生成物である場合
はこの免疫複合体はモノクローナル抗体および感染細胞
上の抗原から成るものとする)の存在に関して上記混合
物を検査する ことから成る方法。 - (10)モノクローナル抗体が溶性抗原と結合する、特
許請求の範囲第9項記載の方法。 - (11)エイズウイルス関連感染がAIDS、ARC、
PGLおよびLADから成る群から選ばれる、特許請求
の範囲第9項記載の方法。 - (12)ひとHTLV−III感染の結果生成された抗原
に結合し得る抗体であって、前記抗原が溶性血清抗原ま
たはリンパ球に結合した抗原である(ただし、抗原が可
溶性である場合この抗原はウイルス遺伝子生成物ではな
いものとする)、抗体。 - (13)好ましくはモノクローナル抗体が3D8、1E
2または3G12の特性を有するハイブリッド連続セル
ラインから得られるモノクローナルである、特許請求の
範囲第12項記載の抗体。 - (14)好ましくは酵素、放射性同位元素、粒子、支持
体、色素原、化学発光剤、蛍光剤、補酵素、遊離基およ
びバクテリオファージから成る群から選ばれたものであ
る、標識とコンジュゲートした、特許請求の範囲第13
項記載のモノクローナル抗体。 - (15)抗原がHTLV−IIIウイルス遺伝子生成物で
あるかまたはこれと結合している、特許請求の範囲第1
3項記載のモノクローナル抗体。 - (16)エイズウイルス病原体による感染の結果生成さ
れた抗原に結合し得るモノクローナル抗体または前記抗
体の標識された誘導体を組み合わせてパッケージにした
診断用キットであって、前記抗原がウイルス遺伝子生成
物と結合しているかまたは感染の結果リンパ球に結合し
ているキット。 - (17)(a)HTLV−III遺伝子生成物誘導体と結
合するモノクローナル抗体および (b)前記遺伝子生成物誘導体 から成る複合体を含む組成物。 - (18)(a)HTLV−III遺伝子生成物以外でHT
LV−III感染の結果生成された細胞結合抗原に結合し
得るモノクローナル抗体および (b)前記抗原 から成る複合体を含む組成物。 - (19)3D8、3F7、3G12、2A11、4G2
、1E2、3G8または1C11の特性を有するハイブ
リッド連続セルラインから得られたモノクローナル抗体
の特性をもっているモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/860,169 US4917998A (en) | 1986-05-06 | 1986-05-06 | Method of detecting AIDS virus infection |
US860169 | 1986-05-06 | ||
US877609 | 1986-06-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62278459A true JPS62278459A (ja) | 1987-12-03 |
Family
ID=25332648
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62109628A Pending JPS62278459A (ja) | 1986-05-06 | 1987-05-05 | エイズウイルス感染の検出方法 |
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JPH03501524A (ja) * | 1988-03-15 | 1991-04-04 | アメリカ合衆国 | ヒト免疫不全症ウイルスの検定 |
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